DNA Sequencing

La sequenza delle proteine non viene più interamente sequenziata chimicamente, la struttura viene ricavata dal
sequenziamento del gene.
Metodo di Sanger: chain termination method.

Partendo da un filamento stampo ed un primer di RNA (necessario alla DNA polimerasi), si sintetizza il filamento
complementare aggiungendo nell’ambiente di reazione una piccola quantità (10% circa) di un nucleotide di-
desossi (manca OH in 3’). La polimerizzazione quindi si interromperà a livello 3’ con il didesossinucleotide per
mancanza del gruppo -OH che opera attacco nucleofilo sul nuovo nucleotide trifosfato da aggiungere alla
catena in allungamento. (Se sostituissimo tutto un tipo di nucleotide naturale con il didesossi, i frammenti si
interromperebbero tutti alla prima inserzione di quel nucleotide). Nell’esempio viene aggiunta guanosina 5’-
trifosfato; per ragioni statistiche verranno quindi sintetizzati frammenti che si interrompono in corrispondenza
delle diverse citosine del filamento stampo, che sono separabili tramite elettroforesi su gel. Per il
sequenziamento di DNA si utilizza gel poliacrilammide a bassa concentrazione invece che agarosio, perché
garantisce una risoluzione migliore: il metodo è strettamente legato al potere risolutivo della tecnica separativa
utilizzata.
Se l’esperimento viene condotto in 4
Eppendorf ed in ognuna
aggiungiamo lo stesso filamento
stampo, lo stesso primer ma un solo
tipo di di-desossiribonucleotide
(sempre al 10% rispetto al
nucleotide naturale) + DNA-
polimerasi e Mg2+-cofattore della
polimerasi, in ogni provetta vengono
sintetizzati frammenti che
terminano tutti con lo stesso
didesossinucleotide. Si fanno
migrare paralleli su gel
elettroforetico e avremo che la
distanza percorsa da ogni frammento è inversamente
proporzionale alla sua dimensione; il frammento arrivato più
lontano sarà formato solo da 1 di-desossiribonucleotide, il
penultimo da un nucleotide normale e poi di-desossi, ecc.
Leggendo quindi dal basso i segnali dei frammenti sul gel, possiamo risalire all’esatta sequenza del filamento di
DNA (in questo caso G-G-C-T- ecc..).
Questa tecnica permette di analizzare un filamento lungo fino a 500 nucleotidi; negli ultimi 10 anni le tecniche
si sono affinate ma si basano comunque sul principio della terminazione di catena.
La poliacrilammide risulta necessaria perché bisogna discriminare l’Rf di frammenti che differiscono tra loro di
un solo nucleotide.
Nella procedura originale i di-desossiribonucleotidi sintetici venivano marcati con l’isotopo 32 del fosforo in
alfa, radioattivo, per cui ogni banda emetteva radiazione che impressionava una banda fotografica (rivelazione
delle bande).
Il metodo Sanger è stato utilizzato per il sequenziamento del genoma umano, ma per la rivelazione delle bande
al posto della radioattività è stata usata la fluorescenza (didesossinucleotidi fluorescenti, ciascuno che emette
ad una lunghezza d’onda diversa) e al posto dell’elettroforesi su poliacrilammide classica è stata usata quella
capillare.
Negli ultimi anni sono state sviluppate tecniche chiamate next generation sequency, permettendo di analizzare
500k coppie di basi per ciclo vs le 500 di Sangers; in una settimana si riesce a sequenziare tutto il genoma di un
individuo (prospettiva della medicina personalizzata).

Per sequenziare un tratto di DNA bisogna prima operarne la frammentazione.

Tecniche di frammentazione del DNA

Enzimi di restrizione: enzimi che tagliano il DNA a livello di specifiche sequenze, chiamati anche endonucleasi di
restrizione. Tagliano entrambi i filamenti.
[In natura servono a tagliare tutti i DNA che non sono dell’organismo di appartenenza. Sono quindi enzimi
difensivi fondamentali, soprattutto nei microrganismi che competono fortemente tra loro per le risorse
ambientali (tipo funghi vs. batteri). Negli organismi superiori servono ad esempio a degradare DNA non-self
introdotto con la dieta e non sufficientemente “digerito”.]
Esempi: Eco RI (Escherichia Coli, ceppo R, enzima I), Hae (Haemofilus influentiae), ecc.

Il taglio avviene in sequenze diverse ed in

modo diverso a seconda dell’enzima:
possiamo avere un taglio netto (caso Hpa
I) oppure avvenire in corrispondenza di
sequenze palindrome (Eco RI e gli altri).
In quest’ultimo caso, si generano due
frammenti che hanno uno dei due
filamenti più lunghi, detto estremità
appiccicosa.

Applicazione farmaceutica: un microrganismo patogeno produce una proteina importante per il suo
metabolismo che non è espressa o è sottoespressa nell’uomo, quindi possibile target farmaceutico. Per poterla
caratterizzare, per poterne studiare l’interazione ed il complesso con un eventuale farmaco inibitore (che sia
una piccola molecola organica o farmaco biotecnologico), e tutto l’ambaradan ad esempio tramite NMR e
cristallografia raggi X, devo riuscire ad averne una quantità consistente. Purificare la proteina dal
microrganismo ed averne una quantità sufficiente per gli studi è un processo lungo e costoso, la cosa più
conveniente è utilizzare la tecnica del DNA ricombinante e farla produrre a bioreattori. Per questo scopo è
necessario quindi conoscere il gene, isolarlo, sequenziarlo ed introdurlo in opportuno batterio, eventualmente
facendo esprimere la proteina fusa, per poter poi purificare agilmente.

Abbiamo uno o alcuni frammenti della proteina in esame, bastano anche 12 a.a., da questo oligopeptide si
risale alla sequenza genetica corrispondente (36 nucleotidi), che è possibile sintetizzare chimicamente in modo
efficiente; affiché sia poi rilevabile, viene coniugato all’estremità 5’ con un fluoroforo, oppure un nucleotide
può essere marcato con fosforo 32.
Contemporaneamente estraggo il DNA genomico del microrganismo, lo frammento con diversi enzimi di
restrizione e creo una mappa di restrizione:
si fa correre il materiale frammentato su gel di agarosio (importante, no
poliacrilammide) e quello che esce è la mappa di restrizione.
Uno o più frammenti sul gel conterranno il gene d’interesse, che ha
(ricorda) l’estremità appiccicosa perché è stato tagliato con enzimi di
restrizione.
La mappa di restrizione è come un’impronta digitale del genoma in esame:
se un gene è mutato nella sequenza di riconoscimento degli enzimi di
restrizione, inevitabilmente i frammenti generati saranno diversi dal
genotipo wild (elevato valore diagnostico: si isola il frammento
incongruente e si sequenzia per identificare la mutazione).

Parallelamente all’elettrotrasferimento e al western blotting delle proteine, anche per il DNA possiamo operare
un trasferimento delle bande elettroforetiche, molto più semplice in questo caso perché non è necessario
applicare nessuna differenza di potenziale:
tutte le bande presenti sul gel di agarosio
possono essere trasferite su un foglietto di
Immobilon (membrana di PVDF,
polivinilidenfluoruro) o nitrocellulosa
(cellulosa nitrata, acquista maggiore
carattere idrofobico) per adesione delle
due superfici messe una sopra l’altra (sotto
gel, sopra foglietto) in soluzione acquosa
alcalina, che denatura il DNA (da duplex
diventa single strand) e diffusione delle
bande da una parte all’altra. Sotto al gel e sopra al foglietto si mette carta da filtro; la soluzione risale per
capillarità attraverso la carta da filtro, arriva al gel dove denatura il DNA e se lo porta appresso fino al foglio di
immobilon/nitrocellulosa. Questo step dura tutta la notte.
Le bande del gel che abbiamo trasferito non si vedono perché non sono state colorate; è utile quindi preparare
due gel uguali, uno lo coloro e uno lo trasferisco.
Il foglietto di immobilon viene poi incubato con l’oligonucleotide sintetico marcato: questo andrà ad appaiarsi
alla sequenza complementare presente in una delle bande, ognuna contenente un solo frammento, tramite la
sua estremità appiccicosa (lo va a pescare, da cui gene fishing); esponendo ora il foglietto a lastra fotografica o
andando a registrare la fluorescenza, si identifica l’esatta banda di DNA che contiene il gene d’interesse. Il
frammento viene poi estratto, sequenziato e si identifica il gene all’interno della open reading frame, cornice di
lettura del gene tra il codone di start (AUG) ed uno di stop (UAA-UAG-UGA).
A questo punto è possibile sintetizzare il gene in laboratorio, tagliare la sequenza con un enzima di restrizione,
tagliare un plasmide con lo stesso enzima di restrizione, così le estremità si appaiano, si incuba, avviene
l’ibridizzazione del plasmide e lo si inserisce nei batteri che fanno da bioreattori.