Sei sulla pagina 1di 3

LA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)

La PCR , Polymerase Chain Reaction o comunemente Reazione a Catena della Polimerasi , è una
tecnica di Biologia Molecolare che consente di amplificare esponenzialmente ed in modo selettivo un
frammento di DNA, definito DNA bersaglio / DNA target a partire o da una singola molecola di DNA
stampo / DNA Template o da una miscela complessa di DNA stampo/DNA Template avente un basso
livello di purificazione.
La PCR è perciò un metodo dalle vaste potenzialità, per amplificare grandi quantità della porzione
desiderata di una molecola di DNA in tempi molto più brevi di quelli necessari per il clonaggio e, difatti pur
non prevedendo l'impiego di organismi viventi (quali E. coli o lievito) , la PCR riproduce similmente in
vitro (in provetta) il meccanismo di replicazione del DNA , utilizzato da milioni di anni dalle cellule dei
viventi.
La tecnica PCR è stata ideata da Kary B. Mullis nel 1983, il quale ottenne, per questo, il Premio Nobel per
la chimica nel 1993.
Un prerequisito indispensabile per eseguire un corretto esperimento di PCR , è la conoscenza delle
sequenze nucleotidiche che delimitano le estremità della regione bersaglio/ target.
E' necessario conoscere le sequenze fiancheggianti perché la PCR richiede che due corti oligonucleotidi,a
singolo filamento, abbiano una omologia complementare per appaiarsi specificamente alle estremità 3'
della regione bersaglio/target, affinchè si ibridino alla molecola di DNA stampo/DNA Template.
Questi oligonucleotidi , definiti primer , fungono da innesco per la reazione di sintesi del
DNA,delimitando la sequenza bersaglio/ target che verrà amplificata.
Ogni oligonucleotide ibriderà con uno solo dei due filamenti della doppia elica, in modo tale che il suo
3'-ossidrile terminale (3'-OH) sia orientato verso la regione da amplificare.
Pertanto la DNA Polimerasi aggiunge i dNTP (desossiribonucleotidi trifosfato) a partire dal terminale 3'
dell'innesco, allungando, di volta in volta di un nucleotide l'estremità 3', al fine di generare una lunga
regione di DNA a doppia elica, contenente una copia della sequenza bersaglio/ target.

N.B Il legame fosfodiesterico 3'-5' si forma mediante una reazione di sostituzione nucleofila SN2 , nella
quale, la DNA Polimerasi coadiuvata dallo ione Mg++ promuove l'attacco nucleofilo del 3'-OH terminale,
deprotonato a 3'-O-, sul fosfato α del nucleotide che deve essere polimerizzato.
La molecola rilasciata durante la reazione è un gruppo pirofosfato, formato dai fosfati β e γ del nucleotide;
questa viene rapidamente idrolizzata da parte di una pirofosfatasi che produce due molecole di fosfato e
assicura l'irreversibilità della reazione SN2 .

La PCR consente di riprodurre centinaia di milione di copie di DNA tutte identiche tra loro e alla
sequenza bersaglio / target.

I COMPONENTI DELLA REAZIONE PCR

La reazione viene allestita in una singola provetta per PCR e richiede la presenza concomitante di tutti i
reagenti:

 1 µl di DNA stampo / DNA Template

Il DNA stampo / DNA Template è una molecola di DNA a doppia elica, la quale, deve contenere
necessariamente la sequenza di DNA bersaglio / DNA target da amplificare seppure in piccole quantità, per
dare inizio alla reazione.
Non è necessario che la sequenza da sintetizzare enzimaticamente sia inizialmente presente in forma pura; la
sequenza bersaglio può anche essere una frazione minoritaria di una miscela complessa. A differenza di altre
procedure di uso corrente in biologia molecolare, la PCR è sufficientemente sensibile da richiedere una
preparazione minima dello stampo.
La straordinaria sensibilità della PCR rende a sua volta il sistema vulnerabile a contaminazioni: anche tracce
di DNA estraneo, contenute per esempio in particelle di polvere, possono essere amplificate, producendo
risultati ingannevoli. Difatti, anche la purezza e il materiale di partenza contano: l'enzima può subire, o
meno, impedimento sterico per raggiungere il templato.
E in caso di DNA eterogeneo, bisogna evitare contaminanti chimici, che riducono l'attività polimerasica,
come gli acidi forti, i sali e , in linea teorica , tutte le sostanze che interferiscono con l'attività polimerasica.
L'interferenza dovuta a contaminanti può essere evidenziata mediante il calcolo dei rapporti tra le densità
ottiche misurate a diverse lunghezze d'onda. Il rapporto A260/A280 è usato per stimare la purezza degli
acidi nucleici, dal momento che le proteine assorbono a 280 nm per la presenza di residui di triptofano e
tirosina . Un DNA puro dovrebbe avere un rapporto di circa 1.8.
L'assorbanza a 230 nm , cioè ai margini dello spettro di assorbimento degli acidi nucleici, riflette la
contaminazione del campione dovuta a sostanze come carboidrati, fenoli, peptidi o composti aromatici.
Per campioni puri il rapporto A260/A230 dovrebbe essere circa 2.2.

Si può anche verificare contaminazione da prodotti di amplificazione provenienti dalla strumentazione:


a ciò si può ovviare mediante irraggiamento con luce ultravioletta, per danneggiare gli amplificati in modo
che non possano più agire da stampi. Un'altra soluzione può essere l'incorporazione di uracile nei prodotti
della PCR, in modo da renderli degradabili dall'enzima uracile N-glicosilasi(UNG).

In teoria é sufficiente una singola molecola di DNA bersaglio / DNA target per dare via alla reazione.
In realtà invece si parte da circa 105 molecole di DNA bersaglio / DNA target per ottenere un amplificato
pari a 1012.
La natura del DNA stampo / DNA Template può essere omogeneo, o eterogeneo:
In un templato omogeneo (DNA plasmidico purificato), ogni molecola è identica e rappresenta la sequenza
da amplificare. Il vantaggio è che bastano poche molecole per garantire l'amplificazione, pochi picogrammi
(pg) di DNA stampo / DNA Template .
Con un templato eterogeneo ( miscela di diverse molecole di DNA, come il DNA genomico, sospensioni
cellulari, o materiale biologico), sono necessarie più molecole per raggiungere il minimo sufficiente da
garantire l'amplificazione, almeno 1 microgrammo (µg) di molecole di DNA stampo / DNA Template.

 6 µl di MgCl2 da una soluzione madre a concentrazione nota 25 mM

La soluzione di MgCl2 viene utilizzata per regolare la concentrazione degli ioni Mg++ nel dosaggio PCR;
talvolta, il cloruro di magnesio (MgCl2) può essere aggiunto in combinazione con i tamponi PCR o
preferibilmente incorporato separatamente.
La concentrazione degli ioni Mg++ svolge due ruoli: da un lato è un cofattore essenziale per la Taq DNA
polimerasi, promuovendone l'attività enzimatica senza essere consumato nella reazione PCR; d'altra parte
influenza la specificità e la fedeltà di una reazione PCR.
Lo ione Mg++, situato nel sito attivo dell'enzima (Taq DNA polimerasi), riduce l'affinità del 3'-OH per il
suo idrogeno e genera un 3'O- che è necessario per l'attacco nucleofilo del fosfato α del nucleotide che
deve essere polimerizzato.
La PCR è specifica quando si ottiene l’amplificazione della sola sequenza di interesse. A conferire una
elevata specificità sono i primer: essi devono avere in primo luogo una sequenza esattamente
complementare al templato. La specificità è influenzata dalla temperatura di annealing e dalla
concentrazione di MgCl2.
Basse temperature oppure alte concentrazioni di ioni magnesio portano a perdita di specificità in quanto
favoriscono l’appaiamento dei primer senza che ci sia omologia totale; al contempo si ha perdita di
fedeltà, in quanto le 2 cariche positive degli ioni magnesio possono interagire con i gruppi fosfati e
stabilizzare la struttura anche se questa contiene errori di sequenza che in seguito, determinano
l'allontanamento della base azotata non complementare (formazione di dossi).
Basse concentrazioni di ioni Mg++ riducono l’efficienza di amplificazione, dovuta all'inattivazione o
perdita di funzionalità della Taq DNA polimerasi, essendo un' enzima magnesio-dipendente.
Una maggior efficienza si verifica quando a parità di numero di cicli e di templato iniziale si ottiene una
quantità di amplificato più elevata.
La concentrazione di ioni Mg++ ottimale si determina tenendo conto sia dell'attività enzimatica sia della
presenza di alcuni componenti nella miscela di reazione, quali: i desossiribonucleotidi trifosfato (dNTP), i
cui gruppi fosfati legano gli ioni Mg++ e , gli agenti chelanti (EDTA) che sequestrano gli ioni Mg++
tramite chelazione, questi limitano la quantità di magnesio libero necessario per una corretto
funzionamento catalitico della Taq DNA polimerasi.
Nella maggior parte delle applicazioni, una concentrazione finale di 1,5 mM è ideale per una resa
soddisfacente anche se, deve essere determinata sperimentalmente ogni volta che si mette a punto una
reazione. N.B. In alcuni casi,si rende necessario la titolazione di MgCl2 per una migliore resa e specificità.

 1 µl di dNTP (desossiribonucleotidi trifosfato) da uno stock a concentrazione nota 20 mM

Una condizione necessaria per l'amplificazione è la presenza, in provetta, di una quantità adeguata dei
quattro dNTP: dTTP (deossitimidina trifosfato), dATP (deossiadenosina trifosfato), dCTP
(deossicitidina trifosfato), dGTP (deossiguanosina trifosfato); indispensabili per l'estensione dei
primers ad opera dell'enzima replicativo e l'ottenimento dei filamenti complementari.
La presenza di un dNTP in concentrazioni limitanti può far si che l'enzima incorpori un residuo che
differisce da quello normalmente presente in data posizione (misincorporation) , comportando perdita di
fedeltà della Taq DNA polimerasi ed errori di sequenza.
Alte concentrazioni di dNTP riducono l’efficienza di amplificazione, dal momento che i gruppi fosfati
dei desossiribonucleotidi trifosfato legano gli ioni Mg++ , per cui, si ha una diminuizione della quantità
di magnesio libero necessario per una corretto funzionamento catalitico della Taq DNA polimerasi,
essendo un' enzima magnesio-dipendente.
Nella maggior parte delle applicazioni, una concentrazione finale di 200 µM è ideale per una resa
soddisfacente anche se, nella valutazione della concentrazione bisogna considerare la lunghezza della
sequenza da amplificare ed il numero di cicli di reazione.

 ddH2O (acqua bidistillata, sterile e priva di impurità: microorganismi, ioni caratterizzanti e


gas disciolti) ad un volume finale di 100 µl.

Potrebbero piacerti anche