VETTORI DI CLONAGGIO

Perch clonare il DNA

Per preparare una sonda di ibridazione Per costruire una genoteca allo scopo di isolare un gene o un cDNA Per trascrivere un gene e ottenere quantit elevate del relativo RNA Per trascrivere e tradurre un gene per ottenere quantit elevate della relativa proteina Per sequenziare una molecola di DNA Per mutare un gene Per studiare la funzione di un elemento regolativo (es.: promotore, enhancer, silencer)

I vettori di clonaggio: differenze nelle dimensioni degli inserti

Vettore Plasmidi Fago Cosmidi Fago P1 PAC BAC YAC Ospite naturale E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. Coli S. cerevisiae Dimensioni inserto 5-10 kb 5-25 kb 35-45 kb 70-100 kb 100-300 kb 300 kb 200-2000 kb

Vettori per applicazioni specializzate

Vettori per il clonaggio di DNA a singolo filamento Vettori per la preparazione di sonde a RNA Vettori per lespressione di proteine: Vettori che massimizzano la sintesi proteica Vettori che semplificano la purificazione delle proteine ricombinanti Vettori che favoriscono la solubilizzazione delle proteine espresse Vettori che promuovono lesportazione delle proteine

I PLASMIDI

La biologia dei plasmidi naturali: caratteristiche generali

I plasmidi sono molecole di DNA extracromosomico che si propagano stabilmente nei batteri perch in grado di autoreplicarsi Nella maggioranza dei casi assumono la forma di molecole circolari di DNA a doppio filamento, con dimensioni che vanno da 1,5 a 500 kb filamento Sono ampiamente diffusi nei procarioti Non sono indispensabili alla sopravvivenza della cellula ospite, tuttavia le conferiscono talvolta fenotipi molto utili: resistenza ad antibiotici sintesi di antibiotici fermentazioni di zuccheri sintesi di enterotossine resistenza a metalli pesanti sistemi di restrizione-modificazione del DNA degradazione di composti aromatici

La biologia dei plasmidi naturali: caratteristiche generali

Lo spettro dospite: ampio o ristretto Sequenza ORI Geni del plasmide coinvolti nella replicazione Il numero di copie: basso (1 4), medio (~10) e alto (20 40) Meccanismi molecolari che regolano la replicazione la stabilit segregativa Regione par Superavvolgimento Incompatibilit Utilizzo dello stesso meccanismo di controllo della replicazione

I plasmidi come vettori di clonaggio: caratteristiche desiderabili

Basso peso molecolare
facili da manipolare facili da purificare in genere sono ad alto numero di copie

siti unici per un ampio numero di enzimi di restrizione

marcatori genetici selezionabili

pBR322, il capostipite dei vettori plasmidici artificiali

passaggi molecolari per la creazione di pBR322

Mappa di restrizione di pBR322

11 siti unici di restrizione nel gene TcR e 6 nel gene ApR, utili per il clonaggio

pBR322 4361 bp

pBR322 4361 bp

La famiglia dei plasmidi pUC

I vantaggi del Multiple Cloning Site 1. Aumenta la flessibilit delle strategie di clonaggio poich aumenta la scelta degli enzimi di restrizione utilizzabili per il clonaggio. 2. Si pu effettuare un clonaggio con due diversi enzimi di restrizione, senza rischiare di rimuovere parti importanti del vettore, eliminando cos il problema della ricircolarizzazione del plasmide. 3. LMCS di pUC inserito allinterno del gene lacZ permettendo la selezione bianco/blu dei cloni contenenti il plasmide ricombinante.

Inserzione di un frammento di DNA nel plasmide pUC19

HOCH2 O HO

HOCH2 O O

Galactose

Glucose

OH

HO

OH

HO

OH

Lactose
O--D-galactopyranosyl-(1->4)--D-glucopyranose

X-Gal
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl -D-galactopyranoside
-Galactosidease HOCH2 O HO
Lac Z gene product

H2O

Cl Br

Galactose

HO

OH N H

X-Gal
(Colorless)

X-Gal
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl -D-galactopyranoside
-Galactosidease

HOCH2 O HO Cl OH HO Br

Galactose

HO

OH N H

Blue

So How Do You Know If You Cloned Something?

IPTG - Induces expression of lacZ X-Gal - A lactose analog which turns blue when split by -galactosidase Ampicillin - Kills all bacteria that lack the plasmid

So How Do You Know If You Cloned Something?

Blue colonies - Express -galatosidase
which metabolizes colorles X-gal to blue and turn blue thus lacZ is not disrupted Cloned fragments and there is no foreign DNA cloned disrupt lacZ thus make no b-galactosidase and colonies remain white

IPTG - Induces expression of lacZ X-Gal - A lactose analog which turns blue when split by -galactosidase Ampicillin - Kills all bacteria that lack the plasmid

Introduzione dei vettori plasmidici in cellule batteriche Trasformazione con CaCl2

Batteri trattati con soluzioni fredde di ioni bivalenti, in particolare di ioni calcio, lasciano entrare molecole di DNA in modo pi efficiente. Si ipotizza che il calcio modifichi le proprit chimico-fisiche della parete e della membrana plasmatica rendendole pi permeabili al DNA.

Introduzione dei vettori plasmidici in cellule batteriche Elettroporazione

Le cellule (procariotiche ed eucariotiche) sottoposte a stimolazione elettrica possono internalizzare il DNA. Impulsi elettrici ad alto voltaggio destabilizzano la membrana plasmatica e inducono la formazione di pori transienti del diametro di alcuni nanometri, attraverso cui possono passare molecole di DNA.

Apparecchio per lelettroporazione

cuvette cuvette 0.4cm

I metodi per la purificazione del DNA plasmidico

1. Gradiente di densit in CsCl contenente etidio bromuro

Le molecole di DNA a doppio filamento circolari chiuse assorbono meno EtBr rispetto alle lineari. Dal momento che la densit dei complessi DNA-EtBr inversamente proporzionale alla quantit del composto intercalante, le molecole di plasmide hanno una densit maggiore di quella del DNA lineare cromosomico e possono quindi essere separate in un gradiente di densit di CsCl

2. Lisi alcalina delle cellule batteriche e precipitazione selettiva del DNA plasmidico.
Trattamento con lisozima per indebolire la parete cellulare. Trattamento con Sodio Dodecil Solfato (SDS) per degradare la membrana plasmatica e con NaOH per denaturare il frammenti lineari ad alto peso molecolare di DNA cromosomico. Precipitazione selettiva del DNA cromosomico ad alto peso molecolare con sodio acetato a pH acido.

3. Kit commerciali purificazione.

di

estrazione

Associano la lisi alcalina allutilizzo di resine a scambio ionico preimpaccate in colonne.

4. Lisi batterica in gel di agarosio per plasmidi di grandi dimensioni.

Dopo trattamento con lisozima i batteri vengono lisati in gel di agarosio a cui viene aggiunto un detergente. Il DNA plasmidico viene recuperato direttamente dal gel.

IL BATTERIOFAGO

La biologia del fago : caratteristiche generali

La biologia del fago : caratteristiche generali

ciclo litico e ciclo lisogenico del fago

Tappe principali del ciclo litico del fago

Infezione Circolarizzazione del genoma Replicazione bidirezionale del genoma Replicazione a cerchio rotante

Tappe principali del ciclo litico del fago

Infezione Circolarizzazione del genoma Replicazione bidirezionale del genoma Replicazione a cerchio rotante Sintesi delle proteine della testa e della coda Impaccamento del genoma nella testa Assemblaggio della coda

Impaccamento del DNA genomico del fago nelle particelle fagiche

Un singolo genoma viene tagliato in corrispondenza della sequenza cos e inserito nel testa

La biologia del fago : il genoma

Non essenziale per il ciclo litico

COS

COS

Non essenziale per il ciclo litico

Il genoma del fago una molecola di DNA lineare a doppio filamento lunga 48,5 kb. Al 5 di ciascuna delle estremit presente un prolungamento a singolo filamento di 12 nt che costituisce le estremit cos

Il fago come vettore di clonaggio

Il fago come vettore di clonaggio

Il braccio sinistro contiene l informazione genetica per la produzione delle teste e delle code. Il braccio destro contiene i geni per la replicazione del DNA e per la lisi delle cellule. Il frammento intermedio porta i geni per i processi di integrazione-escissione.

Selezione delle placche fagiche ricombinanti

Prodotti della reazione di ligasi A Non danno progenie fagica. Non si impaccano nella testa poich hanno una dimensione <37 kb (~29 kb) Non danno progenie fagica nel ceppo E. coli lisogeno per il fago P2, poich hanno fenotipo Spi+, ossia sono sensibili alla inibizione da parte del profago P2

Saldatura di due bracci

Genoma selvatico

C Danno progenie fagica nel ceppo E. coli lisogeno per il fago P2, poich sono Spi-, ossia sono resistenti alla inibizione da P2

Genoma ricombinante

I vettori EMBL

Introduzione dei vettori in cellule batteriche: Impaccamento in vitro del DNA del fago

+
concatenamero del genoma ricombinante

+ assemblaggio

proteine di

Molecole di DNA di dimensioni inferiori a 37 kb o superiori a 52 kb non vengono impaccate. Questo determina il limite di clonaggio per inserti di dimensioni non superiori alle 23 kb

Efficienza di trasferimento del vettore nelle cellule ospiti: Trasformazione: 103-104 placche/g DNA ricombinante Trasfezione: 106 placche/g DNA

Produzione delle teste e delle code del fago per limpaccamento in vitro del DNA ricombinante

Crescita in laboratorio del fago

Fago

Batteri

In laboratorio il fago lambda viene cresciuto su una patina di cellule batteriche. I batteri e le particelle di fago vengono mescolate con top agar liquido non troppo caldo. La sospensione viene versata su una piastra di agar gi preparata, sulla quale il top agar viene lasciato solidificare. La piastra incubata per 12-16 h a 37C.

Vantaggi dei vettori fagici rispetto ai vettori plasmidici

Maggiore capienza Maggiore efficienza di trasferimento del DNA nelle cellule batteriche Facilit di purificazione del vettore ricombinante

I FAGI A SINGOLA ELICA

La biologia del fago M13: il ciclo vitale

Il genoma del fago M13 costituito da una molecola di DNA circolare a singola elica, lunga 6407 nt. M13 infetta solo ceppi F+ poich entra nella cellula batterica attraverso il pilo codificato dal fattore F. Il DNA viene convertito nella forma replicativa intermedia a doppio filamento (RF). Vengono sintetizzate circa 100 copie della forma RF. Inizia la replicazione a cerchio rotante di ununica elica del genoma virale. Vengono sintetizzate circa 1000 copie. Il genoma viene assemblato alle proteine per costituire le nuove particelle virali che fuoriescono dalla cellula batterica senza causarne la lisi.

Il batteriofago M13 come vettore per il clonaggio di DNA a singolo filamento

Il genoma del fago M13, nella sua forma replicativa intermedia RF, viene RF utilizzato come vettore di clonaggio.

Modificazioni del genoma selvatico per lottimizzazione del vettore: Aggiunta del gene lacZ come marcatore genetico per la selezione bianco/blu delle placche positive contenenti il genoma ricombinante Aggiunta di un polylinker allinterno del gene lacZ Eliminazione dei siti di restrizione naturali

Tappe del clonaggio di DNA a singolo filamento nei vettori derivati dal fago M13
Si linearizza il vettore M13 a doppio filamento con un enzima di restrizione, come se fosse un plasmide. Si mescola il vettore linearizzato con linserto avente estremit coesive compatibili con quelle del vettore. Si aggiunge la ligasi. Il prodotto della reazione di ligasi viene inserito nelle cellule E. coli mediante trasformazione. Nellospite batterico il vettore verr replicato prima in maniera bidirezionale producendo copie a doppia elica e poi a cerchio rotante producendo copie a singola. Si selezionano le placche di colore bianco contenenti il vettore ricombinante e si scartano le blu contenenti il vettore virale senza inserto.

Clonando linserto nellorientamento opposto si ottengono copie multiple dellelica complementare

Perch si clona DNA a singolo filamento?

Per sequenziare linserto clonato con il metodo di Sanger Per mutare linserto con le tecniche di mutagenesi sito-specifica Per ottenere sonde di ibridazione a singola elica

Vantaggi del vettore M13

La forma replicativa RF a doppio filamento pu essere manipolata come un normale plasmide Non ci sono limiti nelle dimensioni dellinserto come per il vettore lambda poich le dimensioni delle particelle virali dipondono dalla lunghezza del DNA che contengono. Tuttavia inserti di dimensioni maggiori di 8-9 kb rendono instabili il vettore

I COSMIDI

Caratteristiche dei vettori cosmidici

I cosmidi sono vettori di clonaggio creati dalluomo. Uniscono alcune propriet dei pasmidi e dei fagi. Sono plasMIDI contenenti la regione COS del fago lambda. Si replicano come i plasmidi poich contengono la sequenza ORI, ma si impaccano nelle teste proteiche a formare le particelle virali come i fagi poich contengono le estremit cos.

Dimensioni del cosmide: ~5 kb ORI Polylinker Marcatori genetici selezionabili (in genere il gene ApR e lacZ) Sito Cos

Schema semplificato del clonaggio in vettori cosmidici

Linearizzazione del cosmide con un enzima di restrizione Digestione enzimatica del DNA genomico e selezione dei frammenti con dimensioni di 3247 kb Reazione di ligasi Impaccamento in vitro Infezione delle cellule batteriche. Nelle cellule ospiti il cosmide circolarizza e si replica come un plasmide Selezione bianco/blu delle colonie batteriche ampicillina resistenti in terreno contenente ampicillina e X-Gal

Svantaggi nella sintesi del cosmide ricombinante

Ligazione tra i frammenti da clonare Circolarizzazione del plasmide Ligazione tra due molecole di vettore

Soluzioni
Defosforilazione dei frammenti da clonare Digestione del cosmide con due enzimi

Clonaggio in vettori cosmidici di ultima generazione

Vettore. Due siti cos separati da un sito di restrizione per Sca I, che produce estremit piatte. Digestione del cosmide con BamH I e Sca I

Genoma. Digestione parziale del DNA genomico con BamH I. Defosforilazione dei frammenti di DNA genomico per evitare la ligazione tra due frammenti

Vantaggi dei vettori cosmidici

Clonaggio di inserti di dimensioni comprese tra le 32 le 47 kb. Migliore efficienza di trasferimento del vettore ricombinante nelle cellule batteriche. Sono molto utili ai fini della creazione di una genoteca poich gli inserti di maggiori dimensioni permettono lo screening di un numero pi ridotto di cloni.

Plasmidi, fagi e cosmidi a confronto

Vettore Dimensioni inserto 5-10 kb 5-23 kb 35-45 kb propagazione Introduzione nei batteri Trasformazione Infezione fagica Infezione fagica

Plasmidi Fago Cosmidi

Replicazione del plasmide Riproduzione del fago Replicazione del plasmide

I VETTORI P1

La biologia del fago P1

Il genoma del batteriofago P1 costituito da una molecola di DNA a doppio filamento, lunga 115 kb e impaccata allinterno di una testa fagica. Dopo linfezione del batterio il fago P1 pu:

attivare il ciclo litico producendo 100-200 particelle fagiche e lisando il batterio

reprimere il ciclo litico e mantenersi nella cellula come un grosso plasmide a basso numero di copie

Il fago P1 possiede due origini di replicazione, una per controllare la replicazione litica (fagica), e laltra per mantenere il plasmide durante la crescita non litica

Il fago P1 come vettore di clonaggio

Dimensioni del vettore: ~ 15 kb sito pac siti loxP Marcatori genetici (ApR, TcR, KanR, sacB) Replicone plasmidico Replicone fagico (litico)

La ricombinazione sito-specifica

La sequenza interposta tra i due siti loxP orientati come ripetizioni dirette viene deleta

La sequenza interposta tra i due siti loxP orientati come ripetizioni invertite viene invertita

Sito loxP riconosciuto dalla ricombinasi Cre del batteriofago P1. I siti loxP sono sequenze di 34 bp che comprendono due ripetizioni invertite di 13 bp che fiancheggiano un elemento centrale di 8 bp

Tappe del clonaggio in vettori derivati dal fago P1

Il vettore viene digerito in modo da generare due bracci che vengono defosforilati per impedirne lautosaldatura Digestione enzimatica del DNA genomico e selezione dei frammenti con dimensioni di 85-100 kb Reazione di ligasi per saldare frammenti di DNA genomico ai bracci i

Impaccamento in vitro del vettore ricombinante in presenza delle teste e delle code fagiche e in presenza dellenzima pacasi Infezione di un ceppo cre+ di E. coli. Nelle cellule ospiti la ricombinasi induce la circolarizzazione del vettore che inizia a replicarsi come un plasmide Si pu incrementare lamplificazione del numero di copie del vettore inducendo il replicone litico del fago

Tappe del clonaggio in vettori derivati dal fago P1

I VETTORI BAC

Caratteristiche dei vettori BAC

siti cos del fago siti loxP del fago P1 polylinker marcatori genetici selezionabili (CmR, lacZ, sacB) oriS e repE per la replicazione del fattore F i geni par per la stabilit segregativa

I Cromosomi Artificiali Batterici (BAC) sono vettori che derivano dal fattore sessuale F

Vettori di clonaggio a confronto

Vettore Dimensioni inserto 5-10 kb propagazione Introduzione nei batteri Trasformazione/ Elettroporazione Infezione fagica Infezione fagica Infezione fagica

Plasmidi

Replicazione del plasmide

Fago Cosmidi Fago P1

5-23 kb 35-45 kb 85-100 kb

Riproduzione del fago Replicazione del plasmide Replicazione del plasmide Riproduzione del fago Replicazione del Fattore F

BAC

300 kb

Trasformazione/ Elettroporazione

I VETTORI YAC

YAC: Yeast Artificial Chromosome

ARS: Autonomously Replicating region, sequenza a replicazione autonoma di lievito. CEN: una sequenza di 125 bp tratta dai cromosomi di lievito che permette una segregazione regolare dei vettori durante la mitosi delle cellule. TEL: una sequenza di 13 bp ripetuta molte volte. E tratta dai telomeri dei cromosomi di lievito e serve a dare stabilit al vettore. Vantaggi: si possono clonare frammenti di DNA molto grandi (fino a 1Mb) Svantaggi: i costrutti sono difficili da manipolare perch fragili e nellospite tendono a ricombinare

Introduzione di DNA nelle cellule di lievito

Produzione di sferoplasti e trattamento con polietilenglicole Elettroporazione Coniugazione batterio lievito

Marcatori genici di selezione

Geni implicati nella biosintesi di uno specifico nutriente, in genere un amminoacido. I marcatori pi utilizzati sono: His3, Leu2, Trp1, Lys2, Ura3. Ura3 Il ceppo di lievito utilizzato nella trasfezione deve essere difettivo per la via biosintetica in questione. I ceppi che hanno internalizzato il vettore vengono identificati per la loro capacit di complementare il difetto nutrizionale, pertanto vengono fatti crescere su un terreno privo dello specifico nutriente.

Plasmidi per la preparazione di sonde a RNA

Sono plasmidi caratterizzati dalla presenza di uno o pi promotori fagici per la trascrizione dellinserto. Caratteristiche dei promotori fagici T3, T7 ed Sp6: 1. sono promotori molto forti 2. non sono riconosciuti dalla RNA pol di E.coli 3. le RNA pol dei fagi T3, T7 ed Sp6 sono enzimi semplici da manipolare

Possibili domande di esame sui vettori di clonaggio

Quali sequenze contengono Come si clonano gli inserti Quali sono i limiti delle dimensioni degli inserti Come vengono inseriti nella cellula ospite Come si replicano allinterno della cellula ospite Come vengono selezionate le colonie o le placche contenenti i vettori ricombinanti