Tecnica di Biologia Molecolare che consiste nel determinare tutte le basi che costituiscono un frammento di DNA. Ha permesso enormi sviluppi nella Ricerca Scientifica: la decodifica di tutto il Genoma Umano ha chiarito lorigine molecolare di molte malattie ereditarie e diversi meccanismi oncogenici con cui si sviluppano i tumori. In campo microbiologico e virale disporre della sequenza di virus e batteri ha messo a disposizione metodi di identificazione (PCR) e di tipizzazione per chiarire aspetti legati alla resistenza a farmaci, alla virulenza e alla determinazione di sottotipi.
Il metodo Sanger
(o metodo a terminazione di catena)
1) Il sequenziamento a terminazione di catena coinvolge la sintesi di nuovi filamenti di DNA, complementari ad uno stampo a singolo filamento Per la sintesi del DNA si utilizzano DNA polimerasi caratterizzate da
Elevata processivit Bassa attivit esonucleasica 5-3 Bassa attivit esonucleasica 3-5 (es. Klenow, Sequenasi)
Il metodo Sanger
(o metodo a terminazione di catena)
Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad 1) Uno stampo a singola elica 2) un innesco specifico (primer) 3) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con ha bisogno di: 4) una miscela di ddNTP, uno per ogni reazione di sequenza
35S
La sintesi del filamento complementare, tuttavia non prosegue indefinitivamente, perch la miscela di reazione contiene, in quattro distinte reazioni, piccole quantit di specifici dideossinucleosidi trifosfati, ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP, che bloccano lallungamento perch posseggono un solo atomo di idrogeno al posto del gruppo -OH in 3
STOP
5-A T C T T T T A G A G T A C C T G A G*A G A T G A T A G*A T G T AddC 3-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5
Il risultato una serie di frammenti, ciascuno dei quali interrotti in corrispondenza di una delle dCTP presenti nel filamento
ddCTP
ddCTP
ddCTP
3-GGCTAAC
+
[35S]dATP+dCTP,dGTP,dTT (dNTP) +Sequenasi ddATP, dNTP -CCG ddA ddCTP, dNTP -ddC -C ddC A C ddGTP, dNTP -CC ddG -CCGATT ddG G T G T ddTTP, dNTP -CCGA ddT -CCGAT ddT
-CCGATT ddG -CCGAT ddT -CCGA ddT -CCG ddA -CC ddG -C ddC -ddC Sequenza: 5-CCGATTG
T
A G C C
Direzione di lettura
ddATP
Vengono effettuate 4 reazioni di PCR, ognuna contiene un solo primer e uno dei 4 dideossinucleosidi trifosfati. In questo modo si ottiene soltanto il filamento complementare allo stampo. Si generano le consuete famiglie di filamenti a catena terminata che vengono risolti per elettroforesi su gel di poliacrilammide
Coniugando a ciascun ddNTP un diverso marcatore fluorescente, possibile effettuare le quattro reazioni di sequenziamento in un unico tubo da saggio e caricare il tutto in un solo pozzetto di gel ddA ddT
ddC ddG
Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e le informazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore diverso, con aree proporzionali allintensit di emissione.
Si sta diffondendo luso di tubi capillari al posto dei tradizionali gel e di procedure robotizzate in tutte le fasi. Nelle migliori condizioni possibile leggere 750.000 bp al giorno
Quali sono gli obiettivi del Progetto? identificare tutti gli oltre 80.000 geni del DNA umano determinare la sequenza dei 3 miliardi di basi chimiche che formano il DNA umano immagazzinare queste informazioni in un database, rendendoli accessibili per ulteriori studi biologici
per
le
analisi
nuove
tecnologie
di
studiare i problemi etici, legali e sociali (ELSI) che possono sorgere dal progetto: per questo il DOE e il NIH hanno devoluto tra il 3% e il 5% dei loro budget del Progetto Genoma. Questo rappresenta il pi grande programma di bioetica mai realizzato al mondo, un modello per tutto il mondo scientifico.
Il progetto genoma umano (HGP) stato un progetto internazionale della durata di tredici anni, iniziato ufficialmente nell'ottobre del 1990 per scoprire tutti gli 80000 geni che compongono il nostro DNA e renderli accessibili per ulteriori studi biologici; originalmente il progetto doveva durare 15 anni divisi in tre quinquenni, ma il rapido progresso tecnologico lo ha accelerato e ne ha posto il termine prefissato nel 2003. In parallelo a questo sforzo stato studiato il DNA di una serie di organismi per provvedere alle informazioni comparative necessarie per la comprensione del funzionamento del genoma umano. Le informazioni generate dal progetto hanno portato benefici nel campo della medicina e ci aiutano a capire ed eventualmente a trattare molte delle oltre 4.000 malattie genetiche che affliggono il genere umano.
Si differenzia da tutti gli altri metodi perch non utilizza sintesi enzimatiche ma trattamenti chimici che agiscono a livello di singoli nucleotidi. I frammenti di DNA a doppio filamento possono essere generati per frammentazione o digestione enzimatica. In entrambi i casi le molecole a doppio filamento devono essere convertite in molecole a singolo filamento e marcate terminalmente
1 Marcatura terminale al 5 o al 3 del DNA a doppio filamento 2 Denaturazione e separazione dei due filamenti 3 Il DNA a singola elica viene suddiviso in quattro campioni, ognuno dei quali viene trattato con un reagente chimico che demolisce una o due delle 4 basi del DNA. G = DMS + piperidina G + A = DMS + piperidina + acido formico C + T = idrazina + piperidina C = idrazina + piperidina in NaCl 1,5 M Le reazioni sono controllate in modo da avere una frammentazione parziale: statisticamente tutti le possibili basi saranno degradate producendo una serie di frammenti la cui lunghezza dipender dalla distanza tra lestremit marcata e il sito di taglio 4 Separazione dei frammenti marcati mediante elettroforesi su gel denaturante e visualizzazione dei risultati mediante autoradiografia