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Department of School of

PROTEOMICS, Translational Medicine


METABOLOMICS &
BIOCHEMISTRY LAB
Medicine

Scienze Biomediche

Modulo di Propedeutica Biochimica

Marcello Manfredi PhD

marcello.manfredi@uniupo.it
Reagente (Substrato) → Prodotto
Quando una reazione avviene?

Quando l’energia dei substrati è maggiore di quella dei prodotti. Vale a dire le
reazioni spontanee liberano energia mentre quelle non spontanee richiedono
energia per avvenire.

Carbone (essenzialmente carbonio)


+ ---------> CO2 (anidride carbonica)
Ossigeno

La reazione è spontanea in questa direzione e libera


energia (calore e luce), non avviene spontaneamente
in senso contrario (non si genera carbone dalla CO2).

Attenzione è possibile far avvenire la reazione in


senso inverso usando energia esterna al sistema (le
piante catturano l’energia solare e la CO2 dell’aria
per produrre composti del carbonio).
L’energia ha diverse forme (calore, radiazioni,
potenziali elettrici-magnetici-gravitazionali, cambi di
conformazione, entropia).
Reagente (Substrato) → Prodotto
VELOCITA’ DI UNA REAZIONE

Velocità = aumento prodotto nel tempo d[P]/dt


= diminuzione reagenti nel tempo -d[S]/dt
= una costante di velocità x concentrazione substrati k[S]
(più ci sono reagenti più la reazione è veloce)

Quanto è veloce una reazione?

Per trasformarsi nei prodotti i reagenti devono rompere i vecchi legami prima di
formarne dei nuovi, devono quindi passare in uno stato sfavorevole
energeticamente detto stato di transizione. La velocità della reazione dipende
dalla differenza di energia tra i reagenti e lo stato di transizione e da quante
molecole hanno l’energia necessaria per compiere il processo.
Ad esempio è più facile che si rompa una sbarra di polistirolo che una sbarra di
acciaio.
I chimici superano il problema aumentando le temperatura, variando la
pressione, usando anche solventi non acquosi e catalizzatori in genere
metallici. Ad esempio l’ossidazione del carbonio in aria è spontanea ma
non avviene a meno che non si fornisca una energia iniziale
aumentando la temperatura (cerino).

… e gli organismi viventi?


Usano gli enzimi (catalizzatori
biologici).

Un catalizzatore è una
sostanza che accelera una
reazione senza venir
consumata dalla reazione
stessa (come invece avviene
per i reagenti).
FUNZIONI BIOLOGICHE DELLE PROTEINE:

ENZIMI
PROTEINE DI TRASPORTO
PROTEINE DI RISERVA
PROTEINE CONTRATTILI
PROTEINE DI DIFESA
PROTEINE REGOLATRICI
PROTEINE STRUTTURALI

Le BIOMOLECOLE sono stabili a pH 7, a 37°C, in ambiente acquoso


Difficoltà di una reazione:
•Formazione di intermedi instabili
•Collisione tra molecole con un preciso orientamento

Un ENZIMA supera questi problemi


generando un ambiente specifico in cui
una data reazione avviene
ENZIMI
• Sono nella maggior parte proteine
• Sono i catalizzatori delle reazioni biologiche
• Hanno elevata specificità
• Operano in soluzione acquosa in condizioni
blande di temperatura e pH
• La loro attività dipende dall’integrità della
conformazione proteica nativa
• La loro attività può essere regolata
(fosforilazione, glicosilazione, ecc…)

COFATTORI
Alcuni enzimi per essere attivi necessitano
di cofattori
I cofattori possone essere:
• Ioni inorganici (Fe2+; Mg2+; Mn2+; Zn2+)
• Molecole organiche o metallo-organiche
dette coenzimi
Se lo ione inorganico o il coenzima sono
legati covalentemente all’enzima viene
detto “gruppo prostetico”
I catalizzatori abbassando l’energia
necessaria a far avvenire il processo
fanno si che più molecole riescano a
reagire aumentando quindi la velocità
della reazione.
Nell’esempio precedente è più facile
rompere la barra di acciaio se si ha un
tronchese che non si consuma ma rende
più facile tagliarla.
Gli organismi viventi sono in grado di
ossidare composti del carbonio (glucosio)
ottenendo CO2 tutto ciò avviene non
riscaldando ma attraverso una serie di
tappe (glicolisi e ciclo di Kreebs)
catalizzate da enzimi.
Principi generali di enzimologia

Negli organismi viventi, dall’uomo al lievito di birra, a differenza del


laboratorio o dell’impianto chimico, le trasformazioni chimiche
avvengono a 37°C, 1 atm e in soluzione acquosa.

Le reazioni biologiche non avvengono (quasi) mai spontaneamente a


velocità apprezzabili ma dipendono dalla presenza di catalizzatori
specifici, gli enzimi (dal greco nei viventi).
Enzimi come catalizzatori biologici.

Gli enzimi sono molecole (in genere proteine) aventi il compito di catalizzare
praticamente tutte le reazioni chimiche che avvengono negli organismi viventi.

La più semplice reazione catalizzata da un enzima può essere così rappresenta da:
E + S <====>ES <====>EP <====> E + P
L'enzima si combina con i reagentI S (substrati), per formare prodotti ed enzima
libero.

Il processo può avvenire in maniera estremamente rapida: in molti casi una sola
molecola di enzima è in grado di trasformare in 1 secondo migliaia di molecole di
substrato in prodotto. La velocità di una reazione catalizzata da un enzima può
essere fino a 1014 volte superiore alla velocità della stessa reazione non catalizzata.

La struttura degli enzimi.


Gli enzimi sono generalmente proteine globulari che in soluzione assumono
approssimativamente una conformazione sferica
Come fanno gli enzimi ad
abbassare l’energia necessaria
a compiere una reazione?
I diversi enzimi agiscono in
maniera diversa, ma in tutti i
casi si ha la formazione di un
intermedio in cui il substrato
(reagente) si trova legato in una
posizione specifica all’enzima.
Gli enzimi sono catalizzatori,
rendono più veloce una
reazione spontanea ma non
possono far avvenire reazioni
non spontanee (non possono
creare energia).
Alcuni enzimi richiedono cofattori per la propria attività:
(1) Ioni essenziali
(2) Coenzimi

In molti enzimi la catalisi dipende da “coenzimi” vale a dire composti non proteici
posti all’interno del sito catalitico.
Molti enzimi richiedono per funzionare cationi metallici (Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+,
Mg2+, Mn2+, K+, Ni2+, Mo, Se).
Altri necessitano di molecole organiche più complesse dette gruppi prostetici
(NAD+ e FAD negli enzimi che trasferiscono elettroni, eme nell’emoglobina,
tiammina pirofosfato, ….)

Coenzima gruppi trasferiti precursore nella dieta

•  tiammina pirofosfato aldeidi vitamina B1


• biocitina CO2 biotina
• adenin dinucleotide flavinico(FAD) elettroni riboflavina (vit. B2)
• adenin dinucleotide nicotinico(NAD)ione idruro acido nicotinico (niacina)
• Coenzima A gruppi acilici acido Pantotenico
• tiammina pirofosfato aldeidi Vitamina B1
• piridossal fosfato gruppi amminici piridossina (vit. B6)
• tetraidrofolato formile, metile,metilene acido folico
• acido lipoico elettroni e gruppi acilici
• 5-deossi cobalammina H e gruppi alchilici vitamina B12
VITAMINE
• Una vitamina è una sostanza organica necessaria giornalmente all’organismo in
quantità dell’ordine dei milligrammi (o meno) che deve essere assunta
dall’ambiente (alimenti, flora batterica intestinale) perché l’organismo non è in
grado di sintetizzarla nella quantità necessaria

• Si dividono in LIPOSOLUBILI (vit. A, D, E, K) e IDROSOLUBILI (vit. C e quelle


del gruppo B)
• Le vitamine liposolubili si accumulano nel fegato e se assunte in eccesso
possono dare tossicità; le vitamine idrosolubili, se in eccesso, invece vengono
eliminate attraverso i reni
• Da molte vitamine, soprattutto quelle idrosolubili del gruppo B, l’organismo
produce dei COENZIMI
Enzimi tipici
(nome
Gruppo Reazione catalizzata Reazione tipica
comunement
e usato)
EC 1 Reazioni di ossidoriduzione; AH + B → A + BH (ridotta) Deidrogenasi,
Ossidoreduttasi trasferimento di atomi di idrogeno e di A + O → AO (ossidata) ossidasi
ossigeno, o di elettroni da una molecola a
un'altra
EC 2 Trasferimento di un gruppo funzionale da AB + C → A + BC Transaminasi,
Transferasi un substrato a un altro. Può trattarsi, ad chinasi
esempio, di un gruppo metilico, aminico,
fosfato.
EC 3 Formazione di due prodotti a partire da AB + H2O → AOH + BH Lipasi,
Idrolasi uno attraverso una idrolisi amilasi,
proteasi
EC 4 Addizione o rimozione non-idrolitica di RCOCOOH → RCOH + Decarbossilas
Liasi gruppi funzionali dal substrato. Possono CO2 i
essere rotti legami C-C, C-N, C-O o C-S
EC 5 Riarrangiamento intramolecolare, come AB → BA Isomerasi,
Isomerasi la modificazione di conformazione di una mutasi
molecola in seguito a reazioni di
isomerizzazione
EC 6 Unione di due molecole attraverso la X + Y+ ATP → XY + ADP + Sintetasi,
Ligasi costituzione di nuovi legami covalenti di Pi polimerasi
tipo C-O, C-S, C-N o C-C, con la rottura
simultanea di ATP
Caratteristiche comuni del sito catalitico
•  il sito catalitico comprende una piccola parte del volume di un enzima
> 100 aa, > 10 Kda, diametro 25 A°

•  il sito catalitico è un entità tridimensionale

•  I susbtrati si legano agli enzimi mediante multiple interazioni deboli

•  I siti catalitici sono in genere delle “tasche” o “cavità” in cui l’acqua è in


genere esclusa. Il carattere non polare amplifica l’interazione dei substrati
con l’enzima.
La specificità dell’interazione substrato-enzima dipende dalla
precisa definizione e arrangiamento delle catene laterali dei
residui che costituiscono il dominio catalitico

substrato
enzima Complesso enzima-substrato

Sito catalitico
La più semplice reazione catalizzata da un enzima può essere così rappresenta
E + S <====>ES <====>EP <====> E + P
Optimum temperatura
Più c’è substrato più l’enzima genera prodotto, ad un certo punto tutto l’enzima è
occupato nella reazione e la reazione non può andare più veloce e si raggiunge la V
massima. Km è la concentrazione di substrato a cui si ha la metà della velocità
massima..
La Km ci da una idea di quale concentrazione di substrato ci vuole per avere una
velocità ragionevole (metà di quella massima). Varia molto tra enzimi diversi e dipende
dai substrati.

glucocinasi glucosio 10mM


Isoenzimi: enzimi diversi che catalizzano la stessa reazione.

Dal Volume: Biochimica Medica Strutturale, Metabolica e Funzionale Piccin Nuova Libraria S.p.A.
Inibizione enzimatica
a-Inibizione enzimatica irreversibile: formano legami covalenti stabili con residui
di amminoacidi dell’enzima indispensabili per l’attività catalitica.
Dovuta a sostanze tossiche:
- composti organofosfati come diisopropilfluorofosfato e sarin (gas nervini) e
parathion (insetticidi) inibiscono l’acetilcolinesterasi
-  sali di arsenico e metalli pesanti (Pb, Hg)

b- Inibizione enzimatica reversibile: dovuta a sostanze che si legano in maniera


reversibile, non covalente, all’enzima
- inibitori competitivi: sono molecole strutturalmente simili al substrato che si
legano reversibilmente al sito attivo, in competizione con il substrato (aumento della
Km)
- inibitori non competitivi: si legano a siti diversi da quello catalitico e non
interferiscono con il legame del substrato all’enzima, ma ne bloccano la
trasformazione in prodotto (riduzione della Vmax)

Molti farmaci agiscono da inibitori reversibili:


- antibiotici (sulfamidici, penicilline, cefalosporine): inibiscono enzimi di sintesi della
parete batterica o delle proteine
- aspirina e altri farmaci antiinfiammatori non steroidei: inibiscono la cicloossigenasi,
nella prima reazione di sintesi delle prostaglandine
Molti farmaci sono inibitori irreversibili

Ciclo-ossigenasi Aspirina Ciclo-ossigenasi inattiva


Enzima importante Acido acetilsalicilico
per l’infiammazione ed il dolore
Acetilcolinesterasi
(contrazione muscolare)

Gas nervino

Acetilcolinesterasi
(inattiva)
Gli inibitori reversibili invece legano reversibilmente
l’enzima senza formare legami covalenti.
Possono essere di più tipi:
•  competitivi sono simili al substrato e si legano nel
sito attivo, possono essere allontanati con un accesso
di substrato
•  non competitivi si legano in un punto diverso
diminuendo la velocità di un enzima
Esempio di inibitore competitivo

Metotrexato, chemioterapico
Inibisce la Diidrofolato reduttasi
Esempio di inibitore non competitivo

Alfa-amanitina e RNA polimerasi


Regolazione dell’attività enzimatica

- modificazione covalente dell’enzima


- azione su sito secondario dell’enzima (allosterismo)
- induzione e repressione genica della biosintesi della proteina
enzimatica

modificazione covalente dell’enzima


Strategie della regolazione
enzimatica di tipo allosterico
Gli enzimi regolano la velocità delle reazioni chimiche che avvengono
nell’organismo. Diviene quindi importante per l’organismo controllare la
velocità con cui gli enzimi catalizzano le reazioni biologiche in funzione
di:

- concentrazione dei substrati (quanto substrato è disponibile)

- presenza di inibitori/attivatori/modificazioni covalenti (che controllano i


parametri cinetici come Km e Vmax)
•  attivatori: rendendo l’enzima più veloce ed affine ai substrati
•  inibitori: rendono l’enzima meno veloce e meno affine per i
substrati:)
Omoallosteria
Regolazione da parte dei substrati stessi (attivazione e legame
cooperativo del substrato)
Eteroallosteria, mediante la regolazione con molecole
effettori, e può essere negativa e positiva.
La velocità enzimatica può essere regolata (attivata o inibita) da regolatori
allosterici. Gli effettori allosterici si legano ad un sito differente da quello
catalitico. Possono attivare favorendo lo stato R o inibire favorendo lo stato T.
La aspartato transcarbomoilasi può essere indotta a
cambiare forma, regolando la sua attività enzimatica
La modificazione reversibile covalente è una terza possibilità,
largamente usata per regolare l'attività enzimatica. Un esempio
classico è la fosforilazione di residui serina-treonina-tirosina.
Gli enzimi possono essere regolati mediante molteplici modificazioni post-
traduzionali
La modificazione irreversibile covalente si ha con enzimi che sono sintetizzati come
precursori (zimogeno). L'attivazione dello zimogeno coinvolge la rimozione proteolitica
di un amminoacido da una estremità amminica della proteina.
Gli enzimi possono essere regolati allostericamente mediante
meccanismi molteplici: effettori e modificazioni post-traduzionali
La glicogeno fosforilasi a è un omodimero, attivata da AMP e da P in Ser14 ,
inibita da glucosio.

Piridossal fosfato
(coenzima)

sito allosterico di
legame al glucosio

Ser 14, fosforilabile sito allosterico di


legame per AMP
Un ulteriore modo di accellerare le reazioni è mettere insieme
enzimi che lavorano in serie sugli stessi substrati
(catena di montaggio)
Esempio la piruvato cinasi è in realtà un aggregato di tre diversi enzimi
Enzimi come indicatori diagnostici
Enzimi plasmatici o funzionali o costitutivi: generalmente prodotti dal fegato e
fisiologicamente riversati nel sangue

Enzimi plasmatici non funzionali o non costitutivi: non sono normalmente


presenti nel sangue, ma vi vengono riversati in condizioni patologiche. La loro
presenza nel sangue riflette infatti un danno tissutale per anossia (es. infarto del
miocardio), per infezione (es. epatite virale), per processi proliferativi (es.
osteosarcoma) o per processi ostruttivi (es. ostruzione biliare)

Esempi di enzimi che hanno un rilevante valore diagnostico:


-glutammico-ossalacetico transaminasi (GOT) (aumenta nel siero marcatamente
e rapidamente dopo un infarto
- glutammico-piruvico transaminasi (GPT) aumenta nel siero in seguito a lesioni
epatiche
-fosfatasi acida (aumenta nel siero in seguito a carcinoma prostatico con
metastasi)
-fosfatasi alcalina (aumenta nel siero in seguito a rachitismo, iperfunzionamento
delle ghiandole paratiroidi ecc.)