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Le biotecnologie

La tecnologia del DNA ricombinante l'insieme delle tecniche di laboratorio che consentono di
isolare e tagliare brevi sequenze di DNA per trasferirle ed inserirle nel genoma di altre cellule.
Questa tecnologia permette interventi mirati, ma molto complessa dal punto di vista operativo.
Prima necessario identificare il gene, poi tagliarlo ed isolarlo dalla molecola del DNA.
Successivamente bisogna unire il gene ad un vettore, a sua volta costituito da DNA, ed infine
trasferirlo all'interno di una cellula ricevente.
Per tagliare e ricucire i geni sono necessari enzimi specifici: gli enzimi di restrizione e le ligasi.
Gli enzimi di restrizione tagliano le molecole di DNA estraneo nelle cellule batteriche, riducendole
in frammenti pi piccoli, non infettanti. Ne esistono molti tipi, ciascuno dei quali taglia il DNA a
livello di una specifica sequenza di basi, definita sequenza di riconoscimento o sito di restrizione.
La maggior parte degli enzimi di restrizione lavora riconoscendo sequenze palindrome ed operando
un taglio obliquo nel filamento di DNA. Il batterio normalmente protegge il proprio DNA attraverso
un meccanismo chiamato metilazione, in cui alcuni enzimi aggiungono un gruppo metile (-CH3) in
tutti i punti del DNA batterico che potrebbe essere riconosciuto dall'enzima di restrizione. I tratti di
DNA che si ottengono sono chiamati frammenti di restrizione.
Un sistema per separare o purificare i frammenti di DNA l'elettroforesi su gel, che utilizza il gel di
agarosio. A una delle estremit del gel si trovano delle piccole cavit verticali chiamate pozzetti.
Ogni campione, colorato da una sostanza blu, viene deposto in un pozzetto e si applica al gel un
campo elettrico. A pH neutro il DNA carico negativamente, cos i frammenti di DNA migrano
verso il polo positivo del campo elettrico. Le molecole piccole migrano pi velocemente rispetto a
quelle grandi e cos si separano. I frammenti si presentano come bande e possono essere esaminati o
rimossi singolarmente.
L'elettroforesi ci fornisce due tipi di informazione:

La dimensione dei singoli frammenti. Per determinarla si pone, nel pozzetto di fianco al
campione un marcatore costituito da DNA di dimensioni note, che serve come standard di
riferimento.
La presenza di determinate sequenze di DNA. Una sequenza pu essere messa in evidenza
attraverso l'uso di una sonda di DNA marcata con una sostanza radioattiva. Il campione di
DNA viene denaturalizzato (despiralizzato e separato in filamenti singoli) quando ancora
nel gel, successivamente verr esposto a questa sonda di DNA contenente una sequenza
complementare a quella cercata. La sonda si unir al filamento ricercato e sar quindi
possibile prelevare il frammento di DNA allo stato puro.

Gli enzimi di restrizione si utilizzano per studiare anche il genoma delle cellule eucariotiche. Il
DNA frammentato infatti ha caratteristiche diverse da persona a persona, tuttavia esistono delle
somiglianze tra consanguinei. Questa caratteristica viene chiamata polimorfismo della lunghezza
dei frammenti di restrizione. Per ottenere l'impronta genetica prima viene effettuata la digestione del
DNA in frammenti e poi l'elettroforesi su gel. I geni polimorfi si presentano in vari alleli e sono
molto adatti per distinguere i genomi dei vari individui, ci sono due tipi di polimorfismi usati:

I polimorfismi da singolo nucleotide (SNP), che sono variazioni che riguardano una singola
base
Le ripetizioni brevi in tandem, che sono tratti di DNA contenenti pi basi che si ripetono pi
volte di seguito

Non sempre possibile raggiungere dei risultati sicuri, in quanto serve una quantit minima di DNA
per effettuare la digestione e l'elettroforesi. Per questo si utilizza una tecnica che amplifica la

quantit di DNA interessata chiamata PCR.


La reazione a catena della polimerasi (PCR) un processo ciclico:

I filamenti di DNA vengono denaturati


Si aggiunge alla soluzione un breve primer artificiale, insieme ai quattro
desossiribonucleosidi trifosfati e alla DNA polimerasi
La DNA polimerasi catalizza la produzione di nuovi filamenti complementari

Questa tecnica richiede la conoscenza delle sequenze di basi all'estremit 3' di ciascun filamento per
costruire il primer complementare.
Le DNA ligasi servono per unire i frammenti di restrizione, con la tecnica del DNA ricombinante.
Molti enzimi di restrizione effettuano tagli sfalsati a livello di una sequenza di riconoscimento
palindroma, in questo modo le estremit sono a filamento singolo. Le DNA ligasi stabilizzano i
legami tra i frammenti di restrizione unendo le loro estremit.
Uno degli scopi della tecnologia del DNA ricombinante la clonazione di un particolare gene allo
scopo di poterlo analizzare per poter ottenere grosse quantit del suo prodotto proteico. In questo
caso il DNA ricombinante deve essere inserito in cellule ospiti che in seguito sono chiamate
transgeniche. Un metodo comune per riconoscerle quello di contrassegnare la sequenza inserita
con geni reporter, ovvero di geni di cui facile osservare il fenotipo e che quindi servono da
marcatori genetici per la sequenza di interesse.
Uno dei grossi problemi di quando si inserisce DNA in una cellula quello di far si che si duplichi
quando la cellula si divide, infatti serve un sito ori nel quale si legi la DNA polimerasi. Ci sono due
modi per sopperire al problema:

inserire il frammento in un cromosoma ospite in prossimit di un sito ori


entrare nella cellula ospite come parte integrante di una sequenza di DNA che possiede gi
un sito ori (vettore)

I vettori devono avere delle caratteristiche fondamentali:

essere capaci di duplicarsi in modo indipendente nella cellula ospite


possedere una sequenza di riconoscimento per un enzima di restrizione che lo possa tagliare
e combinare con il nuovo DNA
contenere un gene reporter che ne segnali la presenza nella cellula ospite
devono avere dimensioni minori del cromosoma ospite

Ci sono quindi diversi tipi di vettori:

Plasmidi: spesso contengono un'unica sequenza di riconoscimento per un enzima di


restrizione, quindi spesso un plasmide tagliato si trasforma in una molecola lineare con delle
estremit coesive. Molti plasmidi poi contengono fattori di resistenza antibiotica, quindi
possono fungere da geni reporter. Possono contenere solo geni di piccole dimensioni.
Virus: non richiedono artifici per penetrare nelle cellule ospiti, possono contenere anche
geni eucariotici.