Meccanismi epigenetici

Biologia
Università degli Studi di Roma La Sapienza (UNIROMA1)
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MUTAZIONI GENETICHE E POLIMORFISMI DEL DNA
29-11-21
La causa fondamentale dell’esistenza di alleli diversi per la maggior parte dei nostri geni è
l’esistenza di processi che causano errori nella conservazione dell’integrità del materiale genetico,
che sono detti mutazioni. Durante la vita della cellula o nel processo di gametogenesi possono
insorgere delle mutazioni del DNA, variazioni trasmissibili delle sequenze del DNA, che pur essendo
trasmesso in maniera pressoché stabile da una generazione all’altra, grazie alla sua struttura, va
incontro raramente a queste variazioni.
Una variazione genetica può verificarsi in una cellula somatica dell’organismo e questa può portare
alla morte della cellula, perché viene prodotto un fenotipo non compatibile con la vita, oppure
all’insorgenza di tumori con il processo di carcinogenesi, che le trasforma in cellule tumorali. Una
mutazione che avviene in una cellula somatica non è trasmissibile in alcun caso alla progenie.
Le mutazioni che invece insorgono nelle cellule germinali durante il processo di gametogenesi
possono avere un effetto fenotipico sulla progenie. Le patologie genetiche sono dovute
all’insorgenza di nuove mutazioni nelle cellule germinali della generazione parentali: i soggetti che
ne sono affetti sono definiti mutanti.
Le variazioni di sequenze del DNA possono essere di due tipi:
● Mutazioni genetiche se riguardano brevi tratti cromosomici, fino alla variazione del singolo
nucleotide o della singola coppia di basi;
● Mutazioni genomiche, riguardano aree piu estese e possono riguardare nel caso limite un
intero cromosoma.
Conseguenze fenotipiche delle mutazioni
Le mutazioni possono avere delle frequenze fenotipiche: possono insorgere naturalmente per errori
di diversi processi cellulari, dalla replicazione del DNA nei processi meiotici, ma possono essere
anche indotte e aumentare di frequenza con la presenza di mutageni che possono essere chimici o
fisici: si tratta di sostanze o anche radiazioni che possono aumentare la frequenza con cui possono
essere portate delle variazioni a carico del DNA. I mutageni hanno la caratteristica di colpire sia le
cellule somatiche che le cellule germinali, producendo sia danni fisici, compresi tumori, sia danni
che possono essere trasmessi alla progenie. Una mutazione è definita come un qualunque errore di
copiatura del DNA o meiotico che sia trasmesso alle cellule figlie, quindi una condizione ereditaria,
da una cellula all’altra o da una generazione all’altra.
Le mutazioni possono avere frequenze fenotipiche, perché se la mutazione colpisce un gene nella
sua regione codificante allora può essere modificato il messaggio genetico portato da quel gene e si
possono ottenere delle proteine diverse rispetto a quelle normali, prodotte in precedenza rispetto
all’insorgenza della mutazione. Le proteine prodotte dai geni non mutati sono denominate wild type,
selvatiche; quando avvengono delle mutazioni queste prendono nomi specifici che possono derivare
anche dal fenotipo prodotto.

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 ● Un gene normale viene trascritto e tradotto in una proteina normale, wild type, portando ad
un’espressione fenotipica normale;
● Un gene mutato invece, una volta che viene trascritto e tradotto si produce una proteina
anomala o assente, portando ad un’espressione fenotipica alterata.
Tipi di mutazioni puntiformi
Sono molto limitate e possono includere un solo nucleotide o una coppia di base. Questi errori si
verificano generalmente durante la replicazione del DNA, quando c’è un errato appaiamento tra la
base del filamento nascente di DNA e la base complementare che funge da stampo; questo può
produrre delle mutazioni o per sostituzione di base, in cui su un filamento mutato è presente un
nucleotide diverso rispetto al wild type, o per inserzione/delezione di base, si producono dei
filamenti che hanno 1 o più nucleotidi in più o in meno rispetto al filamento selvatico. Nelle nostre
cellule sono presenti dei sistemi di correzione degli errori che rimuovono la maggior parte di questi
errori, però alcune mutazioni non sono corrette e vengono trasmesse alle cellule figlie.
Quando si verifica una mancata conseguenza fenotipica significa che il codice genetico è
degenerato.

● Sequenza selvatica: Se la sequenza rimane selvatica, quindi intatta e normale, originerà una
proteina wild type;
● Mutazione missenso: La sostituzione di uno dei nucleotidi porta alla generazione di una
tripletta di basi (codone) diversa, che può portare, in fase di traduzione, alla generazione di
una proteina con un amminoacido diverso rispetto alla corrispettiva proteina wild type;
quando questo avviene la mutazione viene detta missenso, perché cambia il significato del
codone e di conseguenza l’amminoacido da esso codificato; se ad esempio l’amminoacido
mutato risiede in una regione funzionalmente importante di una proteina, ad esempio nel sito
attivo di un enzima, si vedrà un cambiamento nell’attività enzimatica e un conseguenze effetto
fenotipico;
● Mutazione silente: avviene sempre mediante la sostituzione di un nucleotide con uno di tipo
diverso, ma il codone risultante in questo caso codifica per lo stesso amminoacido presente
nella proteina originale; di conseguenza nella proteina non ci sarà alcun effetto perché sarà
mantenuto lo stesso amminoacido, e la mutazione non avrà effetti fenotipici;
● Mutazione nonsenso: mutazioni più gravi di quelle precedenti. La sostituzione del nucleotide
trasforma un codone che precedentemente codificava un amminoacido in un codone di stop:
questo porta, in fase di sintesi, la terminazione precoce della produzione della proteina, e si
produce una proteina più corta di quella wild type: se la parte esclusa dall’insorgenza della
mutazione comprende il sito attivo della proteina o siti di riconoscimento della proteina con

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 altri fattori, si possono avere conseguenze fenotipiche anche gravi, mentre se sono esclusi
solo alcuni codoni la mutazione può anche non avere grosse conseguenze fenotipiche.
● Frameshift per delezione/inserzione: quando viene inserito o rimosso un nucleotide nella
catena avviene il cosiddetto frameshift: cambia la “cornice di lettura” delle triplette; nel codice
genetico non è presente una separazione tra i codoni, e ciò che fa sì che vengano letti
correttamente è la loro lettura in triplette da parte degli anticodoni dei tRNA: quando però
viene inserito o rimosso un nucleotide avviene uno scorrimento dei nucleotidi nelle triplette
successive, che porta ad uno stravolgimento totale della proteina risultante. Questo può
portare alla produzione accidentale o di un codone di stop, che porta la proteina a diventare
più corta, o a quella di tutta una serie di amminoacidi completamente diversi da quelli della
proteina wt, ottenendo una proteina completamente diversa. Questo tipo di modificazioni
quindi hanno i più profondi effetti fenotipici.
Polimorfismi del DNA
Si tratta di mutazioni genetiche neutre con effetto fenotipico moderato, che quindi non causano
malattie genetiche. La presenza di questi polimorfismi del DNA è importante dal punto di vista delle
attività dei nostri neuroni perché molti polimorfismi riguardano il nostro comportamenti: esistono
molto geni definiti polimorfici che influenzano le attività neuronali, che vanno a determinare il nostro
comportamento, il cui studio è importante ai fini della comprensione degli aspetti genetici del
comportamento.
Un polimorfismo del DNA è una variazione allelica di un certo gene, la presenza di alleli diversi per
un certo gene, che hanno una frequenza tale che il minore degli alleli presenti nella popolazione ha
una frequenza maggiore dell’1%, maggiore della percentuale che avrebbero semplici mutazioni che
avvengono casualmente per ogni generazione. Un locus caratterizzato dalla presenza di più alleli è
definito polimorfico. La presenza di polimorfismi genera variabilità genetica.
Analizzando la sequenza dei cromosomi si nota che in genere tra un individuo e l’altro è presente
una variazione ogni 1000 nucleotidi; tra una popolazione d individui della stessa specie quindi esiste
una grande variabilità genetica. Gli alleli con valori inferiori all’1% invece sono definiti varianti rare,
che comprendono mutazioni letali che causano malattie genetiche, come la fenilchetonuria, la fibrosi
cistica…
I polimorfismi quindi si riferiscono a variazioni con mutazioni neutre; mutazioni che provocano
malattie genetiche invece costituiscono delle varianti rare.
Tipi di polimorfismi
1. Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP): polimorfismi di lunghezza dei
frammenti di restrizione;
2. Single Nucleotide Polymorphisms (SNP): polimorfismi a singolo nucleotide;
3. Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) e Short Tandem Repeats (STR): ripetizione
tandem a numero variabile; ripetizioni tandem corte.
Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP)
I frammenti di restrizione sono prodotti da un taglio enzimatico prodotto con enzimi di restrizione,
enzimi di derivazione batterica che tagliano il DNA quando riconoscono delle brevi sequenze ben
precise; ogni sito di restrizione ha una sequenza precisa, e nel nostro DNA si può analizzare la
presenza di vari di questi siti. Se quindi si prende il DNA di un soggetto e lo si sottopone all’azione
dell’enzima di restrizione di derivazione batterica, vediamo che questa regione cromosomica sarà
tagliata in vari punti.

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 ● Nello schema la sequenza originale viene tagliata in tre punti dall’enzima, generando due
frammenti di diversa lunghezza che possono essere separati in laboratorio ponendoli in un gel
attraversato da un potenziale elettrico; essendo il DNA nel suo complesso di carica negativa,
tenderà ad andare verso il polo elettrico positivo, il frammento più piccolo con più rapidità
rispetto a quello più grande, che incontra un maggiore attrito da parte del gel in cui è
immerso;
● Se invece si modifica la sequenza del sito di restrizione centrale si otterrà un solo frammento,
separato dalla sequenza dai siti di restrizione laterali.
Questi polimorfismi si verificano generalmente in tratti cromosomici non codificanti, molto comuni
nei tratti intergenici che separano un gene dall’altro. Si tratta di polimorfismi biallelici perché il
polimorfismo è dato dalla presenza o assenza del sito di restrizione:
● Quindi se un individuo ha il sito di restrizione presente in entrambi i cromosomi è detto
omozigote per la presenza;
● Se ha il sito assente in entrambi i cromosomi è omozigote in assenza del sito;
● Se un cromosoma porta il sito e l’altro no l’individuo è eterozigote.
Single Nucleotide Polymorphisms (SNP)
Nel nostro genoma sono presenti almeno 3 milioni di queste variazioni a singolo nucleotide. È una
mutazione molto simile alle mutazioni per sostituzione di base, che vanno a costituire dei
polimorfismi biallelici. Questi SNP possono essere presenti sia nelle regioni codificanti che nei
promotori dei geni, ma anche nelle regioni intergeniche. Sono tra i geni più associati a disturbi
comportamentali e tratti di personalità: ad esempio i geni dei recettori della dopamina sono
caratterizzati dalla presenza di numerosi polimorfismi a singolo nucleotide. In alcuni casi i SNP
possono essere identificati anche usando degli enzimi di restrizione, ma il metodo più efficace per
identificarli è attraverso una tecnica definita Polymerase Chain Reaction (PCR): è una reazione che
ha il significato di reazione a catena della polimerasi, laddove la polimerasi è una DNA polimerasi
termoresistente, perché c’è un ciclo di reazioni che viene utilizzato per ogni applicazione del PCR:
● Si porta il campione di DNA a 95°C, lo si fa poi scendere a 55°C, per poi farlo salire a 72°C;
● Lo scopo di queste reazione è, a partire da poche unità di materiale genetico, anche da
cromosomi estratti da una singola cellula, ottenere attraverso vari cicli una quantità
esponenzialmente crescente dello stesso frammento di DNA;
● Queste quantità crescenti saranno poi utili all’analisi della sequenza del frammento, che può
essere effettuata con una tecnica di sequenziamento normale oppure l’analisi del frammento
con un enzima di restrizione.
● Nella PCR il DNA originale viene denaturato, ovvero si fanno separare i due filamenti;
● Una volta che i filamenti sono separati si aggiungono alla soluzione delle corte sequenze di

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 DNA a singolo filamento che fungono da primer per l’azione della taq polimerasi;
● Una volta che si aggiungono i primer bisogna abbassare la temperatura, perché i primer a
95°C non riuscirebbero a formare i legami idrogeni specifici con le sequenze riconosciute. Si
abbassa quindi la temperatura ad un livello tale che questo riconoscimento è permesso;
● Quando avviene il legame del primer con i siti complementari si può elevare nuovamente la
temperatura al valore ottimale per l’azione della taq polimerasi (72°C);
● A questa temperatura la taq polimerasi sintetizza i filamenti mancanti a partire dall’estremità
3’ del primer, fino alla fine del filamento all’estremità 5’;
● Il filamento neosintentizzato corrisponde a quello che funge da stampo;
● Da questo primo ciclo si passa da 1 frammento di interesse a 2 copie dello stesso frammento;
i due primer vengono scelti in maniera da delimitare con le loro sequenze il frammento di DNA
che si vorrà studiare una volta ottenuta una quantità sufficiente di DNA specifico.
● Di norma si effettuano vari cambi ciclici di temperatura con una provetta già fornita di tutti i
reagenti necessari, e ogni volta che serve arrivano reagenti già presenti nella soluzione.
● Al secondo ciclo da due stampi si ottengono 4 nuovi filamenti completi di DNA; al terzo 8
filamenti; al quarto 16. Se si ripete questo ciclo 20, 30, 40 volte si avrà alla fine una provetta
che contiene una quantità enorme di DNA relativo al frammento che si vuole analizzare, che si
potrà successivamente sequenziare o sottoporre al taglio enzimatico per genotipare un
individuo relativamente al suo SNP.
Polimorfismi a ripetizione di sequenze (VNTR-STR)
Questo tipo di polimorfismi riguarda la presenza di numeri variabili di ripetizioni tandem:
● VNTR: ripetizioni da 6 a 50 nucleotidi: minisatelliti ipervariabili; presenti nelle regioni
centromeriche, ma anche nei telomeri, che contengono ripetizioni di 6 nucleotidi;
● STR: ripetizioni di 2, 3, 4 basi, sono ripetizioni tandem corte.
Queste si identificano attraverso la PCR con dei primer che sono esterni alla regione che contiene
queste ripetizioni; poiché il numero di ripetizioni è diverso tra individui, questi polimorfismi sono
multiallelici: non sono biallelici, come nel caso dei RFLP o degli SNP. In questo caso un cromosoma
può portare 20 ripetizioni, un altro 30, un altro 10, per cui nella popolazione sono presenti tanti tipi
diversi di cromosomi, ciascuno caratterizzato dal suo numero specifico di ripetizioni.
Poiché è molto difficile che due individui che appartengono a famiglie diverse abbiano lo stesso
numero di ripetizioni (sono polimorfismi che danno alta variabilità), l’analisi di questi polimorfismi è
utile in medicina legale o anche per l’analisi di paternità, perché due individui fra loro imparentati
avranno lo stesso numero di alleli in queste regioni polimorfiche.
Questi polimorfismi riguardano anche geni che possono influenzare il nostro comportamento:
● Alcuni recettori della dopamina;
● Recettori per gli ormoni steroidi, ad esempio recettori degli androgeni, recettore β degli
estrogeni;
● Gene CYP che codifica l’enzima aromatasi, enzima che nelle cellule endocrine o nelle cellule
che producono ormoni steroidi (come le cellule follicolari), trasforma gli androgeni gli
estrogeni: è fondamentale nel ciclo riproduttivo femminile, poiché il follicolo inizialmente
produce androgeni, che vengono successivamente trasformati in estrogeni (la mancata
produzione dell’enzima porta all’ovaio policistico, ad un iperandrogenismo femminile, con
mancata ovulazione e cisti ovariche); sono enzimi fondamentali anche durante lo sviluppo
fetale per lo sviluppo delle caratteristiche di mascolinità di un embrione XY, anche a livello
cerebrale.

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Conseguenza della presenza di sequenze ripetute
Queste sequenze causano durante la divisione meiotica un errato appaiamento dei cromosomi
omologhi, perché quando ci sono delle sequenze ripetute il modulo di appaiamento può essere
sfalsato; quando ciò avviene, e se c’è crossing over all’interno di questa regione, si genera un
processo particolare di ricombinazione definito crossing over ineguale: porta a produrre da una
parte un cromosoma con meno ripetizioni, ma dall’altra a produrre un cromosoma con un numero
ancora più elevato di ripetizioni, quindi ad un’espansione delle ripetizioni, che può diventare
patologica e produrre alcune patologie anche gravi: la sindrome dell’X fragile o anche la Corea di
Huntington.
Dal punto di vista delle mappe cromosomiche l’identificazione di questi polimorfismi è fondamentale
perché questi polimorfismi, mappati lungo i nostri cromosomi, rappresentano dei marcatori
molecolari, fondamentali per costituire mappe genetiche dei cromosomi umani. I marcatori
molecolari vanno ad indicare particolari regioni cromosomiche che vanno analizzate quando si va a
studiare l’ereditarietà di qualunque condizione genetica in una famiglia nella quale ci sono diversi
individui portatori o affetti dalla condizione, anche quando si tratta di patologie psichiatriche o di
tratti comportamentali o fisici.
Una volta che viene localizzato il marcatore molecolare, che si trova presente sempre nella stessa
variante negli individui affetti, questo marcatore viene utilizzato per individuare adiacentemente ad
esso dei loci che possono essere asociati alla condizione genetica; si effettua quindi un’analisi di
linked, cioè un’associazione fra la condizione genetica e i loci ad essa associati, e questo viene
effettuato all’interno della famiglia.
Lo studio di questo tipo di associazione genetica può essere utilizzato per definire degli alleli
particolari fra loro strettamente associati, molto vicini, che non vengono sottoposti a separazione
mediante crossing over durante i processi di crossing over: rappresentano quindi un linkage
disequilibrium, un disequilibrio di associazione; quando due loci sono sempre associati fra di loro,
quindi ereditati come un blocco, vanno a definire ciò che viene chiamato aplotipo, concetto
fondamentale per definire certi quadri di ereditarietà umana.
Al linkage segue l’identificazione dei loci, che fa tesoro dei dati ottenuti col sequenziamento
completo del nostro genoma, ottenuto nel 2003; si va a confrontare le mappe di un particolare tratto
cromosomico con la sequenza nucleotidica di quel tratto, che permette di localizzare geni contenuti
in quel tratto, e permette di analizzare un’eventuale contributo di questi geni alla condizione
genetica che si sta analizzando. Queste informazioni sono fondamentali nel caso di genotipi e
fenotipi complessi, anche nel caso di condizioni patologiche psichiatriche e di determinati tratti
comportamentali, per comprendere il rapporto che c’è fra il genotipo e l’espressione genetica del
carattere.

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