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Stabilit termodinamica delle

strutture biologiche
Classificazione delle proteine
Proteine globulari
Proteine fibrose
Glicoproteine

Funzione biologica:
Enzimi
Proteine di trasporto
Anticorpi
Recettori
Oligo peptidi

Proteine fibrose
Enzimi
Le proteine possono essere classificate come cristalli
singoli ANISOTROPI

Forze dinterazione:

1. Van der Walls
2. Ione ione
3. Ione dipolo
4. Dipolo dipolo
5. Legami a idrogeno
6. Forze dinetrazione idrofobica
Teoria delle catastrofi
Transizioni del 1 ordine
Teoria del caos
Analisi stocastica di eventi tutto o nulla

Transizioni ordine-disordine in
biopolimeri
Transizione o elica-gomitolo statistico in
polipeptidi.

E necessario distinguere due casi:

Polimeri a basso peso molecolare (< 3000 Da)
Polimeri ad alto peso molecolare (> 10000 Da)
Consideriamo lequilibrio:




-elica gomitolo statistico o
Definizione di transizione cooperativa:

Transizioni cooperative -
sono caratterizzate dal fatto che gi prima della
transizione di fase sono presenti domini della nuova
fase, che facilitano il processo di transizione.
Stato disordinato
c
Transizione ordine-disordine
Transizione I ordine
Stato ordinato
h T
tr
Nei Polipeptidi le
fasi sono due:
c random coil
h elica ( elica)
T
m
= temperatura di transizione (m = melting, fusione)
| |
| | | | c h
h
f
h
+
=
Frazione di -elica:
A T = T
m
: f
h
= f
c
= 0.5
Possono essere indotte da:
1. Temperatura
2. pH
3. Forza ionica
4. Solventi organici

Landamento sigmoidale tipico di una transizione cooperativa.
La pendenza della curva a T=T
m
una misura della cooperativit
della transizione.
Transizione del I ordine
Se il valore della grandezza macroscopica

oss
=
h
f
h +

c
f
c
dove: f
h
+ f
c
=1

f
h
=

Transizione coil-elica della poli(L-lisina) in
funzione del pH
Il pH di transizione (10.1) segue da vicino il pH di
deprotonazione dei gruppi amminici (pKa=10.2):
NH
3
+
NH
2
+ H
+
pH<10.2: il gruppo amminico laterale protonato e la struttura elicoidale
destabilizzata dalle interazioni repulsive elettrostatiche tra le catene
laterali. Lo stato di 'random coil' invece stabilizzato da una solvatazione
ottimale delle cariche elettrostatiche grazie alla maggiore libert
conformazionale del polipeptide.

pH>10.2: predomina la forma deprotonata del gruppo amminico e le
interazioni di legame idrogeno intramolecolare rendono pi stabile la
conformazione ordinata.

Nel caso del poli(L-glutammico):
COO
-
+ H
+
COOH
A pH acidi predomina la forma protonata e il polipeptide assume una
struttura secondaria ordinata elicoidale, mentre a pH>4.5 predomina la
forma deprotonata carica negativamente
Transizione coil-elica del
poli(L-glutammato) di
sodio in funzione della
percentuale di alcool
isopropilico in miscele
acqua/alcool.
I step: Nucleazione
Formazione del primo legame idrogeno ii+4
Richiede limmobilizzazione di 6 angoli torsionali:
(=-47; =-57)
II step: Propagazione


Formazione di un secondo legame idrogeno adiacente ad uno
gi formato.
Richiede limmobilizzazione di soli 2 angoli torsionali
dipolo solv HB trans
H H H H A A A A + + =
Formazione di legame idrogeno
Entalpia di solvatazione
Interazione tra dipoli ammidici
1
[ ( )] 1
trans
H poli L glutammico kcal mol

A ~ T=298K
| |
| | | | M D
D
+
=
2
2
o
1
5

~ mol kcal H
HB
A
Competizione nella formazione di legame idrogeno:
CCl
4
< diossano < H
2
O


AH
solv
= differenza di solvatazione tra il peptide in
elica e il peptide in coil.


Un contributo generalmente sfavorevole alla
transizione in elica (+2-3 kcalmol
-1
). Il coil infatti
libero di riaggiustarsi in modo da ottimizzare la
solvatazione della sequenza peptidica
(rigonfiamento).
coda) - (testa 2
1
~ mol kcal H
dipolo
A
( )
2 1
3
12 0
2 1
12
3
4
u u |
tc

cos cos cos
R
V =
u u u
|
= =
=
2 1
0
0
0
2 1
= = =
=
u u u
|
( )
2 1
3
12 0
2 1
12
3
4
u u |
tc

cos cos cos
R
V =
2

2 1
t
u u
t |
= =
=
t u u
t |
= =
=
2 1
0

;
( )
2 1
3
12 0
2 1
12
3
4
u u |
tc

cos cos cos
R
V =
2
0
2 1
t
u u
|
= =
=
2
0

2
2 1
t
u u
t
|
= =
=
;
0
12
= V
( )
2 1
3
12 0
2 1
12
3
4
u u |
tc

cos cos cos
R
V =
La valutazione dei contributi entropici del processo
richiede una descrizione approfondita dei processi di
solvatazione.

Il contributo entropico alla transizione elicacoil
generalmente favorevole ed aumenta allaumentare
della temperatura:
0 S -
T
G
c h
c h p,
< A =
|
.
|

\
|
c
c

Un modello a cooperativit infinita: le catene


polipeptidiche possono esistere o in una
configurazione tutta elica o in una configurazione tutto
coil.
f
h
=0.5 significa che il 50% delle catene in elica e il 50% in
coil.
' S T ' H ' G A A A =
Lenergia libera standard per la conversione di un singolo
residuo da coil ad elica :
Un processo favorito entalpicamente, ma sfavorito dal
punto di vista entropico.
' S T ) n ( ' H ) n ( ' G A A A 2 4 =
Nella formazione di un -elica 4 residui non possono formare
legame idrogeno e i due terminali restano comunque liberi di
ruotare:
La variazione di energia libera dellintero processo sar:
h h h h h
f ln RT ) f , T , ( ) f , T , ( + = = 1 1 1
0

Scriviamo il potenziale chimico dei due stati:

c c c c c
f ln RT ) f , T , ( ) f , T , ( + = = 1 1 1
0

h
h
c h trans
f
f
ln RT

+ = =
1
0
A A
Allequilibrio:
c h trans
A = = 0
eq
eq
h
h
eq
h
h
K
f
f
dove
f
f
RT =
|
|
.
|

\
|

|
|
.
|

\
|

= A
1
:
1
ln
0

Per T=T
m
: f
h
=f
c
= 0.5
0 1
0
= = A K
' S T ) n ( ' H ) n (
m
A A 2 4 =
' S ) n (
' H ) n (
T
m
A
A
2
4

=
Dallequazione di vant Hoff:

2
4
m T T
RT
' H ) n (
dT
K ln d
m
A
=
|
.
|

\
|
=
Poich:
eq
h
h
f
f
ln K ln
|
|
.
|

\
|

=
1
( )
ln
ln ln 1
m
m
h h
T T
T T
d K d
f f
dT dT
=
=
| |
= = (
|

\ .
=
|
.
|

\
|

+
|
.
|

\
|
=
= =
m m
T T
h
h T T
h
h
dT
df
f dT
df
f 1
1 1
m m
T T
h
h h T T
h
dT
df
f f dT
df
= =
|
.
|

\
|
=
|
|
.
|

\
|

+
|
.
|

\
|
= 4
1
1 1
' H ) n ( R
' S ) n (
RT
' H ) n (
dT
df
m T T
h
m
A
A A
4 4
2
4
4
2 2
2

=
|
.
|

\
|
=
= misura della cooperativit della transizione
a) Modello per polipeptidi a basso peso molecolare
Sono possibili solo configurazioni del tipo:

cccccchhhhhhccccc o hhhhhhhcccccc

Vi pu essere cio una sola regione di nucleazione
per catena. Si trascurano effetti terminali di catena.
Nel modello non vengono considerati i residui terminali,
strutturalmente incapaci di dar luogo alla formazione di
legami idrogeno.

Nel modello si identificano due contributi energetici:

I . Entropia di nucleazione: congelamento dei primi 4
angoli torsionali.


I I . Propagazione: formazione di un legame idrogeno
adiacente ad un residuo gi in elica
ccchcccc .ccchhcc.
nucl
S A
' S T ' H ' G A A A =
I step: Nucleazione - formazione del primo legame
idrogeno in una sequenza altrimenti in coil

cccccccc .ccchccc.
Consta di due contributi:

1. <entropia di nucleazione> +
2. <energia libera di propagazione>



Il contributo dominante quello entropico, il contributo
entalpico pu essere trascurato.

nucl nucl
S T G A A ~
' G G ) I ( G
nucl
A A A + =
Per unelica perfetta:
1 =
h
e
Per il gomitolo statistico si assume, applicando
lapprossimazione degli isomeri rotazionali, che vi
siano 3 stati popolati per ogni angolo torsionale
(t, g
+
,g
-
):
3 =
c
e
|
|
.
|

\
|
=
c
h
nucl
ln R S
e
e
A
Dalla definizione statistica di entropia:
Moltiplicando per i 4 angoli torsionali bloccati
durante il processo di nucleazione:
1
7 8 4

=
|
|
.
|

\
|
= mol cal . ln R S
c
h
nucl
e
e
A
A 25C:
1
6 2

= ~ mol kcal . S T G
nucl nucl
A A
1
18 2
3
1

=
|
.
|

\
|
= mol cal . ln R S
nucl
A
2
10

~
|
.
|

\
|
=
|
.
|

\
|
=
R
S
exp
RT
G
exp
nucl nucl
A A
o
0 G 1
nucl
= = A o
Transizione non cooperativa!
Per:
A T=300K: =2.5 kcalmol
-1
o ~ 0.001
Quanto minore , tanto pi grande
lenergia libera di nucleazione, tanto pi
cooperativa la transizione.
Dalla definizione di o:


AS
nucl
= S
h
S
c
= RT lno

S
h
=0 (w
h
=1) S
c
= - RT ln o

Tanto minore il valore di o, tanto maggiore sar lentropia del
coil statistico, legata al numero di conformazioni accessibili al
sistema, cio al numero di isomeri rotazionali popolati.

Nella serie glicina (R=H), alanina (R=CH
3
), leucina (R=CH
2
-
CH(CH
3
)
2
), il valore di o segue laumento dellingombro sterico
della catena laterale (0.00001, 0.0008, 0.0033), proprio perch
diminuisce il numero di disposizioni geometriche accessibili ad
ogni angolo torsionale.


=
ccchhhcccc
ccchhhhccc
s
' S T ' H ' G A A A =
Assume il significato di una vera e propria costante di
equilibrio relativa al processo di propagazione
delleelica.
|
.
|

\
|
=
RT
' G
exp s
A
AG
prop
= - RT lns

Nel caso dei residui glicina, alanina e leucina
(s=0.60,1.06,1.14 rispettivamente) al crescere delle
dimensioni della catena laterale, aumentano le interazioni
attrattive di Van der Waals.

Gruppi polari determinano linstaurarsi di interazioni
dipolari con il backbone peptidico, di cui bisogna valutare
caso per caso lentit sia rispetto al peptide in
conformazione elicoidale, sia come gomitolo statistico.
Nel caso dellAsparagina (Asn, R=-CH
2
-CONH
2
),
linterazione della catena con il dipolo ammidico tende a
destabilizzare lelica.


Il parametro s formalmente assimilabile
ad una costante di equilibrio:

2
prop
RT
H

dT
lns d
A
=
Per la formazione del primo legame idrogeno:
' G G ) I ( G
nucl
A A A + =
|
.
|

\
|
+
=
RT
' G G
exp s
nucl
A A
o
Per la formazione del secondo legame idrogeno:
' G ) II ( G A A =
|
.
|

\
|
=
RT
' G
exp s
A
Per due residui adiacenti impegnati in legame idrogeno:
' G G G
nucl
A A A 2 + =
|
.
|

\
|
+
=
RT
' G G
exp s
nucl
A A
o
2
2
Per tre residui adiacenti impegnati in legame idrogeno:
' G G G
nucl
A A A 3 + =
|
.
|

\
|
+
=
RT
' G G
exp s
nucl
A A
o
3
3
|
.
|

\
|
+
=
RT
' G m G
exp s
nucl
m
A A
o
Per m residui adiacenti impegnati in legame idrogeno:
Da cui si ottiene per la transizione in cui m residui passano da coil ad elica:
AG
trans
= AG
nucl
+ m AG
prop
= - RT( ln o + m ln s)
Dalla trattazione statistica dei vari modelli:
( )
s e
RT
E E
c
h
c h
= =

e
e
c h
h
h
s
s
f
e e
e
+
=
+
=
1
n
c
n
h
n
h
n
n
h
s
s
f
e e
e
+
=
+
=
1
n = numero dei residui
( ) ( )
|
|
|
|
|
.
|

\
|
(

+ +

+
+ + +

=
+
+ +
s n n s
) s (
s
n
n s ) n ( s ) n ( ns
) s (
s
f
n
n n
h
1
1
1
2 2
1
1
2
1 2
3
o
o
0
0
=

h
s
f lim
1 =

h
s
f lim
b) Modello per polipeptidi ad alto peso molecolare
In questo caso bisogna introdurre la possibilit di avere pi centri di
nucleazione.
|
.
|

\
|
+
=
RT
' G m G j
exp s
nucl
m j
A A
o
Per j centri di nucleazione e m residui adiacenti impegnati in legame
idrogeno:

Lequilibrio tra sequenze lunghe e corte in realt il bilancio tra la tendenza a
minimizzare lenergia e quella simultanea a massimizzare lentropia.

Per catene molto lunghe la tendenza, entalpicamente favorita, di formare
lunghe sequenze ordinate controbilanciata dalla perdita di entropia
complessiva.

Come risultato nella catena vi saranno piu centri di nucleazione con sequenze
di eliche relativamente lunghe separate da regioni in coil (per esempio |-turns
in un filamento polipeptidico di una proteina globulare).
( ) | |
2
1

4 1 2
1
2
1
2
s s
s
f
h
o +

+ =
Il risultato per 0.8 < s < 1.2 :
Per s=1:
2
1
=
h
f
Per s<1:
2
1
<
h
f
Per s>1:
2
1
>
h
f
per o=110
-4
s=0.8: f
h
=0.002 s=1.2: f
h
=0.997

per o=110
-2
s=0.8: f
h
=0.127 s=1.2: f
h
=0.837
1 s
s
]
s 1
1 - s
1 [
2
1

] s) 2[(1
1 - s

2
1

s] 4 s) - 2[(1
1 - s

2
1
f
1/2 2 1/2 2
h
+
=
+
+ =
+
+ =
+
+ ~
K
f
f

f - 1
f
s
c
h
h
h
= = =
Per o=1 (AG
nucl
=0):

In questo caso si ha completa assenza di cooperativit, tutti i residui
si comportano in maniera indipendente e s coincide con la costante di
equilibrio della transizione.
Da cui si ottiene:
La cooperativit della transizione dipende da (pi piccolo ,
maggiore lenergia libera di nucleazione, maggiore la cooperativit
della transizione).
Infatti:
( )
=
(
(

+

=
|
.
|

\
|
= s s
s
ds
d
ds
df
m
T T
h
o 4 1 2
1
2
( )
( ) | |
2
3
2
2
4 1 2
1
4 1 2
1
s s
s
s s
o
o
+

+
=
A T=T
m
, f
h
=0.5, s=1:
o 4
1
1
=
|
.
|

\
|
= = s , T T
h
m
ds
df
Per 0:

|
.
|

\
|
= = 1 s , T T
h
m
ds
df
Per 1:
0 G
4
1
nucl
1
=
|
.
|

\
|
= =
A
s , T T
h
m
ds
df
Transizione coil-elica per diversi valori di
Ammino
acido
Gruppo
laterale
o AS
nucl
(u.e.) s AG(kcalmol
-1
)
Glicina -H 0.0000
1
-23.0 0.60 0.30
Alanina -CH
3
0.0008 -14.3 1.06 -0.03
Leucina -CH
2
-
CH(CH
3
)
2

0.0033 -11.4 1.14 -0.08
Serina -CH
2
-OH 0.0001 -18.3 0.76 0.16
Glutammi
co
-CH
2
-CH
2
-
COOH
0.0100 -9.1 1.32 -0.17
n=1500
n=46
n=26
Poli(-benzil-L-glutammato) in dicloroacetico/dicloroetilene (80/20,
v/v)
=210
-4
la cooperativit della transizione aumenta con n;

la formazione dellelica favorita da un aumento di temperatura
Il tutto dovuto alla competizione tra la formazione di legame
idrogeno intramolecolecolare e la solvatazione della catena peptidica
da parte delle molecole di acido dicloroacetico con formazione di
legame idrogeno intermolecolare tra solvente e gruppi ammidici della
catena peptidica.

Il processo sostanzialmente guidato dal termine entropico che
aumenta allaumentare della temperatura a causa della desolvatazione
dei gruppi ammidici e la liberazione in soluzione delle molecole di
solvente.
Questo contributo sovrasta la variazione negativa di entropia dovuta
alla strutturazione della catena peptidica.
Nel computo globale dei processi in gioco:
0
0
> H A 0
0
> S A
0
0
0
< =
c
c
S
T
G
A
A
Un processo guidato dallentropia|
Per T=T
m
, il numero massimo di regioni eleicoidali nella catena pari
a:
2
o n
j
max
~
2
n
m =
o
1
=
j
m
Il rapporto <m>/<j> rappresenta la lunghezza media di una
sequenza elicoidale:
Notare come questa grandezza sia indipendente dal numero dei
residui.
Per n=10
3
(polipeptide a basso peso molecolare):
=110
-4
: <j
max
>=5 <m>/<j>=100
=110
-2
: <j
max
>=50 <m>/<j>=10
Per n=10
5
(polipeptide ad alto peso molecolare):
=110
-4
: <j
max
>=500 <m>/<j>=100
=110
-2
: <j
max
>=5000 <m>/<j>=10