STRUMENTI DI BASE

DELL'INGEGNERIA GENETICA
LA MODIFICAZIONE DELLE PROPRIETÀ
GENETICHE

Con la riproduzione sessuale si ha il riassortimento del materiale genetico degli

individui che ha garantito la variabilità ma che non è prevedibile.
L'uomo ha modificato il patrimonio genetico di animali e piante coltivate per avere
caratteristiche utili quali: maggiore produzione, taglie ridotte, maturazioni scalari.
Le possibilità di intervento sono però limitate a specie affini o imparentate
filogeneticamente.
Con la genetica molecolare è possibile agire sul patrimonio genetico modificando le
combinazioni di geni in modo non realizzabile naturalmente.
GLI ANTENATI DELLE PIANTE INGEGNERIA GENETICA
COLTIVATE
Ingegneria genetica o manipolazione genetica o tecnologie del DNA
ricombinante: possibilità di avere nuove combinazioni di molecole di DNA
unendo in una molecola frammenti di DNA di origine biologica anche molto
diversa.
Organismo transgenico: un organismo che contiene il gene di un altro
organismo
Transegne: il nuovo gene
ORGANISMI
GENETICAME
NTE
MODIFICATI
TECNICHE FONDAMENTALI IMPIEGATE PER
IDENTIFICARE, AMPLIFICARE, CLONARE I GENI

La procedura di base prevede i seguenti passaggi:

1. il materiale genetico è purificato dalle cellule o tessuti
2. con gli enzimi di restrizione cioè proteine di origine batterica, si frammenta il DNA
a livello di specifiche sequenze nucleotidiche
3. i frammenti prodotti sono legati ad altre molecole di DNA che fungono da vettori;
un vettore legato a un frammento di DNA è una molecola di DNA ricombinante
4. la molecola di DNA ricombinante è trasferita in una cellula ospite in cui viene
replicata un gran numero di volte (cloni)
5. le cellule ospiti ospiti si replicano e trasmettono il DNA ricombinante alla
progenie, creano una popolazione di cellule ospiti
6. Il DNA clonato può essere recuperato da tali cellule purificato e analizzato
7. il DNA clonato può essere trascritto in RNA e poi tradotto
8. tale prodotto può essere isolato e utilizzato per ricerca o
commercializzazione
TECNOLOGIE
DEL DNA
RICOMBINANTE
ISOLAMENTO E PURIFICAZIONE DEGLI ACIDI
NUCLEICI

• Nei procarioti il 98% del DNA è presente in forma circolare nel cromosoma
batterico (DNA genomico), il 2% è dato da plasmidi
• Negli eucarioti il DNA genomico è presente in forma lineare nel nucleo come
cromosomi inoltre mitocondri e cloroplasti contengono un loro DNA
genomico in quantità minore al 0,2%
• L’RNA è presente in forme diverse RNAt, RNAm, RNAm...
L'estrazione di acidi nucleici dai vari materiali biologici prevede le seguenti fasi:
• rottura e lisi cellulare mediante centrifugazione (fase delicata perché gli acidi
nucleici non devono essere alterati). Per la digestione enzimatica si usa lisozima,
la solubilizzazione tramite detergente SDS o rottura meccanica.
• allontanamento delle membrane
• allontanamento dei lipidi, proteine, carboidrati con estrazione fenolica
• estrazione eterea per allontanare il fenolo
• allontanamento e distruzione di DNA o RNA
• precipitazione alcolica e purificazione dell'acido nucleico
PROCARIOTI EUCARIOTI
ENZIMI DI RESTRIZIONE DELLE MOLECOLE
DI DNA
• Appartengono alle idrolasi che catalizzano l'idrolisi di un legame chimico
• Sono generalmente di origine batterica, producono tagli in corrispondenza di specifiche sequenze
di basi in ciascun filamento, generando estremità 3’-OH o 5’-P
• I frammenti che si ottengono dalla digestione sono detti frammenti di restrizione
• Gli enzimi di restrizione in natura salvaguardano i batteri dall’infezione virale (fagi o
batteriofagi) infatti degradano il DNA estraneo e non quello cellulare grazie alla metilazione del
proprio DNA.
• Attualmente ci sono migliaia di enzimi di restrizione, ciascuno riconosce una sequenza specifica
di basi detta sito di restrizione/siti bersaglio lunga 4-6 coppie di basi, indicate da sequenze
palindrome
ENZIMI DI
RESTRIZIONE
 TAGLIO SU SEQUENZA
ESTREMITÀ 5’-OH, 3’-P PALINDROMA
SEQUENZE PALINDROME
Gli enzimi di restrizione permettono di tagliare il DNA in modo accurato è
riproducibile su specifiche sequenze e generano frammenti di diversa
lunghezza
La natura del taglio è molto importante possono dare tre tipi di taglio
1. con estremità piatte o tronche
2. con estremità appiccicose o sporgenti verso il 5’
3. con estremità appiccicose o sporgenti verso il 3’
RIUNIONE DEI FRAMMENTI DI DNA

• I frammenti di DNA tagliati con lo stesso enzima di restrizione tendono a

legarsi alle estremità coesive perché complementari.
• La saldatura detta ligazione tra i DNA è indispensabile per procedere con il
clonaggio molecolare, ma le estremità da legare devono essere compatibili o
coesive
• La DNA ligasi è la colla di tali frammenti, viene utilizzata universalmente la
DNA ligasi del batteriofago T4
LIGAZIONE
• La saldatura lega un DNA passeggero a una molecola di vettore
• Per aumentare la probabilità di tale legame ed evitare la chiusura del DNA, il
rapporto tra passeggero e vettore è di circa 10, in alternativa per evitare la
chiusura del taglio, si usa un enzima fosfatasi che rimuove i gruppi fosfato
dalle estremità 5’-PO4 del DNA del vettore linearizzato.
MAPPE DI RESTRIZIONE

Sono sequenze lineari di siti bersaglio determinati dagli enzimi di restrizione

Le molecole di DNA esposte a enzimi sono ridotte in frammenti di lunghezza diversa,
tali frammenti vengono separati in base alle loro dimensioni grazie a elettroforesi su gel
di agarosio.
Grazie alle cariche positive i frammenti migrano verso il polo negativo tanto più, quanto
minore sarà la loro dimensione.
I frammenti di uguale dimensione formano una banda che può essere vista sfruttando la
fluorescenza del bromuro di etidio, in tal modo si può risalire alla dimensione dei
frammenti utilizzando frammenti fluorescenti di dimensione nota.
ELETTROFORESI
SU GEL DI
AGAROSIO
ANALISI DI Enzima di
restrizione
Lunghezza
frammento
Lunghezza
frammento
Lunghezza
frammento
Lunghezza
frammento
RESTRIZIONE
EcoRI 520 1000
Bam HI 200 300 1020
EcoRI + 200 220 300 800
BamHI
Ordine 200 800 220 300
frammenti
CLONAGGIO GENICO

• Per clonaggio genico si intende l'insieme di procedimenti necessari ad inserire una

sequenza di DNA in un vettore di clonaggio che è una molecola di DNA a doppia
elica artificiale, in cui è possibile inserire un frammento di DNA esogeno in grado
di autoreplicarsi autonomamente in una cellula ospite
• ne deriva una discendenza di cellule cioè i cloni con il gene estraneo o transgene
nel proprio plasmide
• alla fine si potrà isolare una grande quantità di plasmidi e da qui purificare copie
del transgene
Le fasi prevedono:
• il trattamento del DNA donatore con un enzima di restrizione
• l'isolamento tramite elettroforesi del frammento,
• l’inserimento del gene nel plasmide vettore trattato con lo stesso enzima di restrizione,
• l'unione del frammento di DNA al plasmide grazie alla DNA ligasi, generando una chimera
plasmidica o plasmide ricombinante
• questa viene inserita nella cellula batterica ricevente
• la cellula si moltiplica col plasmide ricombinante, produce una discendenza con il transgene
che potrà essere poi isolato
SCHEMA DEL
PROCESSO DI
CLONAGGIO DI UN
GENE
VETTORI DI CLONAGGIO

Devono avere caratteristiche comuni:

• piccole dimensioni
• facilmente estraibili e purificabili
• marcatore selettivo cioè proprietà utile per selezionare i batteri che hanno incorporato il
vettore di clonaggio
• capaci di autoreplicarsi
• zona polylinker a capo
CARATTERISTICHE
DEL VETTORE
TIPI DI VETTORI

In ordine di dimensione di DNA da trasportare:

• plasmidi 10 KB (dimensione del gene di interesse)
• batteriofagi 20kb
• cosmidi 45 KB(Sono vettori ibridi derivati ​da plasmidi, contengono cos geni
del batteriofago λ. La presenza del sito finale coesivo, cos λ in un plasmide
consente al plasmide di essere confezionato in vivo in particelle virali)
• cromosomi artificiali di lievito YAC 100 KB
Altri….
• cromosomi artificiali di lievito BAC
• Vettori di espressione (aumentano l’espressione di un gene fino al 40%b delle
proteine totali. Viene attaccata alla proteina di interesse una coda che ne
facilita la purificazione)
BATTERIOFAGO COSMIDE
LIBRERIE GENOMICHE E DI C-DNA

• Tagliando un intero genoma con una nucleasi di restrizione si genera un

numero molto grande di frammenti diversi.
• Inserendo ciascuno di questi frammenti all’interno di un vettore di
clonaggio si ottiene un numero altrettanto grande di plasmidi ricombinanti e
quindi di colonie diverse.
• La frammentazione del DNA può avvenire casualmente «clonazione
shotgun», meccanicamente (onde acustiche) o per digestione enzimatica.
• L’intera collezione di plasmidi ricombinanti, all’interno delle cellule
batteriche, prende il nome di libreria genomica o libreria di cDNA a
seconda che i frammenti clonati siano derivati dal DNA genomico di un
organismo o dal DNA complementare(cDNA) ottenuto tramite
retrotrascrizione dell’RNA messaggero.
• C’è una importante differenza tra una libreria genomica e una libreria di
cDNA: la prima contiene frammenti derivati da tutto il genoma, che sono gli
stessi indipendentemente dal tessuto o dalle cellule da cui è derivato il DNA
genomico di partenza.
• Una libreria di cDNA, al contrario, contiene soltanto quelle regioni del
genoma che sono trascritte in un RNA messaggero: differenti tipi cellulari o
tessuti producono diverse combinazioni di RNA messaggeri, quindi si
otterranno differenti librerie per ogni tipo cellulare.
• Inoltre le librerie di cDNA contengono sequenze geniche non interrotte
da introni: questo aspetto risulta particolarmente vantaggioso quando si vuole
clonare DNA di un organismo eucariote, i cui geni normalmente contengono
lunghe sequenze non codificanti, che vengono eliminate dall’RNA
messaggero tramite lo splicing.
LIBRERIA GENOMICA
CLONAGGIO
DI C-DNA
TRASCRITTÀSI INVERSA
REVERSE TRANSCRIPTASE

• La trascrittasi inversa (chiamata talvolta "DNA polimerasi RNA-

dipendente") è un enzima che catalizza la trascrizione di RNA in DNA, vale
a dire l’inverso del normale processo di trascrizione.
• Si tratta quindi di una polimerasi inusuale; è stata identificata nei retrovirus,
dai quali viene utilizzata per copiare l’informazione contenuta
nel genoma retrovirale (che è costituito da RNA) in una molecola di DNA a
doppio filamento che può così integrarsi nel genoma della cellula ospite
RETROVIRUS
IBRIDAZIONE E SONDE DI ACIDI NUCLEICI

La possibilità di visualizzare la posizione dei geni o di altre regioni non

codificanti del genoma su un cromosoma (mappatura) consente anche
l’individuazione di anomalie submicroscopiche di struttura dei cromosomi.
Il DNA a doppio filamento ha la proprietà di dissociarsi, in seguito a
riscaldamento, nei singoli filamenti che lo compongono e di rinaturare in seguito
all’abbassamento della temperatura, ovvero di riassociare le due sequenze
nucleotidiche complementari di partenza (duplex) che erano state separate dalla
denaturazione.
• Si possono riassociare due filamenti di acido nucleico complementari di
diversa origine a formare duplex stabili: ibridazione.
• Il filamento utilizzato per l’ibridizzazione di un DNA bersaglio può essere un
oligonucleotide o un polinucleotide che prende il nome di sonda (probe) ed
in genere è marcato in modo da essere evidenziato.
SONDA
OLIGONUCLEOTIDI
CA
IBRIDAZIONE DEL DNA: SONDE GENETICHE

Le sonde genetiche sono filamenti a singola elica di DNA o di RNA

• ibridizzano (si uniscono) un filamento bersaglio di DNA o di RNA
• la sonda ed il bersaglio devono essere complementari, ma a seconda delle condizioni la loro
complementarità può non essere assoluta (cioè < 100 %)
• le sonde genetiche devono essere marcate altrimenti l’ibridizzazione non può essere rilevata
• le sonde genetiche possono essere utilizzate per identificare particolari sequenze
nucleotidiche. Ad esempio in medicina possono aiutare l’identificazione di microrganismi o
la diagnosi di particolari patologie
PROCEDURA IN PILLOLE

• La scelta di una sonda, ossia di una sequenza conosciuta di DNA

• La marcatura della sonda con composti fluorescenti che vengono legati ad essa
• L’allestimento dei preparati da studiare
• La denaturazione del DNA, sia dei preparati sia della sonda, per consentire successivamente la
formazione di legami idrogeno tra il filamento del DNA cromosomico e i filamento del DNA della
sonda
• L’ibridazione: appaiamento del DNA dei preparati con il DNA sonda, introdotto in eccesso
• Il lavaggio dalla sonda in eccesso non appaiata
• L’osservazione dei preparati con microscopio a fluorescenza