ESTRAZIONE DNA PLASMIDICO

Plasmidi
• I plasmidi sono piccoli
filamenti circolari di DNA
superavvolto a doppia elica,
presenti nel citoplasma e
distinguibili dal cromosoma
batterico per le loro
dimensioni ridotte. Il
materiale genetico che li
contraddistingue permette
all'organismo ospite di
svolgere varie funzioni non
essenziali. I plasmidi sono
capaci di spostarsi tra le
cellule influendo sulla
variabilità genetica.
Plasmids: vehicles of recombinant DNA
Bacterial cell

Non-chromosomal DNA
Replication: independent of the chromosome
Many copies per cell
Easy to isolate
Easy to manipulate
Batteri e Plasmidi batterici
 Cosa sono i plasmidi
• Con il termine plasmide vengono definite delle molecole circolari
di DNA presenti nei batteri. Queste molecole sono dotate di
un'origine per la replicazione e sono molto simili a dei cromosomi
batterici, ma sono più piccole e non sono strettamente
necessarie alla vita del batterio.
• I plasmidi portano dei geni in singola copia, che
rappresentano un corredo genetico aggiuntivo per il batterio
che ne possiede, e possono quindi fornirgli delle caratteristiche
specifiche. Dei geni comunemente contenuti nei plasmidi sono
quelli che conferiscono al batterio la resistenza agli antibiotici.
• I plasmidi possono quindi essere replicati all'interno dal batterio,
e i loro geni espressi, indipendentemente dal cromosoma
principale. Essi vengono trasmessi alle cellule figlie nella
divisione cellulare, conferendo lo stesso vantaggio a tutte le
cellule figlie.
 PLASMID
I
I
Plasmidi sono elementi genetici extra-
cromosomici che si replicano nelle cellule
batteriche autonomamente. Il loro DNA è
circolare e a doppia elica.I plasmidi usati
negli esperimenti di clonaggio derivano tutti
da plasmidi trovati in natura che sono stati
“ingegnerizzati” in modo da presentare
caratteristiche che facilitino il clonaggio di
geni. I più usati sono i plasmidi di E.Coli.
 •Funzioni
Tra le caratteristiche funzionali che i plasmidi sono in
grado di conferire, figurano:

· la produzione o la resistenza agli antibiotici, ai metalli

pesanti e ai raggi UV;

· l'utilizzo di fonti di carbonio insolite o la fissazione di

azoto inorganico nel suolo;

· la produzione di proteine in grado di uccidere gli altri

batteri (batteriocine);

· la virulenza (plasmide T di Agrobacterium

tumefaciens).
 Caratteristiche dei plasmidi
• Una sequenza ORI che permette al plasmide di replicarsi
nelle cellule diE.Coli in quanto viene riconosciuta dagli
enzimi di replicazione della cellula ospite
• Deve avere un marcatore selettivo, che renda le cellule di
E.Coli contenenti il plasmide, facilmente distinguibili dalle
cellule che non lo contengono; uno dei marcatori più usati è
il gene amp che conferisce la resistenza all’ampicillina
• Deve avere anche siti di taglio per enzimi di restrizione in
modo che lo si possa aprire per inserire il frammento di DNA
esogeno
La tecnologia del DNA ricombinante

– Mediante l’introduzione dei plasmidi si possono modificare i batteri

e indurli a svolgere funzioni utili

– La maggior parte dei metodi utilizzati per studiare e

manipolare
il DNA utilizza i batteri e in particolare Escherichia coli.

– Per manipolare i geni in laboratorio i biologi usano spesso i

plasmidi batterici, che possono portare a duplicare all’interno di
un batterio qualsiasi gene.

– I plasmidi sono gli strumenti chiave del clonaggio, ossia la

produzione di molte copie identiche di tratti di DNA.
INSERIMENTO DEL DNA DA CLONARE
Isolamento DNA plasmidico

• Protocollo “artigianale”
• Colonnine cromatografiche (kit
commerciali)
 Protocollo artigianale
Risospensione delle cellule in
tampone con RNasi

Lisi cellulare con NaOH/SDS

Neutralizzazione con Kacetato

(precipitazione di proteine)

Estrazione fenolo/cloroformio

Precipitazione con etanolo o

isopropanolo
Risospensione in TE
 PURIFICAZIONE del DNA PLASMIDICO

LISI ALCALINA

1. RISOSPENSIONE 3. NEUTRALIZZAZIONE
KAc

E. coli

NaOH / SDS
Centrifugazione
RNasi
2. LISI
Supernatante
Precipitato
contenente il
contenente DNA
DNA plasmidico
genomico,
proteine, detriti
cellulari
DNA cromosomico
DNA plasmidico
 Potassium acetate:
 Converts soluble SDS to insoluble PDS
 the potassium salt of SDS is insoluble, so the
protein and detergent precipitate and aggregate,
which assists in the entrapment of the high-
molecular-weight chromosomal DNA.
 Per separare il DNA plasmidico da quello cromosomale

si fa uso di un innalzamento del pH del mezzo fino ad un valore di circa

12 o l’ebollizione della soluzione per pochi minuti

si riporta la soluzione in condizioni normali (pH neutro o

temperatura ambiente)

i plasmidi saranno in grado di rinaturarsi velocemente riassumendo

una forma circolare covalentemente chiusa
i frammenti cromosomali lineari non saranno in grado di
rinaturare
correttamente e si aggregano dando luogo ad una massa reticolata
insolubile che viene per centrifugazione, lasciando il
eliminata plasmidico in DNA
 Separazione degli acidi nucleici da altri componenti
cellulari

- deproteinizzare la soluzione e poi procedere alla

precipitazione dell’acido nucleico con alcol.

La rimozione delle proteine dal lisato cellulare è

particolarmente importante sia perché tra le proteine sono
presenti enzimi capaci di degradare gli acidi nucleici, sia per
la presenza di proteine capaci di legarsi agli acidi nucleici
impedendone la funzione e/o la purificazione.
 ALLONTANAMENTO PROTEINE
• Sistemi di deproteinizzazione

• Fenolo-Cloroformio-alcool isoamilico

• Sodio dodecil Solfato SDS

• Detergente anionico che si lega alle proteine alterandone
la struttura secondaria

• Enzimi proteolitici
• PROTEINASI K: una endopeptidasi aspecifica molto
attiva
• Gli enzimi proteolitici andranno poi eliminati.
2. Estrazione con fenolo
(miscela di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25:24:1))

E’ la tecnica comunemente utilizzata per rimuovere le

proteine dagli acidi nucleici, e consiste nel trattare la
soluzione acquosa contenente gli acidi nucleici con una
miscela fenolo/cloroformio, immiscibile (quasi) in acqua.

Tale procedura può essere usata da sola o dopo la

digestione con enzimi proteolitici, al fine di rimuoverli.
 Fenolo
E’ un forte denaturante delle proteine che le
lega mediante legami H, alterandone la
struttura.

Le proteine denaturate, con i gruppi idrofobici

esposti, diventano solubili nella fase fenolica o
precipitano all’interfase fenolo-acqua.
C6H5OH
E’ un solvente dei lipidi e delle molecole di RNA
contenenti lunghi tratti di poli(A).
Cloroformio
- completa la denaturazione delle proteine
- rimuove i lipidi
- grazie alla sua elevata densità facilita la
separazione della fase acquosa (contenente il DNA
deproteinizzato) da quella organica (fenolica)
stabilizzando l’interfaccia tra le due fasi.
Alcol isoamilico: riduce la schiuma che si forma nel
corso dell’estrazione.
 Allontanamento proteine

TRATTAMENTO con FENOLO

Una o piu’ estrazioni fenoliche elimina residui proteici
e lipidici (il fenolo si lega al core delle proteine denaturandole ed
è un solvente dei lipidi)

Fenolo a pH basico (inibisce la DNAsi) per estrazione

di DNA
Fenolo a pH acido (inibisce le ribonucleasi) per RNA

Uguale volume di fenolo al sopranatante che diventa

lattescente dopo agitazione, quindi si centrifuga
Dopo centrifugazione si ottengono tre fasi:
1) superiore, che contiene la soluzione di acidi nucleici;
2) interfase, di proteine denaturate;
3)inferiore, fase fenolica contenente lipidi e proteine
ricche di aminoacidi idrofobici.

Fase acquosa (DNA e RNA)

Interfase (proteine denaturate)

Fase fenolica (proteine solubili)

 Preparazione del fenolo
Il fenolo è fortemente igroscopico e deve essere sempre
equilibrato con una soluzione tampone perché altrimenti
assorbirebbe la soluzione acquosa contenente gli acidi nucleici.

Il fenolo tende ad ossidarsi facilmente assumendo un colore rossastro

per la presenza di chinoni.
Al fenolo è aggiunta la 8-idrossichinolina (antiossidante,
parziale
inibitore delle Rnasi e un debole chelante di ioni metallici)
A un’estrazione fenolica fa seguito un’estrazione con
cloroformio/isoamilico (24:1)

precipitazione con alcol per concentrare gli acidi nucleici

(le proteine sono insolubili in alcol e co-precipiterebbero in larga misura con gli
acidi nucleici se non fossero preventivamente rimosse)

La soluzione acquosa contenente l’acido nucleico è miscelata con 2

volumi di etanolo assoluto, in presenza di cationi monovalenti (Na+,
K+, NH4+) e viene lasciata precipitare a –80°C.
 Uso dell’ isopropanolo per la precipitazione

vantaggio: uso di volumi inferiori (0,7 volumi per 5’ a TA)

svantaggio: meno volatile dell’etanolo e quindi di più difficile rimozione
La precipitazione è fortemente dipendente dal raggiungimento di
una massa critica (per concentrazioni <10mg/ml uso di carrier:
tRNA di lievito, o glicogeno)

Lavaggio del pellet

Dopo centrifugazione, il pellet di acido nucleico è “lavato” in
etanolo 70% e ricentrifugato. Tale lavaggio rimuove i sali
precipitati.

Risospensione del DNA

Il pellet dopo essiccazione è risospeso in adeguato tampone a
bassa forza ionica, in genere TE (Tris-EDTA) a pH 7.6-8.0, alla
concentrazione desiderata
 Maxi prep
• La maxi prep è identica alla mini prep fino alla
fase di aggiunta di potassio acetato
• ( naturalmente in tutte le fasi fin qui quello che
varia è il volume delle soluzioni utilizzate visto
che si parte da 500 mL di coltura batterica contro
1-2 mL nella mini prep.
• Dopo potassio acetato il supernatante ottenuto
viene precipitato con isopropanolo
3. Separazione di acidi nucleici tra di loro
Separazione del DNA plasmidico da quello genomico

Per separare il DNA plasmidico da quello cromosomale si sfruttano

le differenze chimico-fisiche tra questi due tipi di macromolecole

plasmidi (3-4 kb)si trovano prevalentemente

in forma circolare super-avvolta (supercoiled)
in forma circolare rilassata
in forma lineare

nick

Plasmide superavvolto Plasmide circolare Plasmide linearizzato

(supercoiled) rilassato

DNA cromosomale è presente sotto forma di grossi frammenti lineari

(intorno a 25 Kpb)
- Ultracentrifugazione in gradiente all’equilibrio di densità di cloruro di
cesio-bromuro di etidio
Il bromuro d’etidio, si intercala tra le basi del DNA, determinando
un parziale svolgimento della doppia elica.
DNA circolare chiuso e superavvolto
intercala una certa quantità di etidio
limitata.il bromuro di etidio svolge il
DNA e quindi il DNA si superavvolge. (
< T e > W) La molecola assume una
forma più compatta, con il conseguente
incremento della densità di
galleggiamento.
Molecole di DNA circolari rilassate e
lineari sono invece in grado di
intercalare una maggiore quantità di
etidio che ne provoca un maggior
srotolamento. L’effetto del bromuro di
etidio provoca superavvolgimento ma
questo è scaricato alle estremità libere.
Di conseguenza il DNA lineare sarà
meno denso.

Le due differenti forme di DNA possono essere separate mediante

ultracentrifugazione in gradiente di densità di CsCl/EtBr, una tecnica di
separazione che sfrutta le differenze di densità delle diverse molecole.
L’RNA non forma una
banda ma va sul fondo
sottoforma di
precipitato perché è
piu’ denso della
massima densità che si
ottiene col cloruro di
cesio. Se si vuole
ottenere una banda di
RNA si deve usare il
solfato di cesio
Separazione di DNA plasmidico da quello del cromosoma batterico
Mediante centrifugazione all’equilibrio in gradiente di Cloruro di Cesio
Kit di purificazione degli acidi nucleici
I kit piu’ utilizzati si basano sull’utilizzo di:

Matrici silicee: gli acidi nucleici si legano alle

particelle della matrice in presenza di sali
caotropici (idrocloruro (GuHCl) e isotiocianato
(GuSCn) di guanidina).
Differenti tipi di acido nucleico adsorbono più o
meno bene alla matrice di silice, a seconda
della forza ionica e del pH della soluzione.
Dopo avere lavato la matrice silicea, gli acidi
nucleici sono eluiti con un tampone a bassa
concentrazione salina o con acqua e sono pronti
per le successive reazioni

Resine a scambio ionico cariche positivamente

(anioniche): legame del DNA alla DEAE
(dietilaminoetanolo) in tampone contenente 1M
NaCl.
Eluizione del DNA in tampone 1,6 M.