Amplificazione di DNA mediante PCR

Argomenti della lezione -concetti di base sulla PCR -ottimizzazione dei protocolli di PCR -clonaggio di frammenti di DNA ottenuti mediante PCR -amplificazione di RNA (RT-PCR) -PCR quantitativa

DNA

Concetti di base sulla PCR.

1 PCR 1 x 109

Polymerase Chain Reaction (PCR): tecnologia che consente di amplificare enzimaticamente in vitro in modo specifico sequenze di DNA o di RNA anche rare in una miscela complessa, quando siano note le estremit 5 e 3 della sequenza stessa.

Il principio a cui si ispira la PCR la replicazione del DNA:

REPLICAZIONE
Primer a RNA

PCR
3 5 3

Nuovo filamento

DNA stampo

DNA polimerasi

DNA polimerasi termostabile DNA stampo

5

Primer oligonucleotidico Nuovo filamento

Primers a RNA Nuovo filamento

3 3 5

Questa tecnologia ha permesso di procedere ad esperimenti che prima erano impossibili e ha numerose applicazioni nel campo della ricerca di base e della diagnostica:
-clonaggio DNA e cDNA, librerie -mutagenesi in vitro -ingegnerizzazione DNA -fingerprinting in scienza forense -test diagnostici per la presenza di agenti infettivi -diagnosi prenatale di malattie genetiche -analisi di predisposizione genetica a patologie -analisi di variazioni di sequenza alleliche -sequenziamento di DNA e cDNA -analisi della struttura dei trascritti a RNA etc..

Quanto potente la PCR?

-la PCR pu amplificare una quantit di DNA visualizzabile in gelelettroforesi in circa 2h -il DNA templato non deve essere necessariamente altamente puro (si pu amplificare addirittura da colonie batteriche bollite) -la PCR pu amplificare una singola molecola di DNA -la lunghezza del frammento di DNA da amplificare pu essere in linea teorica ampiamente variabile, fino anche a 25kb. Si ha per un drastico calo di efficienza di amplificazione con target >3kb. Mediamente i frammenti che si amplificano sono nel range di 1001500bp

Prima dellavvento della PCR lanalisi genetica si avvaleva di varie tecniche: -Southern blotting (1975): permise il rudimentale mappaggio di geni -sequenziamento di DNA (1978): richiedeva il clonaggio di geni in vettori -la costruzione di library di geni e il loro screening richiedeva molti mesi di lavoro

Le basi teoriche della PCR furono probabilmente descritte gi negli anni 70 (Klippe et al 1971 J Mol Biol 56, 341-346), ma suscit particolare interesse solo nella met degli anni 80 quando Kary Mullis descrisse una tecnica che consentiva di ottenere grosse quantit di DNA di geni a copia singola dal DNA genomico.

The article from 1971 in which Kleppe et al. describe Repair replication basically the same principle as PCR!
J. Mol. Biol. (1971) 56 341-361

Linvenzione della PCR

Inventata da Kary Mullis nel 1983. La prima pubblicazione appare nel 1985. Nobel nel 1993.

PCR
Istep
regione di interesse 5 3 3 5 i filamenti vengono separati ed i primers si appaiano 5 primer 2 3 5 3 primer 1 5 i primers si estendono 3 complementariet al primer 1 5 i filamenti vengono separati ed i primers si appaiano 3 5 complementariet al primer 2 i primers si estendono 3 5 5

IIIstep
i filamenti vengono separati ed i primers si appaiano complementariet al primer 1 3

complementariet al primer 2 3

5 3

3 5

IIstep

5 3

3 5

3 i primers si estendono 5 filamenti di lunghezza omogenea 3

Frammenti desiderati (quelli di lunghezza variabile non sono mostrati)

3 filamenti di lunghezza variabile 5

E cos via

regione di interesse 5 3 3 5

Base teorica della PCR. Nella reazione sono presenti tre segmenti di DNA: un segmento a doppia elica da amplificare (templato) e due oligonucleotidi a singola elica che lo fiancheggiano e che funzionano da primer della reazione. Inoltre intervengono una componente proteica enzimatica (DNA polimerasi), i trifosfodesossiribonucleotidi (dNTPs), un tampone di reazione, sali.

regione di interesse

Istep

5 3

3 5 i filamenti vengono separati ed i primers si appaiano

5 primer 2 3

3 primer 1 5

Protocollo della reazione.

La procedura della PCR prevede luso di oligonucleotidi sintetici complementari alle regioni 3 del segmento di DNA target (templato). Gli oligonucleotidi sono aggiunti in largo eccesso rispetto al segmento di DNA da amplificare. Ibridizzano sugli strand opposti del templato e sono orientati con le loro estremit di fronte luna allaltra, cos che la sintesi ad opera della DNA polimerasi (che dirige la crescita in direzione 5 3) si estende attraverso il segmento di DNA tra loro.

Istep

regione di interesse 5 3 3 5 i filamenti vengono separati ed i primers si appaiano 5

94-96C 50-60C 72C

primer 2 3 5

3 primer 1 5 i primers si estendono 3 complementariet al primer 1

complementariet al primer 2

I primer vengono aggiunti al DNA e la temperatura viene prima alzata a 94-96C per denaturare il templato e separare i due strand complementari e poi abbassata a circa 50-60C. A tale temperatura il DNA templato rimane denaturato perch gli strands complementari si trovano a concentrazioni troppo basse nella miscela di reazione per incontrarsi durante il breve periodo di incubazione, ma gli oligonucleotidi specifici, che sono a concentrazione molto elevata, possono ibridizzare con le regioni del templato ad essi complementari. Questi oligonucleotidi servono cos da primer per la sintesi della catena di DNA, che avviene a temperatura di 6072C a seguito dellaggiunta di una miscela di reazione contenente dNTPs e lenzima DNA polimerasi.

Le 3 fasi di reazione sono quindi: -denaturazione del templato (94-96C) -annealing dei primer al templato (50-60C) -sintesi (extension) del DNA (60-72C)

Un ciclo di sintesi risulta in due nuovi strand complementari, che, come le eliche parentali, possono ibridizzare con i primer a seguito di un successivo ciclo di denaturazione e annealing e funzionare quindi a loro volta da templato. La quantit del templato si duplica ad ogni successivo ciclo di denaturazione, annealing ed estensione, accumulandosi in maniera esponenziale cos che 30 cicli dovrebbero risultare in 2 30 molecole di DNA.

I primi 4 cicli della PCR in dettaglio

Frammento desiderato 2 ciclo 1 ciclo 3 ciclo 4 ciclo Amplificazione esponenziale

35 ciclo DNA stampo

Numero di copie di DNA contenenti il frammento desiderato

21 = 2

22 = 4

23 = 8

24 = 16

235

Numero di copie di DNA della corretta lunghezza contenenti il frammento desiderato

PCR Cycling
3035 cicli:
denaturazione (95C), 30 sec. annealing (5560C), 30 sec. estensione (72C), tempo in base alla lunghezza dellamplicone.

CYCLE AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA 100% EFFICIENCY 90% EFFICIENCY 80% EFFICIENCY 70% EFFICIENCY 0 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 4 4 3 3 3 8 7 6 5 4 16 13 10 8 5 32 25 19 14 6 64 47 34 24 7 128 89 61 41 8 256 170 110 70 9 512 323 198 119 10 1,024 613 357 202 11 2,048 1,165 643 343 12 4,096 2,213 1,157 583 13 8,192 4,205 2,082 990 14 16,384 7,990 3,748 1,684 15 32,768 15,181 6,747 2,862 16 65,536 28,844 12,144 4,866 17 131,072 54,804 21,859 8,272 18 262,144 104,127 39,346 14,063 19 524,288 197,842 70,824 23,907 20 1,048,576 375,900 127,482 40,642 21 2,097,152 714,209 229,468 69,092 22 4,194,304 1,356,998 413,043 117,456 23 8,388,608 2,578,296 743,477 199,676 24 16,777,216 4,898,763 1,338,259 339,449 25 33,554,432 9,307,650 2,408,866 577,063 26 67,108,864 17,684,534 4,335,959 981,007 27 134,217,728 33,600,615 7,804,726 1,667,711 28 268,435,456 63,841,168 14,048,506 2,835,109 29 536,870,912 121,298,220 25,287,311 4,819,686 30 1,073,741,824 230,466,618 45,517,160 8,193,466

'232  &,&/2  [  [  [  [

'232 Q &,&/, IROG LQFUHDVH HIILFLHQF\ 3

37

Quante copie?
-in realt non si formano prodotti utili fino a circa il terzo ciclo -laccumulo non esponenziale nella prima fase -a 30 cicli ci sono circa 1073741764 copie (circa 1x109)

La procedura iniziale prevedeva lutilizzo del frammento di Klenow dellenzima DNA polimerasi di E.Coli che veniva aggiunto fresco ad ogni ciclo di amplificazione: questo enzima essendo termolabile veniva infatti inattivato durante il passaggio di denaturazione del DNA.

Lavvento della Taq DNA polimerasi da Thermophilus aquaticus (Saiki et al 1988) ha notevolmente facilitato lautomazione di tale procedura e ha permesso di lavorare a temperature di annealing e di estensione (72C) molto pi elevate, aumentando cos la stringenza dellibridazione fra primer e templato e quindi la specificit del prodotto amplificato.

COMPONENTI di una REAZIONE di PCR

Stampo

DNA a doppio filamento Oligonucleotidi complementari a regioni dei filamenti opposti che fiancheggiano la sequenza DNA bersaglio

Primers

Deossiribonucleotidi trifosfati

Miscela equimolare di dATP, dTTP, dGTP, dCTP Lo ione Mg2+ essenziale per il funzionamento dellenzima

Tampone contenente cloruro di magnesio

Enzima

Tradizionalmente viene usata la Taq polimerasi, enzima termostabile estratto dal batterio termofilo Thermus aquaticus

Ottimizzazione dei protocolli di PCR.

Molte sono le variabili che possono influenzare lefficienza della PCR. Ogni PCR una reazione a s da ottimizzare, nel senso che condizioni che sono funzionali ed efficienti in una certa PCR possono non esserlo in altre PCR. Le principali variabili da tenere in considerazione nel mettere a punto un protocollo di PCR sono: -concentrazione di MgCl2 -purezza dei reagenti -selezione dei primers -purezza e quantit del templato -tipo di enzima utilizzato -hot start PCR -uso di enhancers -parametri del termociclatore

Concentrazione di MgCl2.
Generalmente nella messa a punto di un protocollo di PCR necessario determinare la concentrazione ottimale di MgCl2, indispensabile per il funzionamento della Taq e dalla cui concentrazione dipende anche la fedelt della reazione (un eccesso causa una perdita di fedelt). Il Mg viene anche chelato da stampo, primers e dNTPs. Gli enzimi e i loro buffer di reazione vengono venduti privi di MgCl2 per permettere appunto alloperatore di settare la concentrazione ottimale per il proprio protocollo e per il proprio set primers/templato. A volte bisogna trovare un compromesso tra resa e specificit. In genere vengono utilizzate concentrazioni che vanno da 1.5 mM a 5 mM(e oltre in alcuni casi). Luso di enhancers permette di aumentare la molarit del sale nel tampone di reazione.

Purezza dei reagenti.

La presenza di contaminanti (Dnasi, Rnasi etc) nella miscela di reazione pu avere un effetto deleterio sulla reazione stessa. E necessario pertanto utilizzare materiale plastico monouso preferibilmente autoclavato o comunque sterilizzato per evitare la possibile contaminazione con DNAsi e puntali con filtro per evitare possibili aerosol durante il pipettamento. E inoltre buona regola utilizzare piccole aliquote di ciascuno dei componenti della miscela di reazione per evitare contaminazioni da DNA precedentemente amplificato (carryover).

Selezione dei primer.

Questo senzaltro il fattore pi critico da considerare e il meno facilmente prevedibile nella messa a punto di un protocollo di PCR. Primer che in linea teorica dovrebbero funzionare al meglio in determinate condizioni, non necessariamente possono dare i risultati sperati. Per massimizzare la possibilit che una coppia di primers funzioni al meglio occorre comunque considerare alcuni parametri.

Criteri di scelta dei primer. 1-specificit I primers sono disegnati in modo da essere esattamente complementari alla sequenza target. Un buon primer dovrebbe ibridare efficacemente solo con la sequenza di interesse e dare ibridazione non significativa con altre sequenze di DNA contenute nel templato. Esistono al riguardo dei programmi on-line che consentono di verificare questo parametro (es: Blast).

In alcuni casi per si rende necessario luso di primers non perfettamente complementari. Nel caso ad esempio che si voglia amplificare un gene di cui nota solo la sequenza proteica o nel caso in cui si voglia isolare un gene omologo ad un gene di unaltra specie, si rende necessario luso di primer degenerati: in tali casi preferibile avere la regione di mismatch nella zona in 5 del primer mentre meglio evitare mismatch e degenerazioni nella regione 3 altrimenti lestensione pu non avvenire.
R = A, G Y = C, T W = A,T M = A,C K = G, T S = C, G H = A, C, T B = C, G, T V = A, C, G D = A, G, T N o I= A, C, G, T

2- lunghezza dei primer La lunghezza ottimale dei primer di 20-30 basi (pi lunghi quando ricchi di A/T). Primer pi lunghi non aumentano la specificit dellamplificazione. 3-temperatura di annealing Le temperature di annealing dei due primer dovrebbero essere simili
La Tm dipende dalla lunghezza e dalla sequenza del primers. Approssimativamente: Tm = 4(G+C)+2(A+T)C T annealing ~ 2-5C al di sotto della pi bassa Tm dei due primers usati

Se la Ta dei due primers molto diversa si possono verificare amplificazioni asimmetriche o a singolo filamento.

4-sequenza La sequenza dei primer estremamente importante. -Essi devono avere un contenuto in GC simile a quello del templato, e comunque attorno al 45-50%. -E meglio evitare stretches di basi uguali, per evitare possibili strutture secondarie, che possono aumentare notevolmente la Tm. Esistono a tale proposito dei programmi che sono in grado di predire possibili strutture secondarie nelle condizioni di PCR scelte per il proprio protocollo. -Lultima base in 3 dovrebbe essere una G o una C

-Assenza di sequenze ripetute e invertite che possano far ripiegare i primer su se stessi formando un hairpin 5-GTTGACTTGATA ||||| T 3-GAACTCT In questo caso inoltre la regione 3 annealata e si impedisce lannealing al templato

-Inoltre i primer possono formare dei dimeri (primerdimers) derivati dallannealing delle regioni 3 dei primer stessi, che possono essere estesi dalla polimerasi: questi prodotti spuri competono con il templato target per lamplificazione diminuendo in questo modo lefficienza della PCR.
5-ACCGGTAGCCACGAATTCGT-3 |||||||||| 3-TGCTTAAGCACCGATGGCCA-5

Purezza e quantit del templato.

Alcuni contaminanti che si possono trovare nelle preparazioni di DNA possono diminuire lefficienza della PCR. Tra questi urea, SDS, sodio acetato, e agarosio (derivato dalla purificazione su gel del DNA). Lestrazione con solventi organici e la precipitazione del campione possono minimizzare questi problemi. Per quanto riguarda la quantit di templato occorre considerare che una quantit eccessiva pu naturalmente aumentare la quantit anche di contaminanti, e pu anche facilitare la presenza di prodotti aspecifici di amplificazione

Taq DNA polymerase

Thermus aquaticus

Tipo di enzima utilizzato.

Le caratteristiche peculiari della Taq polimerasi sono essenzialmente la capacit di essere sottoposta a continui cicli di riscaldamento e raffreddamento e di sintetizzare DNA a temperature che evitano la formazione di strutture secondarie e lannealing imperfetto e non specifico dei primers. Questo enzima molto processivo e rimane stabile per molti cicli di PCR ma poi tende a esaurirsi. Laggiunta di maggiori quantit di enzima pu talvolta aumentare lefficienza della PCR ma pu anche portare alla produzione di prodotti aspecifici.

Una caratteristica molto importante della Taq polimerasi la sua possibilit di errore (bassa fedelt) che non del tutto trascurabile, infatti misincorpora una base ogni 104. Un target di 400 bp conterr un errore nel 33% delle molecole dopo 20 cicli. La distribuzione degli errori random. Lenzima manca infatti di unattivit proofreading 3-5 nucleasica, che diminuisce la possibilit di errore in altre polimerasi. Questo rappresenta un problema in alcune situazioni, ad esempio quando si vuole clonare o sequenziare un frammento di DNA. Il problema pu essere risolto con lutilizzo di polimerasi termostabili con attivit proof-reading (Pfu e Vent polimerasi), che in genere hanno per efficienze inferiori.

Unaltra importante caratteristica di Taq pol la tendenza ad addizionare in 3 dei nucleotidi in pi, in particolare A. Questo pu essere un problema quando si vuole fare un clonaggio blunt-end in quanto le estremit dei prodotti di PCR devono essere bluntate per avere ligazione con un vettore blunt-ended. Viceversa questa propriet pu essere sfruttato nel clonaggio in vettori appositamente costruiti (TA cloning vectors). Altri enzimi termostabili possono essere utilizzati in alternativa alla Taq polimerasi

Uso di enhancers. -Alcune sostanze possono aumentare la stabilit e la processivit

dellenzima o aumentare la stringenza dellannealing. -Leffetto di queste sostanze non pu per essere facilmente predetto (ci che migliora lefficienza di una coppia di primer pu diminuire quella di unaltra coppia). -Detergenti non ionici (Triton X100,Tween20, Nonidet P40): neutralizzano le cariche di detergenti usati nella preparazione del templato. Alcune sostanze stabilizzano e aumentano lattivit della polimerasi (BSA, gelatina , glicerolo), altre aumentano la solubilit (DMSO), lammonio-solfato richiesto da alcune polimerasi, la formamide pu diminuire la Tm di dsDNA.

Parametri del termociclatore.

Ogni step della PCR richiede un certo tempo per essere efficace e al contempo un tempo eccessivo pu essere deleterio per la polimerasi. I parametri da impostare sul termociclatore dipendono essenzialmente dalla sequenza e dalla lunghezza del templato e dalla sequenza e dalla complementariet dei primer. 94C 5 min 30 cicli 94C 30 sec 50-60 C 30 sec 72C 60 sec/kb

-La fase di denaturazione in genere molto rapida (94C 30 sec) -Per certi templati ricchi in GC pu essere necessario usare temperature pi alte.

-La fase di annealing critica per lappaiamento dei primer .

TANN troppo bassa TANN troppo alta amplificazione aspecifica amplificazione con bassa resa

-Primer con un contenuto in GC<50% richiedono basse T (<55C), mentre primer ricchi in GC richiedono temperature pi alte. -Temperature troppo basse possono per facilitare la formazione di prodotti spuri. -E buona regola quindi ottimizzare la temperatura di annealing di ciascuna coppia di primer.

Ottimizzazione della temperatura di annealing

E possibile usare un termociclatore a gradiente

La fase di estensione avviene a temperatura di 72C che ottimale per la Taq polimerasi. -La durata di questa fase dipende dalla lunghezza del frammento da amplificare: la processivit dellenzima infatti di circa 1000b al minuto.

Importante anche la scelta del numero di cicli che dipende dallefficienza della PCR e dalla quantit di templato. - Mediamente vengono fatti circa 30 cicli. - Un numero eccessivo di cicli pu ridurre la specificit dellenzima. -Spesso al termine della PCR pu essere utile aggiungere un ciclo a 72C pi lungo per permettere allenzima di completare tutti gli strand (estensione finale).

AMOUN T OF DNA

Quanti cicli effettuare?

0 5 10 15 20 25 30 35 PCR CYC LE NUMB ER

-Aumentare il numero di cicli oltre 35-40 ha effetti molto piccoli -il plateau si raggiunge quando i reagenti sono consumati e la DNA polimerasi danneggiata

10

STRATEGIE per AUMENTARE la SPECIFICITA

Hot start PCR.

Poich la Taq polimerasi ha una certa attivit anche a temperatura ambiente, possono generarsi dimeri di primer e prodotti aspecifici derivati dallannealing dei primer in regioni a bassa complementariet, che riducono lefficienza di amplificazione dei prodotti specifici. Per evitare questo problema si pu seguire un protocollo detto hot-start, in cui viene omesso uno specifico reagente essenziale nella reazione (in particolare il MgCl2 o lenzima) prima di iniziare lo step di denaturazione oppure mantenendo la miscela di reazione in ghiaccio. Luso di questi accorgimenti aumenta notevolmente la specificit, la sensibilit e la resa del processo. Sono in vendit polimerasi Hot start e vari sistemi hot start (Amplitaq gold, palline di cera etc)

STRATEGIE per AUMENTARE la SPECIFICITA

PCR CLASSICA
Den. iniziale Den. iniziale 3-5 min 94C 1 ciclo Den. Ann. Den. Ann. All. 30 sec 30 sec 1 min/Kb 94C Tm(-5C) 72C 30 cicli All. 30 sec 30 sec 1 min/Kb 94C Tm(+5C) -1C/ciclo 72C 10 cicli

TOUCHDOWN PCR
3-5 min 94C 1 ciclo

Den. Ann. All. finale Mantenimento 7 min 72C 1 ciclo All.

30 sec 30 sec 1 min/Kb

94C Tm(-5C) 72C 20 cicli

4C

All. finale Mantenimento

7 min

72C

1 ciclo

4C

STRATEGIE per AUMENTARE la SPECIFICITA

NESTED PRIMER PCR
Procedura: Lamplificazione realizzata con un set di primers Il prodotto riamplificato con un set di primers interni ai precedenti
5 3 3 5 IIa PCR 3 primer. nested 5 5 3 3 5 5 3 Primer nested 5 3 Ia PCR 3 5

I prodotti non specifici amplificati nella Ia PCR non saranno amplificati nella IIa

Clonaggio di frammenti di DNA ottenuti mediante PCR. La PCR un mezzo estremamente potente per
lamplificazione di molecole di DNA anche estremamente rare.

La PCR pu essere quindi utilizzata per il clonaggio di una

sequenza di interesse in un opportuno vettore.

La Taq polimerasi ha una certa possibilit di errore, per cui i

frammenti clonati in vettori mediante PCR vanno sempre sequenziati per verificare che si tratti dellamplificato corretto.

Lefficienza del clonaggio pu essere aumentata aggiungendo

estremit adatte ai frammenti amplificati.

TA overhang cloning.
Un protocollo molto semplice di clonaggio sfrutta la capacit della Taq polimerasi di aggiungere dei residui A in coda ai prodotti di amplificazione.
5 3-A A-3 5 Siti di clonaggio multiplo

Si generano quindi delle estremit overhanging in 3che possono essere facilmente ligate in vettori che a loro volta contengono delle estremit T overhanging artificialmente prodotte.

M M

TA Cloning Kit - One-Step PCR Cloning

Description

Blunt-end cloning
Viceversa queste estremit aggiunte dalla polimerasi Taq impediscono il clonaggio blunt-end in vettori blunt-ended. Queste extra A possono essere per rimosse con il frammento Klenow della DNA polimerasi di E Coli o con la T4 DNA polimerasi. Si generano cos dei frammenti di PCR bluntended.

Clonaggio direzionale
Frammenti di DNA possono essere amplificati per PCR facendo in modo che contengano alle loro estremit 5 delle sequenze riconosciute da enzimi di restrizione compatibili con siti di restrizione che si trovano nel sito di clonaggio del vettore utilizzato. A tale scopo il frammento di DNA amplificato viene digerito con gli opportuni enzimi di restrizione, purificato e ligato nel vettore opportuno.

Amplificazione di RNA (RT-PCR).

La quantit di RNA per studi di vario tipo spesso ridotta. La PCR pu essere utilizzata per preparare grandi quantit di cDNA da utilizzare in applicazioni successive quali il clonaggio. Questa tecnica utilizza lattivit enzimatica della trascrittasi inversa, enzima che in grado di copiare una molecola di RNA in DNA complementare utilizzando come primer un oligonucleotide. Il prodotto della reazione un prodotto ibrido RNA/DNA. Dopo allontanamento dellRNA, il cDNA pu essere utilizzato come templato per lamplificazione enzimatica (PCR).

La trascrittasi inversa una DNA polimerasi RNA dipendente, codificata da retrovirus.

Esistono diversi enzimi utilizzati in biologia molecolare -Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV-RT) -Avian Myleoblastosis Virus AMV -Tth DNA polimerasi etc

Ha essenzialmente due attivit: DNA polimerasi, che viene sfruttata in laboratorio per retrotrascrivere molecole di RNA (essenzialmente mRNA) in DNA complementare. 2-RNAse H, che degrada gli ibridi DNA-RNA che si formano durante la retrotrascrizione. Viene quindi utilizzata per clonaggio di cDNA e per RT-PCR.

Nel pianificare un protocollo per lamplificazione di un RNA occorre considerare alcuni punti: -metodo di preparazione dell RNA -disegno dei primer -sintesi del primo strand del cDNA con il primer pi adatto -amplificazione enzimatica

Metodo di preparazione dell RNA contaminazione del campione di RNA con DNA genomico
La PCR non in grado di discriminare fra cDNA e DNA genomico. E opportuno trattare il campione con DNasi (da inattivare dopo 30 min!!) prima di utilizzarlo in RT-PCR. Un ulteriore controllo consiste nelleffettuare unamplificazione del campione senza retrotrascriverlo. Luso di RNA arricchito in mRNA utilizzando colonne oligodT migliora la purezza del campione. Un ulteriore accorgimento quello di scegliere come primer per la retrotrascrizione loligodT e come primer per lamplificazione oligo posizionati su due esoni diversi (pseudogeni spesso intronless e con code di poliA possono comunque essere amplificati).

Metodo di preparazione dell RNA problema della degradazione dellRNA

Usare materiale decontaminato da RNAsi!! Preparazioni da materiale fresco, uso di sostanze stabilizzanti (tipo RNAlater). Per ottenere full lenght cDNA il problema della degradazione molto importante, mentre per amplificare ampliconi piccoli si pu tollerare un certo grado di degradazione.

metodo di purificazione
Si pu utilizzare RNA totale o RNA citoplasmatico o poly(A)+RNA a seconda del target

Disegno dei primer specifici -Secondo le regole di PCR Sintesi del primo strand del cDNA con il primer pi adatto -Possono essere usati a tale scopo primer diversi in funzione di ci che si vuole ottenere -oligodT -primer specifici -esanucleotidi random
Amplifica a partire dal poliA cDNA completo Amplifica a partire dal sito del primer reverse Frammento desiderato/CDS completa Amplifica un po tutto il mRNA ma a pezzi cDNA non completo/utile nella RT-PCR quantitativa

Amplificazione enzimatica Utilizza lenzima trascrittasi inversa per trasformare la sequenza di RNA in cDNA e questa reazione seguita da PCR per amplificare il cDNA. Occorre quindi valutare la scelta dellenzima retrotrascrittasi e disegnare un protocollo di amplificazione adatti ai propri scopi.

PCR QUANTITATIVA

PCR quantitativa.
Lapplicazione di test basati sullanalisi degli acidi nucleici per, ad esempio, la diagnosi di alterazioni genetiche (duplicazioni geniche) o di infezioni virali o per lo studio dellespressione genica senza amplificazione ha generalmente lo svantaggio della bassa sensibilit delle tecniche usate: -southern blotting -northern blotting -RNAse protection assay -dot blot -in situ hybridization

La tecnologia della PCR ha aumentato enormemente la sensibilit di queste tecniche mantenendo una elevata specificit.

Nonostante ci le caratteristiche intrinseche della reazione di PCR non permettono il suo utilizzo nel formato convenzionale per quantificare gli acidi nucleici.

I fattori che contribuiscono alla elevata variabilit nellefficienza della reazione di PCR agiscono a 3 livelli: 1-preparazione del campione 2-amplificazione 3-detezione del prodotto

1-preparazione del campione

. estrazione dell RNA o del DNA e recupero (qualit del templato) . reazione di retrotrascrizione (se RNA) . manipolazione e stockaggio dei campioni da analizzare

2-amplificazione
La reazione di PCR ha una cinetica esponenziale fino al punto in cui viene raggiunta la fase di plateau, che gioca un ruolo fondamentale nel determinare la quantit del prodotto finale.

AMOUN T OF DNA 0

10

15

20

25

30

35

PCR CYC LE NUMB ER

10

La quantit finale di prodotto dipende da vari fattori quali: -cinetica di annealing dei primer -concentrazione dei diversi reagenti -numero di cicli -incompleta denaturazione del DNA -reannealing dei prodotti di PCR soprattutto negli ultimi cicli -temperature di cycling -lunghezza dei cicli -tempi di ramping -formazione di dimeri di primer -contaminanti/inibitori

3-detezione del prodotto

L analisi quantitativa della PCR pu essere fatta -in fase logaritmica
AMOUN T OF DNA 0

-in end-point

10

15

20

25

30

35

PCR CYC LE NUMB ER

10

Allinizio di una reazione di amplificazione, i reagenti sono in eccesso, templato e prodotto sono a concentrazioni talmente basse che la rinaturazione del prodotto non compete con il legame dei primer. In questo modo lamplificazione procede ad una velocit esponenziale costante. Il momento in cui la velocit di reazione cessa di essere esponenziale ed entra nella fase lineare di amplificazione estremamente variabile, anche fra replicati dello stesso campione. Sembra essere dovuto principalmente al fatto che la rinaturazione dei prodotti compete con il legame dei primer, poich laggiunta di reagenti o enzima non ha effetto. Successivamente la velocit dellamplificazione si avvicina allo zero (plateau) e viene ottenuto pochissimo prodotto. Per avere accurateza e precisione ottimali occorrerebbe considerare una quantificazione nel punto in cui ciascun campione si trova nella fase esponenziale di amplificazione.

End-point (RT)-PCR
E tuttora una tecnica ancora molto usata. Richiede per una messa a punto molto lunga e laboriosa relativamente alla determinazione del range di amplificazione esponenziale per ogni mRNA in studio, alla scelta del controllo interno e/o competitore, alla preparazione degli standard interni etc.

3 replicati dello stesso campione

Svantaggi della END-Point PCR: Bassa precisione Bassa sensibilit Range dinamico limitato (<2 log) Non automatizzata Etidio bromuro poco quantitativo, poco sensibile e poco risolutivo Processamento post-PCR

Nei 96 replicati il plateau si ottiene nello stesso punto, ma questo solo dovuto al fatto che il plot in scala logaritmica

Gli stessi replicati visti in plot lineare evidenziano invece un netta separazione dei campioni in fase di plateau. Quindi se la quantificazione fosse fatta a plateau non sarebbe corretta!!!

Le diluizioni seriali sembrano arrivare a plateau nello stesso punto anche se la fase esponenziale mostra chiaramente una differenza tra i vari punti della diluizione.

Quindi se la quantificazione fosse fatta a plateau non sarebbe corretta!!!

Real-time quantitative PCR

Teoricamente esiste una relazione quantitativa tra la quantit di campione iniziale e quantit di prodotto di PCR ad ogni dato ciclo.

La real-time PCR rileva la quantit di amplicone durante tutta la reazione. I dati vengono misurati durante la fase esponenziale, momento ottimale per analizzarli. La real-time PCR automatizza il laborioso processo di quantificazione e permette un range dinamico molto pi ampio (107)

Esistono numerosi protocolli e chimiche diverse per Real-time PCR. Sono tutti basati sulla detezione di prodotti di PCR attraverso la generazione di segnali fluorescentiQuelli usati pi frequentemente sono: TAQMAN PROBES BEACONS SYBR GREEN I primi due dipendono dalla Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) per generare il segnale fluorescente attraverso laccoppiamento di una molecola fluorescente e di un quencher. Il SybrGreen invece un colorante fluorescente che ha bassa fluorescenza in soluzione ma emette un forte segnale fluorescente legandosi a DNA a doppia elica.

FRET= fluorescence resonance energy transfer

(TaqMan probes, Molecular Beacons)

TaqMan Probes

Basata sulluso di sonde fluorogeniche disegnate per ibridare con una sequenza target e di generare un segnale che si accumula durante i cicli di PCR in maniera proporzionale alla concentrazione dei prodotti di amplificazione. Questa tecnica permette quindi di misurare il segnale durante la fase esponenziale di amplificazione. Maggiore il numero di copie di DNA iniziali, prima si ha emissione di segnale fluorescente.

PRINCIPIO DELLA TaqMan REALREAL-TIME RT RT-PCR

Il test basato sulluso del 5nuclease 5nuclease-assay: utilizza lattivit 5esonucleasica della Taq polimerasi per tagliare una sonda non estendibile durante la fase di estensione della PCR

La sonda marcata con due coloranti fluorescenti covalentemente legati alle due estremit:

-R in 5 (REPORTER) -Q in 3 (QUENCHER)

Quando viene eccitato il colorante R trasferisce energia alla molecola Q adiacente invece che emettere fluorescenza (FRET = Frster or fluorescence resonance energy transfer). Quindi la stretta vicinanza di R e Q previene lemissione della fluorescenza quando la probe intatta

Le sonde Taqman sono disegnate in modo tale che si appaiano ad una regione interna del prodotto di PCR.
Real Time PCR TaqMan

A causa della vicinanza dei due coloranti la fluorescenza emessa da R soppressa dalla presenza di Q. Durante la fase di annealing dei cicli di PCR, la probe si ibridizza specificamente al corrispondente templato. Quando la polimerasi replica il templato a cui legata la sonda Taqman, la sua attivit 5-3 esonucleasica taglia la sonda. Questa degradazione separa fisicamente R da Q e risulta in un aumento di emissione di R senza modificare lemissione di Q Lemissione di fluorescenza aumenta ad ogni ciclo in maniera proporzionale al taglio della sonda.

Real Tim e PCR TaqM an

Il segnale viene monitorato in real-time usando un sequence detector collegato ad un thermal cycler. La misurazione della fluorescenza viene fatta continuamente durante lamplificazione.

 KDORJHQ WXQJVWHQ ODPS D H[FLWDWLRQ ILOWHUV  VDPSOH SODWH

E HPLVVLRQ ILOWHUV

 LQWHQVLIL HU

 FFG GHWHF WRU    SL[HOV

ZZZELRUDGFRP

Il software del computer calcola il termine Rn che riflette la quantit di probe degradata e segue una funzione esponenziale che genera un amplification plot per ciascun campione usando lequazione:

Rn = (Rn+) (Rn-)
con Rn+ = intensit di emissione del reporter/intensit di emissione del quencer misurate in ogni istante e per ogni tubo di reazione. Rn- = intensit di emissione del reporter/intensit di emissione del quencer misurate allinizio della reazione di amplificazione e per ogni tubo di reazione.

AMPLIFICATION PLOT

Durante i primi cicli, il valore Rn rimane alla baseline. Quando una quantit sufficiente di probe stata degradata, lintensit di fluorescenza emessa da R aumenta. L amplification plot viene esaminato durante la fase log assegnando unarbitraria threshold basata sulla variabilit dei dati della baseline (generalmente viene scelta una threshold a 10 deviazioni standard sopra la baseline). Una volta fissata la threshold, il punto in cui lamplification plot la attraversa definito come Ct (threshold cycle) che inversamente proporzionale al numero di copie del target presenti inizialmente.

Threshold line = il livello di detezione o il punto nel quale la reazione raggiunge un livello di intensit di fluorescenza superiore al background. Viene definita nella fase esponenziale di amplificazione.

baseline

Threshold cycle (Ct) = il ciclo al quale ciascun campione raggiunge la threshold line

Scelta dei primer per real-time RT-PCR

(;21 

,17521 

(;21 



(;21 

(;21 

#

70

MULTIPLEX PCR
Consente lanalisi simultanea di due campioni nella stessa reazione
STRATEGIA:

Due coppie di Sonde di Ibridazione, ciascuna specifica per un prodotto di amplificazione, vengono marcate con un diverso colorante accettore che emette la fluorescenza a differenti lunghezze donda.

Fluorecseina

LC Red 640

Fluorecseina

LC Red 705

Canale 2 640 nm

Canale 3 705 nm

Il segnale emesso viene letto simultaneamente attraverso due canali di rilevamento fluorimetrico.

Trasferimento Eccitazione Emissione

Molecular Beacons
Anche i Molecular Beacons utilizzano la FRET per la detezione e la quantificazione del prodotto di PCR attraverso luso di un fluoroforo in 5 e di un quencher in 3 delloligonucleotide substrato. A differenza delle TaqMan probes, i Beacons sono disegnati per rimanere intatti durante la reazione di amplificazione. I Molecular Beacons formano uno stem stem-loop quando sono liberi in soluzione. In questo modo la stretta vicinanza di fluoroforo e quencher previene la fluorescenza. Quando un Molecular Beacon ibridizza al target, il fluoroforo e il quenche vengono separati e il fluoroforo emette fluorescenza se irradiato.

Single-stranded oligonucleotide hybridization probe Formano uno stem-loop: stretta vicinanza di R e Q in soluzione, no fluorescenza (FRET) Quando la probe incontra la molecola target forma un ibrido stabile R e Q sono separati:emissione di fluorescenza

Molecular beacons
Buona DNA specificit e basso background Difficili da disegnare Molecular beacon probes devono essere preservate durante tutti i cicli di PCR

Sybr Green
E il metodo pi semplice ed economico per fare Real-Time SybrGreen si lega a dsDNA e sotto eccitazione emette luce, quindi a mano a mano che i prodotti di PCR si accumulano, la fluorescenza aumenta. I vantaggi sono che costa poco, facile da usare e sensibile. Gli svantaggi sono relativi al fatto che SybrGreen si lega a qualsiasi dsDNA presente nella reazione, compresi i dimeri di primers e i prodotti aspecifici, il che pu indurre una sovrastima della concentrazione del target. E necessaria quindi una lunga e laboriosa ottimizzazione della reazione per evitare primer dimers e prodotti spuri.

SYBR Green lega la minor groove di double stranded DNA

E un colorante fluorescente che si lega solo al DNA a doppio filamento ed emette la fluorescenza solamente in queste condizioni.
DENATURAZIONE Non viene rilevata fluorescenza
SYBR Green Primer

ANNEALING Lintensit della fluorescenza comincia ad aumentare

Luce emessa

ALLUNGAMENTO Lintensit della fluorescenza continua ad aumentare e diventa massima al termine della fase di allungamento
Polimerasi

LAUMENTO DELLA FLUORESCENZA E REGISTRATO A 530nm

Real-time PCR Quantificazione -Assoluta -Relativa

Quantificazione assoluta (metodo della curva standard)

Si basa sullutilizzo di uno standard esterno a quantit nota (DNA plasmidico o cDNA plasmidico o RNA trascritto in vitro), la cui concentrazione viene determinata allo spettrofotometro (260 nm) e viene convertita nel numero assoluto di copie in base al peso molecolare dello standard. Diluizioni seriali dello standard vengono amplificate simultaneamente ai campioni e viene creata in questo modo una curva standard. Il Ct dei campioni viene cos confrontato con la curva standard per determinare il numero iniziale di copie.

Diluizioni seriali

QUANTIFICAZIONE del PRODOTTO di PCR

Identificando il primo ciclo della PCR in corrispondenza del quale inizia lamplificazione esponenziale del prodotto possibile quantificare la concentrazione iniziale del DNA bersaglio.
Curva di fluorescenza di campioni a concentrazione nota
Fluorescenza 106 105 104 copie

Estrapolazione della curva standard

106 105 104 copie

linea di base

Numero cicli

La linea di base identifica il ciclo in corrispondenza del quale inizia laumento esponenziale della fluorescenza per ciascun campione.

N. cicli

Log concentrazione

Riportando in grafico il valore di intersezione con la linea di base in funzione del Log della concentrazione iniziale di ciascun campione si ottiene la curva standard da cui si pu estrapolare il valore della concentrazione di campioni a titolo ignoto.

Quantificazione assoluta
Amplification plot


01



! "# ! $

%& &%'( 

)

22

Curva standard

24

Quantificazione relativa
Questo tipo di approccio viene usato soprattutto in studi di gene-expression. Lapproccio si basa sulluso di uno standard interno che in house-keeping gene (gene che non dovrebbe genere un house variare nellespressione) (reference gene).

Housekeeping genes o reference genes

Stesso numero di copie in tutte le cellule Espresso in tutte le cellule Numero medio di copie simile al target gene I pi usati sono Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) Beta-actin mRNA MHC I (major histocompatability complex I) mRNA Cyclophilin mRNA mRNAs per alcune proteine ribosomiali 28S or 18S rRNA

Metodo comparativo del Ct

La quantit del target viene normalizzata rispetto al controllo endogeno (house-keeping gene) ed espressa relativamente ad un campione basale (calibratore) che diventa il campione 1x, mentre tutte le altre quantit vengono espresse come n volte relativamente a quel campione.

Metodo della curva standard

Diluizioni seriali di DNA o cDNA vengono testate per il gene target e per lo standard interno, vengono costruite le due rispettive curve standard ed estrapolati i valori dei campioni sulle due curve; quindi la quantit del target viene normalizzata dividendola per la quantit di house-keeping gene

Il metodo comparativo detto anche metodo del 2-Ct, dove Ct = Ct campione Ct reference Il Ct campione il Ct per ogni campione normalizzato relativamente all housekeeping gene. Il Ct reference il Ct per il calibratore normalizzato relativamente all housekeeping gene.

EFFICIENZA RELATIVA DEI GENI TARGET E REFERENCE

Perch questo metodo sia applicabile, occorre che lefficienza di amplificazione del target gene e del gene endogeno housekeeping siano approssimativamente uguali. Ci pu essere stabilito verificando quanto i Ct dei due geni variano con la diluizione del templato. Se il plot della diluizione del DNA versus Ct vicino allo zero, allora lefficienza di amplificazione del target gene e dellhousekeeping gene sono molto simili.

Metodo del 22-Ct

FTX Sample Gene X Gene X Ct medio Gene X GAPDH GAPDH Ct medio GAPDH Ct Ct 2-Ct

calibratore CN A B

21.7 21.7 27.76 23.89

22.01 22.01 27.23 24.07

21.855 21.855 27.495 23.98

16.29 16.29 20.39 22.34

15.99 15.99 20.51 22.27

16.14 16.14 20.45 22.305

5.715 5.715 7.045 1.675 0 1.33 -4.04 1 0.397768 16.44982

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

Applicazioni

ANALISI di MUTAZIONI PUNTIFORMI

Sfrutta differenze nella Tm di Sonde di Ibridazione perfettamente legate al DNA bersaglio o il cui legame destabilizzato dalla presenza di basi non appaiate.

Sonda 1 marcata con Fluoresceina

Sonda 2 marcata con LC Red 640

Fluorescenza

3.0

omozigote wildtype omozigote mutante eterozigote

gene selvatico

2.5

2.0

1.5

La Sonda 1 si ibridizza alla parte della sequenza bersaglio mutata

La Sonda 2 si ibridizza alla parte della sequenza bersaglio non mutata gene mutato

50

55

60

65 70 Temperatura

75

80

0.25 0.20 0.15 -dF/dT 0.10 0.05 0.00 -0.05 50 55 60 65 70 Temperatura 75 80

Al termine della PCR si analizza la curva di melting: se presente una mutazione, la Tm dellibrido sar pi bassa che in assenza di mutazione.

Referenze
Applied Biosystems http://www.rt-pcr.com www.molecular-beacons.org http://www.ambion.com/techlib/basics/rtpcr/