Lezione CEEG 16.

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Le DNMT sono di due tipi:

 DNTM1, cioè la DNA metiltransferasi di mantenimento
 DNMT3A, DNMT3A2, DNMT3B che sono le così dette de novo
DNMT3L è un componente di tipo regolativo che contribuisce all’azione delle precedenti DNMT.
Gli enzimi che sono in grado di promuovere il legame del metile alla citosina possiedono tutti il dominio
catalitico di metilasi, ognuna poi avrà delle specifiche regioni che le distingueranno l’una dalle altre.
La de novo è l’enzima responsabile della metilazione sul dna che non è stato precedentemente metilato. Si
avvale di una subunità DNMT3L e molto spesso è associata con altre due proteine che sono o un’istone
deacetilasi (HDAC) o una istonemetiltransferasi (HMT). La sua attività è particolarmente stimolata da DNA
nucleosomico, ovvero DNA che è posizionato sui nucleosomi ma che sia anche modificato nella lisina 9 dalla
trimetilazione nell’istone H3. L’azione di una tale metiltransferasi in collaborazione quindi con una
metiltransferasi ed una istonedeacetilasi porta un blocco della trascrizione, quindi questi processi si
accoppiano per ottimizzare lo spegnimento trascrizionale di una specifica regione.
Gli enzimi coinvolti invece nella demetilazione, le demetilasi, sono coinvolte in un processo di modifica della
base metilata.
Meccanismo:
La 5metilcitosina viene prima convertita in 5idrossimetilcitosina, poi in 5formilcitosina ed infine in 5carbossi
citosina. Questo processo permette quindi di arrivare a questi ultimi composti che stimolano la loro
rimozione dal DNA. Quindi in presenza di questi composti la base può essere escissa dal DNA senza
interrompere l’integrità della doppia elica generando un sito abasico che viene poi riparato dal sistema
canonico di riparazione del DNA, in particolare dal BER in grado di riporre nella posizione corretta la giusta
base, in questo caso la citosina.
Sono reazioni di ossidazione che si basano sulla presenza ed il contributo dell’αchetoglutarato, il quale
viene trasformato in succinato. La sua quantità va ad intervenire nei processi di demetilazoine, infatti se si
dovesse trovare in quantità limitante o addirittura assente la reazione di demetilazione potrebbe essere
svolta in maniera poco efficiente o addirittura non essere proprio svolta.

La metilazione è la modifica epigenetica più compresa e conosciuta nonché la prima identificata come
modifica non a carico del DNA ma ne modifica lo stato funzionale

Modifica degli istoni

Le principali modifiche sono:
 Acetilazione
 Fosforilazione
 Ubiquitinazione
 Metilazione
 Ve ne sono anche altre minoritarie
L’abbondanza relativa delle modifiche è abbastanza diversa sui diversi gruppi terminali delle code istoniche.
H2A e H2B ed in parte anche H4 sono modificati ma non in maniera strettissima. H3 invece è l’istone più
modificato.
I gruppi prevalenti nelle modifiche sono:
 Metile
 Acetile
 Fosfato
 Ubiquitina
 Sumo
 Tutte le modifiche epigenetiche sono reversibili e dinamiche e possono avere differenti funzioni
biologiche. Non sono contemporanee.
Considerando le modifiche principali e la quantità di residui a disposizione si può notare che sebbene
siano comunque numeri alti quelle presenti sui diversi istoni, su H3 si ottiene un numero di
permutazioni veramente elevato indicandoci che in realtà esista una sorta di codice.

Modificatori istonici
Una modifica istonica può richiamarne un’altra, e lo si può considerare come elemento di richiamo per
una certa modifica, oppure un fattore di trascrizione può richiamare un elemento in grado di operare la
modifica come ad esempio MECP2.
Anche i long non coding RNA possono reclutare degli elementi in grado di modificare la cromatina in
quanto posseggono una capacità bivalente di riconoscere sequenze specifiche sul anche DNA grazie
alla loro componente a singola elica mentre la struttura a doppia elica può interagire selettivamente
con una proteina.
Le regioni di danno possono essere degli elementi di richiamo di modifiche istoniche. Inoltre i fattori di
trascrizione possono fungere da coregolatori quindi contribuendo con i modificatori istonici, a regolare
un certo gene.
Si possono avere quindi corepressori come le istone deacetilasi oppure coattivatori come le
istoneacetitransferasi.

Ruoli delle modifiche istoniche

 Intrinseche: Cambio di un singolo nucleosoma come ad esempio l’istone H2AX in cui viene
modificata la variante che successivamente viene fosforilata facendo sì che la regione che ha
subito un danno sa marcata e possa essere riconosciuta dal sistema di riparazione.
 Estrinseche: Modifiche che hanno a che fare con l’organizzazione della cromatina come ad
esempio l’acetilazione dell’istone H4 nella lisina k16 si è dimostrato tipica della cromatina
decondensata che quindi con una sua espulsione porterebbe invece alla formazione della fibra
da 30nm.
 Mediata da effettori: Esistono proteine che possiedono il bromodominio che sono attratte da
una modifica come l’acetilazione. Quelle che possiedono invece il cromodominio e i domini
PHD, sono in grado di legarsi alla metilazione. Infine vi sono domini 14-3-3 che sono invece
attratti dalla fosforilazione.
Si può indicare che la modificazione istonica ha a che fare con la regolazione genica e con il danno al DNA.
Nella regolazione genica può essere ottenuta da un fattore di trascrizione che richiama un corepressore che
a sua volta richiama un modificatore degli istoni. Situazione equivalente vi è per l’attivazione in cui si ha
l’intervento di una HAT che trasferisce gruppi acetili ed in alcuni casi vi è anche l’intervento di un
coattivatore.
Si può andare a vedere per esempio, il ruolo della condensazione nella mitosi. Si ha un progresso a partire
dalla formazione dei cromosomi, migrazione in piastra, l’inizio della separazione, cariocinesi fino ad una
situazione di interfase. Guardando la colorazione con DAPI si può osservare il comportamento di tutti i
componenti contenenti DNA evidenziando come quest’ultimo da abbastanza condensato diventa molto
condensato per poi andare a perdersi verso la fine della separazione dei cromosomi per poi andare verso la
dissoluzione dei cromosomi e la formazione di un nucleo interfasico.
Osservando la reazione di un anticorpo anti-istoneH3acetilato in generale, si denota che da uno stato di
acetilazione ben visibile si va verso un livello di rilevazione dell’acetilazione sempre più asso. Verso lo stadio
interfasico quindi con la destrutturazione del cromosoma si riavrà un’acetilazione ben evidente.
Principali tecniche per lo studio delle modifiche istoniche
 ChiP:
 ChiP-PCR
I complessi DNA-Proteine distribuiti lungo la molecola di DNA possono essere legati
covalentemente al DNA tramite L’uso della formaldeide. Si tratta il materiale con
ultrasuoni creando delle rotture casuali sul DNA generando frammenti di diversa
grandezza. Più è lungo il trattamento ad ultrasuoni più si avranno frammenti piccoli. Il
materiale frammentato viene sottoposto ad immunoprecipitazione utilizzando un
anticorpo con una specificità prestabilita /ad esempio contro la lisina 4 dell’H3 trimetilata).
Si immunoprecipita il tutto con un secondo anticorpo anti-anticorpo precedente ottenendo
dei complessi DNA-proteina-anticorpo.Si fa rilasciare sia l’anticorpo che la proteina
utilizzando delle condizioni decrosslinkanti per poi estrarre il DNA. Così otterrà la porzione
di DNA di interesse. Si passerà poi alla PCR per amplificare la popolazione specifica di
interesse.

 ChiP-chip
Il DNA ottenuto per immunoprecipitazione e poi reso fluorescente può essere fatto
ibridare su delle matrici contenenti oligo sintetici che sono disposti in un ordine preciso
potendo così risalire, in base alla posizione accesa, a che gene corrisponde.

 ChiP-seq
Dopo l’amplificazione del DNA si passa alla MGF per la formazione di library e si passa poi
al sequenziamento ad alta resa. Approfondimento tramite rewiev

 Spettometria di massa
In questo caso si avranno meno informazioni locali ma quelle globali saranno più dettagliate in
quanto è possibile purificare gli istoni da un certo tipo cellulare e le singole bande degli istoni
ottenute in elettroforesi possono essere sottoposte ad analisi spettrofotometrica ricavando così il
peso molecolare e poi stabilire la frammentazione proteolitica delle varie componenti istoniche
possiede il peso giusto. Se così non fosse si riesce, tramite una procedura computerizzata a definire
quale modifica sia intervenuta.
Chi-seq vs. ChiP-chip
I picchi che si ottengono per esempio per H3K4me3 sono di fatto corrispondenti tra le due tecniche anche
se la ChiP-chip è oramai poco utilizzata.

ATAC-seq
Si ha l’azione indiretta di una trasposasi che inserisce il proprio genoma all’interno del DNA della
popolazione in esame. La trasposasi potrà agire su un certo tratto di DNA esclusivamente se questo è libero
dai nucleosomi. Una volta che sarà stato possibile inserire il DNA lungo tutto il genoma si passerà al
sequenziamento così da ricostruire le posizioni in cui il frammento è stato inserito indicando che i punti in
cui il sistema trasposasi sia riuscito a portare il segmento da inserire sono liberi da istoni.

La posizione degli istoni rispetto ad una sequenza di DNA non può essere assoluta in quanto istoni associati
ad un certo tratto di DNA viene sfruttato il parametro di curvabilità. Quest’ultima è dovuta al fatto che sulle
sequenze nucleosomiche il DNA non ha una sequenza casuale ma si è visto come vi sia una distribuzione
piuttosto ricorrente di gruppi AT verso ‘esterno e GC verso l’interno. La disposizione di questi gruppi si
associa al concetto di parametro rotazionale sul DNA in quanto la doppia elica presenta una stessa faccia
con lo stesso gruppo di nucleotidi faccia ogni 10 nucleotidi (AT e GC è una semplificazione!). In base a
questo si evince che i nucleosomi possono essere vicini l’uno all’altro, in popolazioni diverse, con la stessa
affinità ma con lo shift di 10 nucleotidi quindi questo andrà ad influire sulla misurazione del posizionamento
dei nucleosomi che non saranno mai perfette.

Modificazioni specifiche degli istoni

Acetilazione delle lisine
Avviene sui 4 istoni core ed H1 anche se su quest’ultimo non si hanno ancora molti dati.
I residui che vengono acetilati in H2A sono la lisina 5,9 e 13 ; In H2B 5,12,15 e 20 ecc
Non vengono acetilate tutte le lisine.
L’azione di acetilazione non è esclusiva della coda ma anche di alcuni residui del core. Gli enzimi che fanno
parte dei complessi di modifica raramente agiscono da soli e possono modificare anche più residui.
L’acetilazione è la modifica che meglio si associa all’attivazione trascrizionale a differenza ad esempio della
metilazione la quale può essere associata sia ad attivazione che repressione trascrizionale.
Oltra all’attivazione trascrizionale, l’acetilazione, è associata anche all’assemblaggio della cromatina e alla
riparazione del DNA

Istone acetil transferasi

HAT-1 che sono citoplasmatiche quindi in genere non si occupano degli istoni ad eccezione di quelli di
nuova sintesi modificati tipicamente nel residuo H3K56 in modo poi di essere riconosciuti dai sistemi di
assemblaggio della cromatina

Superfamiglie
1. GNAT: ad essa appartiene una delle HAT più conosciute cioè la gcn5
2. MYST tra queste vi sono le sas
3. P300 è una tipica HAT dei multicellulari
4. Rtt109 è proprio dei funghi
C’è una certa similarità nel core strutturale, quello preposto all’acetilazione e tutte queste proteine sono in
grado di utilizzare anche substrati non istonici infatti la nomenclatura HAT è stata convertita in KAT cioè da
istone acetiltransferasi a lisina acetil transferasi.
Vi sono però tra loro differenze nella sequenza, meccanismo d’azione e nell’interazione con dei partner cioè
proteine di regolazione.

Istone deacetilasi
E’ la controparte delle HAT. Anch’esse hanno attivata che non è esclusivamente sugli istoni.
Sono organizzate in complessi multienzimatici e sono attivi sulle code amminoterminali degli istoni ed altre
strutture proteiche.

Superfamiglie
1. Classe 1:RPD3-Like, sono prevalentemente nucleari
2. Classa 2: HDA1-Like, possono trovarsi sia nel nucleo che nel citoplasma
3. Classe 3: Sir-Like, prendono il nome di sirtuine. A differenza delle altre due classi sono NAD-
dipendenti. Il NAD in questo caso non viene utilizzato come cofattore ma è un componente della
reazione in quanto il gruppo acetile viene trasferito sulla molecola di NAD e quindi per ogni gruppo
che viene acetilato si consuma una molecola di NAD a formare il 2-o-acetilribosio.
La presenza di NAD+ è legata al buon nutrimento della cellula, infatti ad alto contenuto di NAD+ si
avrà un basso contenuto di glucosio mentre se si ha la conversione a NADH e suo accumulo le
sirtuine non potranno funzionare avendo bisogno di NAD ed inoltre indicherà l’alta concentrazione
di glucosio.
Classe 1 e classe 2 agiscono sul substrato senza intermediari.
Ruolo del’acetilazione
Con la deacetilazione si riduce la carica e quindi l’interazione DNA-istoni che previene la formazione della
fibra da 30nm che è quindi più deacetilata rispetto a quella da 10 che è invece iperacetilata.
Sulla cromatina acetilata vengono reclutati una serie di fattori. Come per la metilazione, l’acetilazione è in
grado di richiamare altra acetilasi (HAT, GCN5 o P300) e viene richiamato anche il complesso SWI/SNF che è
un complesso di rimodellamento. In genere questi sono degli attivatori faacendi paziozio ai fattori di
trascrizione.
Vi può essere una competizione con altri tipi di modifica come ad esempio con H3K27me3 che è piuttosto
prona verso l’inattivazione a differenza di H3K27ac.
Nel grafico sono state messe in relazione lo stato di acetilazione con la funzionalità di determinate regioni,
in particolare l’inizio della trascrizione.
Ci si aspetta di trovarmi l’RNApol2 ed infatti seguendo i colori si vede come la classe P1 che è quella meno
espressa possiede una bassa quantità polimerasi che cresce andando verso classi di trascrizione maggiori.
Nel punto di inizio della trascrizione è invariante e sempre più bassa la quantità di H3 indicando che
tendenzialmente un gene trascrizionalmente attivo non possiede molto H3 sul puto di inizio, quindi il punto
di inizio della trascrizione è abbastanza sgombro dai nucleosomi.
Se si misura l’acetilazione di H3 del punto di inizio di trascrizione si evidenzia come non solo va con lo stato
trascrizionale ma che si distribuisce sia a monte che a valle ma vi è sempre una depressione al centro.
Guardando H4, la porzione acetilata è un po' meno rilevante rispetto a quella di H3.
Se invece si osserva il promotore, si nota che in esso si accumula l’acetiltransferasi p300, acetilazione di H3
ed H4.

Effetti delle modificazioni

Tra gli effetti principali vi è, come già detto, capacità di attenuare la portata della carica delle lisine
rendendo il DNA meno coeso con il nucleo degli istoni, facendo così si vanno anche a rendere
maggiormente disponibili le code istoniche per interazioni con altre proteine.
E’ stato svolto un esperimento per chiarire l’importanza dell’acetilazione nello scompattamento della
cromatina. Esso consiste nella somministrazione, a delle cellule, di due tipologie di destrano cioè destrano
da 42 KDa e da 460 KDa.
Il destrano si può ottenere ad alta polimerizzazione o bassa polimerizzazione ottenendo quindi particelle
piccole o grandi. Quando le cellule in condizione normale sono state trattate con particelle di destrano si
vede come la distribuzione di queste non è completamente casuale, infatti vi sono regioni permeabili solo a
particelle piccole, altre a contenuto misto e di nuovo regioni permeabili a quelle piccole. Ciò evidenzia
come la compattezza del materiale genetico all’interno di una normale cellula non è omogenea.
Se si va a trattare le cellule con la tricostatina, un inibitore delle istonedeacetilasi aumenta lo stato globale
di acetilazione facendo variare così il comportamento alla permeabilità delle particelle di destrano
portando ad una distribuzione quasi omogenea. Questo suggerisce che a compattezza di certe regioni
rispetto ad altre è basato sullo stato di deacetilazione.