BIOTECNOLOGIE:

Si intendono tutte le tecniche utilizzate per ricavare sostanze specifiche da esseri viventi.
Il clonaggio consiste nel produrre e ricavare tante piccole copie di DNA inserendolo in un ospite
tramite vettori molecolari.
La clonazione è invece la riproduzione agamica, naturale o artificiale, di un intero essere vivente o
di cellule, con gli stessi geni. Esempi naturali sono mitosi, scissione binaria ecc…
Tappe del clonaggio:
1. Isolamento di una parte di DNA da un intero patrimonio genetico di un organismo.
2. Inserimento di questa parte di DNA in una cellula ospite tramite vettori molecolari.
3. Moltiplicazione delle cellule ospiti.
4. Selezione delle cellule ospiti finali che effettivamente hanno sviluppato quel tratto
genetico.
Si possono usare parti di DNA qualsiasi prese dal corredo genetico oppure prendere una copia a
DNA (detta cDNA, che insieme a tutti i tratti copiati formano la biblioteca di DNA) dell’mRNA in
questo modo di hanno soltanto tratti di DNA che codificano una proteina. In modo tale che una
cellula ospite possa diventare in grado di produrre anch’essa questa proteina.
Per isolare le parti di mRNA che servono si utilizza una resina poli-T (timina) perché le parti di RNA
che non ci servono hanno una coda poli-A. filtrando la resina passeranno soltanto i tratti che ci
servono.
Per creare la cDNA si usa la trascrittasi inversa, unico enzima che da RNA passa a DNA. Scoperta
nel 1975 valse il Nobel a Baltimore e Temin.
Per inserire i cDNA all’interno di un ospite si usano dei vettori, i plasmidi, modificati dall’uomo, che
passeranno alla cellula che la resistenza agli antibiotici.
Per farlo si prende una parte del DNA plasmidico e lo si taglia a due estremità con l’endonucleasi di
restrizione.
Per saldare il collegamento tra il DNA plasmidico e il cDNA si usa la DNA ligasi che riforma il legame
tra nucleotidi adiacenti.
Per rendere complementari il cDNA e il DNA plasmidico dove è stato tagliato, si aggiungono 20
basi al cDNA chiamate linker, che permettono al cDNA di essere “tagliato” dalla endonucleasi di
restrizione in modo che le sue estremità siano compatibili con quelle del plasmide.
I batteri “contaminati” vengono sparsi su un antibiotico, sopravviveranno solo quelle che hanno
preso la resistenza all’antibiotico e di conseguenza avranno anche il cDNA. L’insieme di batteri con
cDNA formano la biblioteca a DNA.
Si può utilizzare il metodo Southern Blotting per indentificare uno specifico gene all’interno della
biblioteca di DNA:
1. Elettroforesi su gel di agarosio: Si sfrutta la negatività del DNA e il suo peso molecolare
ed applicando un campo elettrico lo si separa dal vettore.
2. Si prende il gel contenente il DNA e lo si appoggia su una nitrocellulosa dopo che è
stato reso a singola elica. Il DNA migrerà verso la nitrocellulosa.
3. La membrana viene immersa in una soluzione dove ci sarà la parte complementare del
cDNA che si vuole isolare, così quella parte di cDNA si attaccherà.
4. Mettendo in evidenza le parti complementari si nota quale clone ha il DNA che stavamo
cercando.
PCR (reazione a catena della polimerasi):
rende automatica la duplicazione di DNA utilizzando delle DNA polimerasi batteriche e
termostabili.
È un ciclo:
1. Denaturazione del cDNA a 90°C
2. Abbasso temperatura e attacco dei primer
3. DNA polimerasi specifica (resiste ai 90°C) fa partire duplicazione
4. Duplicazione fermata dalla seconda denaturazione del cDNA

CRISPR/CAS9
Consente di modificare in modo rapido ed economico una piccola e precisa sequenza del DNA.
I CRISPR sono segmenti di DNA che presentano brevi sequenze ripetute. Ogni ripetizione è
intervallata da dei distanziatori che sono derivati da virus o plasmidi.
Sono importanti perché ci sono diversi geni (Cas) che sono associati a loro, in grado di codificare
enzimi che tagliano il DNA. L’associazione CRISPR/Cas quindi è una sorta di sistema immunitario
che si occupa di eliminare elementi genetici esterni in arrivo da virus o plasmidi. Riconosciuto il
tratto di DNA estraneo il CRISPR attiva un enzima chiamato Cas (un endonucleasi) che taglia il DNA
estraneo. Riconoscono il bersaglio tramite quelle sequenze di distanziatori.
L’utilizzo nella ingegneria genetica è forte. Il genoma può esser tagliato precisamente e
rapidamente inserendo il Cas9 e i suoi rispettivi RNA guida (gRNA). Negli eucarioti si prova ad
utilizzarlo in animali più complessi dei procarioti. Si lavora non solo con il CRISPR/Cas9 ma anche
con il sistema duplicativo dell’animale. Può portare alla neutralizzazione del gene. Lo si può usare
proprio per “spegnere” un gene. Un altro meccanismo consiste nel tagliare la parte da eliminare
ed inserire al suo posto una sequenza desiderata. In questo caso si inserisce nell’organismo anche
una molecola di DNA da inserire nel genoma. Quando il Cas ha effettuato il taglio questa molecola
si inserisce e funge da stampo per richiudere il “buco” con la duplicazione.
I vantaggi sono:
- Ci vogliono mesi invece che anni;
- Non si usano DNA ulteriori a quelli voluti (per esempio per la resistenza all’antibiotico);
- La proteina Cas serve solo per effettuare il taglio, successivamente viene rimossa
dall’organismo.

ANALISI DEL DNA E DELLE PROTEINE:

per applicare le biotecnologie bisogna:
- Saper individuare la giusta sequenza di DNA;
- Sapere la funzione di una specifica sequenza di DNA;
- Identificare le proteine corrispondenti;
- Saper localizzare le proteine e i geni.
1:
Metodo di Sanger per sequenziare il DNA:
Si usano dei dideossinuclotidi, ovvero dei nucleotidi privati dell’estremità 3’ in modo che una volta
usati, la DNA polimerasi si blocchi.
Si prendono 4 provette ognuno con:
- Una sequenza di DNA che si vuole sequenziare
- Un Primer per iniziare la DNA polimerasi
- La DNA polimerasi
- I nucleotidi normali
- In ognuna delle 4 provette ci sarà poi un dideossinucleotide diverso
Ad un certo punto, per più duplicazioni la DNA polimerasi userà il dideossinucleotide invece che un
nucleotide normale e si formeranno tante catene di lunghezze diverse.
Su un gel di agarosio si fa l’elettroforesi per metterli in ordine di lunghezza. Sapendo che lo stampo
è lo stesso e qual è la parte terminale di ogni sequenza si avrà il complementare della sequenza
iniziale.
FISH:
1. Si inserisce un frammento di DNA complementare a quello che cerchiamo con un
marcatore fluorescente.
2. La “sonda” si legherà alla parte cercata.
3. Illuminato con un laser si noterà la posizione del cromosoma.
METODO WESTERN BLOTTING:
1. Separazione delle proteine su un gel;
2. Trasferimento delle proteine su una membrana;
3. Rilevazione con anticorpi della proteina specifica.
Le proteine per avere carica omogenea per il gel vengono associate al sodio-dodecil-solfato.
L proteine migrano poi sulla membrana che è positiva.
Si mette un anticorpo primario che lega la proteina  se ne mette uno secondario che lega il
primario e porta l’enzima perossidasi  la perossidasi si illumina e mostra la proteina.
METODO PEHR EDMAN:
per trovare sequenza di amminoacidi nelle proteine.
Vengono ridotte a 50-70 amminoacidi. Uno alla volta si inserisce un reagente che crea luce con un
particolare amminoacido. Facendo così più di una volta si crea la sequenza.
Limiti: solo su proteine corte, necessario ripetere molte volte la stessa cosa.
METODO LC/MS:
si digerisce la proteina e si pesa ogni molecola restante.
Si confrontano i dati trovati con quelli di un database che effettua la stessa digestione su tutte le
proteine che conosce e vede con quale ha gli stessi risultati.

OGM:
1. Per aumentarne efficienza;
2. Per aggiungere qualità che non ha;
3. Per permettere di coltivare vaccini o farmaci.
GOLDEN RICE:
Aggiunta di B-carotene. Tramite plasmidi si inseriscono dei geni appositi nell’embrione del chicco
di riso.
Per entrare nella membrana cellulare vegetale:
- Si usa un batterio in grado di entrare e gli si inietta la parte di DNA che si vuole far
arrivare.
 - Si usa un cannone genico che spara microparticelle alla membrana in modo da farle
entrare.

ANIMALI OGM:
3 metodi:
- Utilizzo di virus con il gene esogeno.
- Microiniezioni di DNA in cellule uovo fecondate.
- Utilizzo di cellule staminali in altri embrioni.
BIOTECNOLOGIE E AMBIENTE:
Produzione di energia da biomasse.
Biodegradazione di inquinanti.
BIORISANAMENTO: Possibilità di usare microorganismi per degradare sostanze tipo metalli o
idrocarburi.
BIOCOMBUSTIBILI: Sfruttamento di energia chimica di composti organici facilmente rinnovabili.

Genomica: studio del corredo genetico umano.

Progetto Genoma Umano: completato nel 2003 ed iniziato negli anni ’90 ha portato alla totale
conoscenza dell’intero corredo umano. Il 95% è non codificante.
Biologia ed etica:
Importante sapere come usare le biotecnologie:
Vantaggi:
- Sanità: più medicine e più cure in modo più sicuro.
- Agroalimentare: migliorare qualità dei prodotti;
- Industriale: migliorare qualità delle materie prime;
- Ambiente: nuovi mezzi per proteggere l’ambiente.
Quesiti Aperti:
- Come difendere Biodiversità;
- Come non creare danni agli animali;
- Come proteggere l’uomo e l’ambiente;
- Come far quadrare le richieste sociali e quelle industriali;
- Come salvaguardare i Paesi in via di sviluppo.
In Italia si possono coltivare ogm solo per scopi sperimentali.
In EU c’è un ente che dice quali si possono importare e quali no.
I VIRUS
I virus sono parassiti che si riproducono solo all’interno di cellule ospiti. All’esterno delle cellule
ospiti i virus si presentano come virioni.
Questi sono formati da un acido nucleico Ricoperto da un capside proteico e In alcuni casi un
pericapside lipidico.
I virus batteriofagi esistono in due tipi:
I virus virulenti che effettuano un ciclo litico;
I virus temperati che effettuano un ciclo lisogeno;
Il ciclo litico è così composto:
1. Il virione si lega al batterio;
2. Il DNA del virione entra all’interno della cellula;
3. Il DNA della cellula ospite viene digerito;
4. Il DNA digerito viene utilizzato per creare DNA virale;
5. La cellula ospite e trascrive le proteine necessarie per il virus;
6. I nuovi virioni formatisi vengono rilasciati e ricominciano il ciclo.
Il ciclo lisogeno è così composto:
1. Il virione Si lega al batterio;
2. Il DNA del the rione entra all’interno della cellula;
3. Il DNA del virus si integra nel DNA della cellula ospite;
4. Quando la cellula ospite si riproduce trasporta con sé anche il DNA virale;
5. Quando la cellula è troppo vecchia o cambiano le condizioni il virus entra nel ciclo litico.
I virus vengono suddivisi in base al tipo di acido nucleico presente, RNA o DNA.
I virus a DNA contengono un filamento doppio o singolo di DNA che svolgono cicli lisogeni o litici.
I virus a RNA sono composti da una molecola di RNA affilamento singolo, ne esistono di due tipi:
 Il virus dell’influenza penetra per endocitosi. Una volta all’interno il virus contiene l’enzima
necessario per la duplicazione del proprio genoma a RNA a. Il filamento di RNA virale
sintetizzato serve sia da messaggero per produrre le proteine virali, sia da stampo per
creare nuovi RNA virali.
 Il virus dell’HIV viene chiamato retrovirus e utilizza la trascrittasi inversa. Una volta dentro
la renna virale utilizza la trascrittasi inversa Per produrre DNA complementare. L’RNA virale
degenera e la trascrittasi in versa genera il secondo filamento di DNA Che entrerà nel
nucleo della cellula. Quando questo filamento di DNA verrà attivato, verrà trascritto l’RNA
virale. Quest’ultimo verrà usato in parte per creare le proteine virali e in parte uscirà dalla
cellula.
I plasmidi sono piccoli cromosomi batterici con pochi geni.
Quando un plasmide si trova all’interno di un batterio e quest’ultimo crea un canale di
coniugazione con un altro batterio, il plasmide e riesce a infettare anche il secondo batterio. Il DNA
plasmidico poi tramite crossing over riuscirà ad inserirsi nel DNA batterico.
Esistono anche i trasposoni, sequenze di DNA in grado di cambiare il sito cromosomico.
Questi vengono utilizzati per inattivare un gene o regolare una sequenza di DNA.