C.I.

Laboratorio di Tecnologie Molecolari

Modulo A - Tecnologie Ricombinanti

Claudio Santoro
Dipartimento di Scienze della Salute
Centro di Ricerca Traslazionale sulle Malattie Autoimmuni e
Allergiche - CAAD
C.So Trieste 15A– 28100 Novara
e-mail: claudio.santoro@uniupo.it
Bibliografia e materiale didattico
• Jeremy Dale, et al
Dai Geni ai Genomi - III° edizione - EDISES

• Terry A. Brown
Biotecnologie molecolari - II° Edizione- Zanichelli

• James D. Watson et al
DNA ricombinante - II° Edizione - Zanichelli

• Presentazioni, materiale didattico ed articoli su D.I.R.

Esame del C.I.

• Prova scritta: domande a risposta multipla
 Obiettivo del modulo
Fornire le basi teoriche e pratiche delle metodiche e tecnologie utilizzate nello studio ed analisi
dell’espressione genica. Particolare enfasi sarà rivolta alle tecniche del DNA ricombinante utilizzate per
clonare, esprimere ed analizzare prodotti genici di interesse biomedico ed applicativo. A supporto di queste,
il modulo prevede la obbligatoria frequenza di un laboratorio didattico.

Conoscenze ed abilità attese

Lo studente deve conoscere i meccanismi molecolari e cellulari che regolano la replicazione, la crescita
cellulare e il programma di espressione genica sia in organismi procarioti che eucarioti.

Programma del corso

Conoscenza dei vettori di clonaggio e di espressione di proteine ricombinanti. Conoscenza delle principali
strategie di clonaggio e di manipolazione genica. Conoscenza delle principali strategie di costruzione e
mantenimento di organismi geneticamente modificati. Conoscenza delle tecnologie applicate alla diagnosi
genetica. Caratteristiche generali dei vettori di clonaggio e di espressione.
Strategie di clonaggio e di analisi di genoteche. PCR. Mutagenesi mirata. Espressione di proteine
ricombinanti in E.coli. Metodi di trasformazione genica. Espressione di proteine ricombinanti in cellule
eucariote. Espressione di transgeni in animali modello. DNA arrays, Gene-chips. PTT, SNP.
Proteomica. Strategie genetiche per il miglioramento fenotipico di organismi di interesse socioeconomico.

Scopo formativo del Modulo

• Dimostrare, anche mediante esperienze pratiche, che i
meccanismi molecolari e genetici che regolano la vita delle
cellule e degli organismi possono essere utilizzati per lo
sviluppo di tecnologia, beni e servizi.
Le tecnologie ricombinanti
sono l’insieme di procedure
tecnologiche che, attraverso
la manipolazione del DNA,
consentono l’analisi di
differenti prodotti genici ed
eventualmente di regolarne
l’espressione anche in
contesti allotipici

1. E’ necessario conoscere le
caratteristiche e la struttura
dei geni e genomi…
2. I meccanismi
che regolano
l’espressione
genica
3. Occorre considerare le caratteristiche strutturali e riproduttive degli organismi
oggetto delle manipolazioni genetiche
 La più frequente applicazione tecnologica del DNA ricombinante riguarda
l’espressione arbitraria di un gene. Per questo scopo, il gene deve essere clonato.

Clonaggio di un gene.

Perché nei batteri

 Tecnologie del DNA
‘Ricombinante’:
analizzare e modificare i geni
Con il termine ‘tecnologie del DNA ricombinante’ si intendono tutte quelle tecniche
che permettono di:
• isolare
• purificare Il ‘DNA ricombinante’ è DNA proveniente da due o
• analizzare più origini diverse, combinato insieme
• manipolare
sequenze di DNA

Queste tecniche vengono comunemente utilizzate sia per la ricerca di base della
biologia degli organismi che per la ricerca applicata
L’uso delle tecnologie del DNA per modificare i geni per scopi pratici è detta ingegneria
genetica

In particolare, l’ingegneria genetica trova larga applicazione nell’area delle

biotecnologie, settore che comprende qualsiasi tecnica, applicata a sistemi biologici o
a organismi viventi, per realizzare o modificare prodotti o processi per uno specifico
scopo

Difatti le biotecnologie comprendono manipolazioni che non implicano le tecnologie

del DNA, come ad esempio l’uso del lievito per produrre birra e fare il pane, e l’uso di
batteri per fare lo yogurt e formaggio
 Clonaggio del DNA
Un ‘clone’ è una linea di cellule o individui ‘geneticamente’ identici
derivati da uno stesso progenitore.
 Clonaggio del DNA
Il clonaggio del DNA è un metodo per produrre molte copie di
un frammento di DNA, quale ad esempio un gene d’interesse.
Questa tecnica è inoltre utilizzata anche per clonare importanti
sequenze di DNA che non codificano per geni, come ad esempio
sequenze regolatrici dell’espressione dei geni, promotori, o
altre sequenze regolatrici, es, enhancer ecc.

Procedura:
• Isolare il DNA da clonare, ad es. da cellule
• Tagliare il DNA in frammenti
• Tagliare il plasmide batterico circolare, allo stesso modo del
DNA da clonare
• Unire i frammenti di DNA con i frammenti di plasmide per
generare molecole di DNA ricombinante
• Introdurre le molecole ricombinanti in cellule batteriche.
Mentre le cellule batteriche replicano, permettono ai
vettori al loro interno di replicare in modo da amplificare
ciascun vettore e quindi ciascun frammento di DNA
• Identificare i batteri contenenti i plasmidi ricombinanti.
Crescere i batteri selezionati al fine di produrre grandi
quantità di DNA ricombinante
• Isolare i plasmidi dalle colture batteriche e analizzare i
frammenti di DNA amplificati

Visione d’insieme del clonaggio di frammenti di DNA in un plasmide batterico – Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli
 Clonaggio del DNA
Applicazioni nella ricerca di base:
• Determinare la sequenza di geni
• Determinare le sequenze regolatrici
• Studiare la funzione dei geni
• Studiare la regolazione dei geni
• Studiare il prodotto dei geni
• Manipolare i geni e/o la loro regolazione

Applicazioni nella ricerca applicata:

• Terapia genica volta a correggere o trattare una malattia genica
• Diagnosi di malattie genetiche
• DNA fingerprinting in medicina legale
• Produzione di farmaci (Humulin, NGF, plasminogeno, ecc)
• Generazione di ceppi batterici, animali e piante geneticamente
modificati
 Plasmid Cloning Vectors
• Recombinant DNA needs to be replicated in bacterial cell
• Self-replicating piece of DNA
• termed cloning vehicle
• can be plasmid or phage

• Small circular piece of DNA

• Exists separate from chromosome
• Derived from naturally occurring plasmids

• High copy number = 10-100 copies / cell

• Low copy number = 1-4 copies / cell
Plasmid Cloning Vectors
• Derived from naturally occurring plasmids
• Altered features (engineered)
• small size (removal of non-essential DNA)
• higher transformation efficiency
• origin of replication (retained from original plasmid)
• unique restriction enzyme sites
• one or more selectable markers
• other features: promoters, tag, reporter gene, etc.
pBR322
old-style
general
purpose
plasmid
4362 bp
pUC19

2.68kbp
MCS = multi cloning site or polylinker
Clonaggio di un gene d’interesse in un
vettore plasmidico
• Selection of recombinant bacteria after
transformation
Blue-white selection
– DNA is cloned into the restriction site in the lacZ gene
– When it is interrupted by an inserted gene, the lacZ gene
cannot produce functional Beta gal
– When Xgal (artificial lactose) is added to the plate, if
functional lacZ is present = blue colony
– Non-functional lacZ = white colony = clone = genetically
identical bacterial cells each containing copies of
recombinant plasmid

2.68kbp
…….to pick up colonies…
Library
Identificazione di una sequenza di DNA
mediante ibridazione del DNA
La reazione a catena della polimerasi (PCR): un ‘tool’
efficace da utilizzare nel clonaggio genico

Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli

Termociclatori
Il clonaggio genico ‘classico’
non consente una
identificazione diretta e
immediata di un gene
specifico, tra i tanti presenti
nel DNA di partenza

È quindi necessario
utilizzare tecniche
aggiuntive per la
identificazione del
gene (i) d’interesse
Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli
Permette quindi di clonare,
in maniera diretta, solo il
gene di interesse
Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli
 I vettori per il clonaggio dei geni:
plasmidi e vettori fagici
Requisiti indispensabili:
- duplicazione indipendente dal genoma dell’ospite
- dimensioni limitate

Plasmidi Cromosomi fagici

Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli

I marker di
selezione

Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli

La propagazione
dei vettori

Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli

 I vettori fagici
- Virus che infettano specificamente cellule batteriche
- Struttura molto semplice:
- una molecola di DNA (o, in alcuni casi, RNA)
- Involucro proteico: capside

Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli

I vettori fagici

Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli

I vettori fagici

Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli

I vettori fagici

Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli

I vettori fagici

Mappa genetica del fago l(49kb)

Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli

I vettori fagici

Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli

 I vettori fagici
- M13 = 6407bp
- Genoma a singolo filamento
- Il capside presenta solo 3
diverse proteine
- No geni per l’integrazione
- Infezione attraverso il pilo
- Il DNA a singolo filamento
funge da stampo -> DNA duplex
- No integrazione nel genoma
dell’ospite
- Duplicazione continua del
genoma, oltre 100 copie
- Nuove particelle assemblate e
rilasciate senza lisi

Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli

 Perché il genoma di M13 è ideale per i clonaggi:

- genoma <10kb
- Forma replicativa duplex (come i plasmidi -> manipolato)
- Geni in forma di singolo strand si prestano a processi di mutagenesi in vitro
- Vettori derivanti dal genoma di M13 sono particolarmente utili nella tecnica del ‘phage
display’ per la identificazione di geni i cui prodotti interagiscono (interazioni proteina-
proteina)
 Purificazione del DNA

- DNA cellulare

- DNA plasmidico

- DNA fagico
Isolamento del DNA cellulare

(L) (mL)

Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli

La purificazione del DNA dalle cellule

x = (y-a)/b
y = OD
x = N.Cell/ml

Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli

 La purificazione del DNA dalle cellule

The force exerted on a particle in a centrifuge is a simple function of the rotation speed of the
centrifuge and the radius of rotation. The actual equation is:
RCF or G-force= 1.12  x  R  x  (RPM/1000)²
 R is the radius of rotation measured in millimeters. For example in the photograph below R is
240mm.

Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli

 La purificazione del DNA dalle cellule

Preparazione di un estratto cellulare

Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli

Purificazione del DNA da estratto cellule

Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli

Purificazione del DNA da estratto cellule

Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli

 Purificazione del DNA da estratto cellule
Utilizzo della cromatografia a
scambio ionico

Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli

 Purificazione del DNA da estratto cellulare
Utilizzo di silice più
guanidinio tiocianato

Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli

 Purificazione del DNA da estratto cellulare

Alrti metodi che

utilizzano silice

Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli

La precipitazione del DNA in etanolo

Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli

 Misurare la concentrazione del DNA

Absorbance Methods
The most common technique to determine DNA yield and purity is measurement of absorbance. All that is
needed for the absorbance method is a spectrophotometer equipped with a UV lamp, UV-transparent
cuvettes (depending on the instrument) and a solution of purified DNA. Absorbance readings are
performed at 260nm (A260) where DNA absorbs light most strongly, and the number generated allows one
to estimate the concentration of the solution.

DNA concentration is estimated by measuring the absorbance at 260nm, multiplying by the dilution factor,
and using the relationship that an A260 of 1.0 = 50µg/ml pure DNA.

Concentration (µg/ml) = A260 × dilution factor × 50µg/ml es. A = 0,5 -> Conc = 0,5 x 1 x 50 = 25 mg/ml
La purificazione del DNA dalle cellule vegetali

Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli

 Isolamento del DNA plasmidico

Il plasmidico e quello genomico hanno caratteristiche

chimico-fisiche diverse:
• dimensioni
• Conformazione (lineare – circolare)
 Isolamento del DNA plasmidico

Isolamento in
base alle
dimensioni

Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli

 Isolamento del DNA plasmidico

Isolamento in base alla conformazione

Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli

 Isolamento del DNA plasmidico

Isolamento in base alla conformazione:

• denaturazione alcalina

Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli

 Isolamento del DNA plasmidico

Centrifugazione in gradiente di cloruro di cesio (CsCl)

50,000 giri al minuto o più Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli

 Isolamento del DNA plasmidico

Purificazione mediante centrifugazione in gradiente di

densità EtBr-CsCl

Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli

 Isolamento del DNA plasmidico

Purificazione mediante centrifugazione in gradiente di

densità EtBr-CsCl

Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli

 Amplificazione dei plasmidi
Alcuni plasmidi ‘high copy number’ hanno la caratteristica di potersi duplicare
anche in assenza di sintesi proteica

12h

La sintesi proteica è bloccata

La replicazione del DNA genomico è bloccata
La divisione cellulare è arrestata
Il DNA plasmidico continua a duplicarsi
Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli
 Isolamento del DNA fagico

Una semplice procedura di deproteinizzazione permette la rimozione del capside virale

e ottenere un estratto di DNA fagico

Problemi: titolo virale basso (es. fago l)

Es: fago l titolo max = 1010/ml -> resa max = 500ng -> colture di 500-1000 ml

Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli

Colture di fago l con titolo elevato

Mutanti temperatra-
sensibili (ts) del gene cI

Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli

Preparazione di colture di fagi l non lisogeni

Richieste prove
empiriche per
trovare (‘settare’) le
condizioni migliori e
abilità dell’operatore

Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli

 Raccolta da colture infette

Il PEG in presenza di sale (es NaCl) assorbe acqua

PEG causando l’aggregazione delle macromolecole in
soluzione (es particelle fagiche)
Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli
 Isolamento del DNA fagico
Deproteneizzazione mediante
proteasi
Frazionamento mediante
cromatografia a scambio ionico

Alternativamente:
disgregazione del capside con
guanidinio tiocianato e
purificazione del DNA con
silice

Tuttavia, la precipitazione delle

particele fagiche con PEG
contiene anche detriti cellulari
e DNA genomico

Possibile soluzione: centrifugazione

in gradiente di densità di CsCl

Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli

Isolamento del DNA di M13

Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI , Zanichelli

Isolamento del DNA
Isolamento del DNA