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Lezione 07 (16-03-07) oncologia

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Oncologia, 16 marzo 2007 Anna Martucci Nelle lezioni precedenti abbiamo visto come il cancro possa considerarsi una

serie di eventi che comportano alterazioni genetiche, molte delle quali sono dovute all'influenza di fattori ambientali. Agenti di natura chimica ,fisica o biologica. I fattori ambientali sono responsabili della maggior parte dei tumori. E' noto tuttavia che esistono dei cluster familiari dove, più frequentemente rispetto alla popolazione normale, si verifica l'insorgenza di particolari tipi di tumori. Nel caso dei carcinomi polmonari, è ormai abbastanza evidente che il fumo , e tutte le sostanze cancerogene in esso presenti, dagli idrocarburi policiclici ai nitrosocomposti, alla semplice irritazione cronica dovuta alla combustione del tabacco, e quindi situazioni che portano ad ipossia, sono tutte situazioni che in qualche modo favoriscono l'insorgenza di questi tumori. La suscettibilità cancerogena del soggetto fumatore può combinarsi con una predisposizione genetica che rende più precoce l'insorgenza del processo tumorale. Spesso questo dato è confortato dalla rilevazione della medesima predisposizione fra i componenti del gruppo familiare esposto all'azione cancerogena del fumo. Quindi va bene l'agente ambientale, ma evidentemente qualcosa nel corredo genetico in certi individui fa si che i tumori possano svilupparsi più frequentemente. Uno di questi esempi , abbastanza evidente, è dovuto alla presenza di particolare polimorfismi che coinvolgono per esempio il sistema farmaco metabolico, certe isoforme del citocromo p450, che sono in qualche modo espresse diversamente in questi individui e siccome queste particolari isoforme del p450 sono coinvolte nel metabolismo del Benzopyrene, probabilmente il fatto che questi individui sviluppino più cancro è dovuto al fatto che metabolizzano il benzopyrene nel metabolita cancerogeno in maniera diversa rispetto alla popolazione generale. FATTORI DI RISCHIO GENETICO: •tumori ereditati in forma autosomica dominante •tumori da difetti nel sistema di riparo del Dna •tumori familiari Per quanto riguarda i fattori di rischio genetico, questi possono presentarsi in forme diverse. Abbiamo dei tumori ereditari che si esprimono in forma autosomica dominante e in questo caso è relativamente facile identificare il gene la cui mutazione è direttamente correlata a quel tipo di tumore. Ci sono poi dei tumori che sono dovuti a delle mutazioni a carico di geni che codificano per i sistemi di riparazione del DNA. Quindi sono geni che non sono direttamente coinvolti nella proliferazione delle cellule o nel regolare processi di morte fisiologica come l'apoptosi, ma svolgono un effetto indiretto perché facendo in modo che il dna non venga riparato in modo corretto non si fa altro che aumentare la probabilità che insorgano mutazioni, alcune delle quali alla fine saranno direttamente coinvolte, per esempio nella proliferazione cellulare. Quindi creano quella situazione detta INSTABILITA' GENOMICA. Si hanno inoltre tumori familiari nei quali è difficile stabilire la correlazione fra tumore e un particolare gene, perché probabilmente questi tumori insorgono per una modificazione di diversi geni , ognuno dei quali ha un ruolo non particolarmente forte, ma una certa

combinazione di geni nel loro insieme può, sommandosi, favorire l'insorgenza di tumori. Cosa caratterizza i TUMORI ERIDITATI IN FORMA AUTOSOMICA DOMINANTE ? Sono tumori in cui la presenza di un singolo gene mutato aumenta di molto il rischio di sviluppare tumore. Questa mutazione è generalmente una mutazione puntiforme in un singolo allele di un gene cosiddetto oncosoppressore. Questa mutazione è già presente nella linea germinale ma di per se non può esprimersi perché l'allele sano prevale come funzione sull'allele mutato ,perché il tumore compaia è necessaria una seconda mutazione che a questo punto avviene dopo la nascita , avviene a carico della linea somatica, in questo caso si hanno entrambi gli alleli alterati e a questo punto quella cellula può dare origine ad un tumore. Esempio di questo tipo di tumore è il RETINOBLASTOMA che è tumore che colpisce prevalentemente la retina (ma non solo )ed è un tumore che insorge pochi anni dopo la nascita. Compare così presto perché la mutazione è stata trasmessa dai genitori, quindi è già presente una mutazione e la seconda mutazione evidentemente insorge subito dopo la nascita e a questo punto il tumore cresce in maniera veloce. La stessa situazione si verifica nel CANCRO DEL COLON ASSCOCIATO A POLIPOSI FAMILIARE dove questi individui sono affetti da una sindrome detta poliposi familiare adenomatosa, in cui l'individuo nasce con una mutazione a carico di un allele di un gene chiamato APC (carcinoma adenomatoso....) Stessa situazione anche nelle NEOPLASIE ENDOCRINE MULTIPLE di tipo 1 e 2. ( che tratterete in endocrinologia) Un'altra situazione analoga si verifica nel CARCINOMA DEL COLON, non associato a poliposi familiare, tumore la cui origine va addebitata all'alterazione di sistemi di riparo del DNA. A parte questo caso, gli altri TUMORI A CARICO DI DIFETTI DEL SISTEMA DI RIPARO DEL DNA sono trasmessi con carattere autosomico recessivo. Sono lo XERODERMA PIGMENTOSO ( sindrome in cui si ha un'alterazione di riparo NER, ossia escissione di nucleotidi) , altro caso quello dell' ATASSIA TELEANGECTASIA e quello della SINDROME DI BLOOM. TUMORI FAMILIARI Sono tumori non associati a specifici markers fenotipici, questo vuol dire che il tumore appena visto ,quello del Carcinoma del colon associato a poliposi familiare, è noto insorgere in presenza di una situazione in cui l'individuo ha già tantissimi polipi di tumori benigni. Quindi è caratterizzato come marcatore fenotipico. Questo individuo subito dopo la nascita sviluppa una quantità elevatissima di polipi, nella poliposi familiare. In questi tumori è difficile individuare la causa genetica perché la suscettibilità familiare probabilmente dipende da tutta una serie di alleli multipli che sono però a bassa penetranza, quindi ognuno di questi di per sè non incide molto sull' eventuale sviluppo del tumore ma è la combinazione , evidentemente sono particolari polimorfismi che alla fine creano questa situazione, quindi questo rende la cosa più complicata, perché all'interno di una popolazione si dovrebbe individuare dei particolari polimorfismi che in qualche modo possano essere

prognostici di quello che sarà lo sviluppo di un tumore. E' questo uno degli argomenti di ricerca attualmente molto importanti. Geni di suscettibilità come BCRA 1 e BCRA 2, sono definiti tali perché si è visto che in molti casi di tumori alla mammella in particolari cluster familiari di solito si osserva una mutazione di questi geni. Il fatto però che nella maggior parte dei tumori ( 90% -95%) non si osservi mai una mutazione di questi geni vuol dire che evidentemente sono richieste mutazioni di altri geni perché possa verificarsi il tumore. LA stessa cosa vale per questo gene, che codifica per una proteina p16INK 4(16= peso della proteina; INK=inibitore di chinasi ciclino-dipendenti) E' quindi inibitore di quei complessi che servono per fosforilare rb e far proliferare. Allora,una mutazione di questo gene, che si può vedere come un oncosoppressore perché normalmente tende a bloccare la crescita, crea una situazione dove non riesce più a svolgere il suo ruolo e in teoria le cellule si dividono di più. Mutazioni di questo gene sono presenti in MELANOMI FAMILIARI, tanto è vero che inizialmente si pensava che fosse un marcatore di melanomi particolarmente frequenti in certi cluster familiari, si è visto che in realtà questa mutazione è presente solo nel 20% di questi tipi di melanomi, vuol dire quindi che si, può essere importante ma evidentemente non è l'unica condizione , devono esserci chissà quanti altri geni alterati perché il tumore si possa verificare. Quando si parla di cancro, visto che le cause possono essere tantissime, e visto che si parla anche dell'importanza di modificazioni genetiche , dobbiamo iniziare a vedere quali sono i principi generali nei quali possiamo riuscire a far rientrare tutti i tipi di tumori e cercare di caratterizzare questa malattia che in realtà non è una malattia ma tante malattie, parchè ogni tumore, è stabilito abbia una sua storia che lo rende differente da tumori presenti in altri organi o addirittura da tumori apparentemente simili ma che compaiono anche nello stesso distretto. PRINCIPI GENERALI •Danni genetici non letali sono alla base del processo della cancerogenesi. •Espansione clonale (concetto di monoclonalità) •I bersagli principali del danno genetico: - proto-oncogeni - oncosoppressori - geni che regolano apoptosi - geni per il riparo del DNA (fenotipo mutatore) •il processo cancerogenetico è un processo multifasico (sia fenotipicamente che geneticamente) I Danni genetici evidentemente colpiscono la cellula e un altro principio fondamentale ormai accettato è che un altra cellula alterata possa , non che necessariamente lo faccia, ma in alcune circostanze dar luogo ad un espansione clonale e questo implica un concetto di monoclonalità. Il CONCETTO DI MONOCLONALITA' deriva da studi successivamente confermati. Studi che si basavano sull'enzima G6PD (glucosio 6 fosfato deidrogenasi) associato al cromosoma X, e che si sa che durante il fenomeno della lionizzazione soltanto uno dei X è

attivo, e allora utilizzando la G6PD si è visto che : Si è detto che se il tumore è di origine monoclonale ,in ogni tumore tutte le cellule devono avere lo stesso isoenzima , se invece il tumore è eteroclonale si dovrebbero trovare le due diverse forme , Si è però riscontrato che ogni tumore è di origine monoclonale , nel senso che anche quando uno ha più tumori ognuno dei tumori è caratterizzato dalla presenza di un solo isoenzima che può essere sia una forma che l'altra ma non si ha mai che in tumore si possano osservare cellule che presentino le due forme isoenzimatiche, questo tipo di osservazione è stata confermata anche con altri tipi di marcatori per cui si accetta l' idea che inizialmente il tumore sia il risultato di un espansione clonale e che quindi tutte le cellule di quel tumore inizialmente derivino sempre da una sola cellula. Danni genetici NON LETALI perché se il danno genetico è tale da portare come il risultato la morte della cellula è chiaro che noi non avremmo mai cancro , perché se noi induciamo dei danni al nostro genoma tali da non consentire la sopravvivenza delle cellule, noi non potremmo far partire mai questo processo e quindi il presupposto è che 1° ci sia un danno genetico 2° che non sia letale e possa essere trasmesso alla progenie che poi eventualmente potrà evolversi. Se si accetta che il danno genetico sia alla base del cancro, quali saranno le vie maggiormente interessate nell'evoluzione di questo processo? Quali saranno le classi di geni da ricercare per vedere se c'è stata una mutazione tale da poter spiegare l'insorgere del cancro?? Queste classi di geni sono rappresentate dai: •protooncogeni (normalmente deputati a favorire la proliferazione cellulare, cioè quei geni attivati nel momento in cui anche in situazioni normali ad una cellula è richiesto di dividersi. Es. dopo una ferita deve esserci un processo proliferativo e per innescare questo processo è necessario attivare questi geni che sono quindi geni proproliferazione. •oncosoppressori : sono esattamente l'opposto. Normalmente devono controllare che la cellula non proliferi oltre un certo tanto, quindi regolano in maniera negativa l'entrata in ciclo •geni che regolano l'apoptosi: si è visto che il Bcl2 iperespresso fa si che i linfociti non muoiano, tendono ad accumularsi e il risultato è la presenza di un cancro non dovuto ad alterazioni nella capacità proliferativa ma dovuto alla soppressione della morte che dovrebbe normalmente coinvolgere queste cellule e che invece immortalizza in qualche modo delle popolazioni cellulari. •geni adibiti al riparo del DNA :nel senso che se si ha un "correttore di bozze" che non funziona la lettera scritta sarà piena di errori, dove errori sta ad indicare mutazioni e tante mutazioni risulteranno in una cellula sempre più insensibile ai meccanismi di controllo. Il processo cancerogenetico è multifasico : MULTIFASICITA' DEL PROCESSO TUMORALE Cancerogeno cellula normale >detossificazione

attivazione Elettrofili cellula normale >detossificazione

Interazione con il Dna cellula normale morte cellulare divisione cellulare cellula iniziata

>riparazione del dna >danno letale

Un processo multifasico un cui si possono distinguere tre fasi: 1)iniziazione 2)promozione 3)progressione Nel caso della fase di iniziazione che è una fase velocissima, e definita come fase irreversibile, è una fase che richiede a sua volta tutta una serie di eventi che devono essere completati perché si possa far partire il processo tumorale. Questi eventi sono: Deve avvenire l'induzione di processi di biotrasformazione che alla fine risultino nella formazione di metaboliti dotati di attività elettrofisica prima di tutto, condizione necessaria ma non sufficiente perché si è visto come si hanno tutta una serie di difese come antiossidanti in grado di detossificare ossia portare via questi metaboliti reattivi e a questo punto si ha ancora una cellula normale. Non solo , una volta che si sono formati devono interagire con il Dna. Anche in questo caso possiamo dire che l'interazione con il Dna è un altro evento necessario ma non sufficiente perchè abbiamo detto che il nostro Dna può essere tranquillamente riparato e se questo succede ancora una volta il processo si blocca , oppure se il danno (ecco perché parlavo di danno genetico non letale) è talmente forte da non poter essere riparato e da indurre invece un sistema che porta alla morte della cellula . Ultimo evento assolutamente necessario è qualsiasi sia il danno provocato al dna questo deve essere fissato in maniera irreversibile, deve avvenire una mutazione( ricordatevi sempre una mutazione non può avvenire se non attraverso almeno un ciclo replicativo) perché se c'è solo la lesione , questa lesione prima o poi verrà riparata e quindi non si potrà mai parlare di cancro, quindi deve verificarsi almeno un ciclo replicativo per poter generare una cellula geneticamente alterata che poi eventualmente può evolvere in cancro. Si dice eventualmente, perché si è visti che la cellula iniziata non ha nessun vantaggio in termini di espressione di protooncogeni, o attivazione di oncogeni, o non ha perso oncosoppressori.Cioè inizialmente non è in grado di andare per conto suo, ha probabilmente acquistato la capacità di resistere a situazioni particolarmente ostili. Questa situazione ostile per il tessuto normale è quella che noi riscontriamo nella seconda fase, ossia la fase di promozione che è quella in cui si crea una situazione a favore delle cellule iniziate rispetto alle cellule normali.

A questo punto quella cellula iniziata che sarebbe destinata a rimanere silente per tutta la vita dell'organismo, invece trae vantaggio da questa nuova situazione e si espande e forma la popolazione monoclonale che è ancora suscettibile a tornare indietro e quindi non ci si trova davanti ad una fase irreversibile perché in realtà questi cloni pre-neoplastici hanno bisogno di andare incontro all'ultima fase , quella di progressione , in cui si ha un continuo processo di selezione all'interno di quella popolazione finché alcune di queste cellule acquistano altre proprietà che sono quelle di dividersi anche in assenza di stimoli esterni, di invadere il tessuto e di metastatizzare. Quindi il processo tumorale è un processo multifasico di alcune fasi come la fase di iniziazione dove si sa molto e altre fasi come quella di progressione dove invece si sa pochissimo, e naturalmente intervenire su questa fase è considerata la priorità perché nessuno può pensare di bloccare una fase di iniziazione , cioè dovremmo far sparire radiazioni,qualsiasi composto che abbia un minimo di attività mutagenica, è assolutamente impensabile, si può invece intervenire nella fase di promozione e progressione però forse a questo ci arriverete voi una volta laureati(!?!) Quali sono le evidenze, oltre a quelle già elencate, che comunque ci devono far cercare nella genetica quelle che sono le basi molecolari del cancro? La predisposizione ereditaria, il fatto che cellule neoplastiche abbiamo un numero infinito di alterazioni cromosomiche e che quindi che qualcosa è successo per aver completamente modificato il genoma, abbiamo visto che quando il sistema di riparo del DNA non è in grado di funzionare correttamente questa aumenta la probabilità che si sviluppi il cancro e poi abbiamo anche visto che c'è una relazione molto chiara tra attività mutagenica e attività cancerogena. La maggior parte delle sostanze mutagene sono anche in grado di sviluppare tumori. Quindi la capacità di indurre mutazioni è un elemento fondamentale, è una condizione assolutamente importante. Abbiamo visto che le mutazioni possono essere determinate da tantissime situazioni, da agenti esterni ma anche dai i nostri radicali prodotti in maniera endogena tra cui ovviamente specie reattive dell'ossigeno, abbiamo anche visto che è facile che si verifichino delle mutazioni nel DNA per una serie di processi spontanei che vengono a carico delle basi che sono presenti nel Dna, normalmente i nostri sistemi di riparo le aggiusta però diciamo che ogni presumibilmente si verificano tantissimi eventi che potrebbero dar luogo a mutazioni se non avessimo sistemi di riparo efficienti. Naturalmente questi eventi aumentano quanto più è alta la capacità replicativa del DNA. Abbiamo infatti detto che perché si possa verificare una mutazione è necessario almeno un ciclo replicativo.Quindi più divisioni cellulari più aumenta la frequenza mutazionale .
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E' stato calcolato che nel corso della nostra esistenza, andiamo incontro a stato anche
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mitosi ed è

calcolato che abbiamo 10 cellule, che vuole dire 1 milione di miliardi di cellule , quindi immaginatevi quante divisioni cellulari si verificano a carico di 1 milione di miliardi di cellule , e abbiamo anche detto che ogni volta che la cellula si divide favorisce una eventuale insorgenza mutazionale per cui appunto siccome il tasso mutazionale è di circa 1 milione per gene , nel corso della nostra esistenza noi dovremmo andare incontro ad un mostruoso numero di mutazioni e quindi chiunque di noi dovrebbe avere cancro a partire da un età molto precoce, in realtà non è così per nostra fortuna e questo si spiega perché molte mutazioni

avvengono in geni che non codificano,ossia sono silenti,perché molte delle mutazioni sono letali e quindi la cellula mutata và incontro a morte, e poi anche perché se una mutazione avviene a carico di un gene che non riguarda delle vie metaboliche coinvolte nella proliferazione, morte cellulare o riparazione del DNA , ad un certo punto noi potremmo avere altre malattie ma certamente non cancro. A tutto questo aggiungete il fatto che avendo un sistema di riparo che in individui normali funziona in maniera molto efficace, questo spiega perché nonostante tutte le mutazioni a cui si và incontro la probabilità di sviluppare cancro è relativamente rara. prima abbiamo parlato di classi di geni che si devono osservare per spiegarci il cancro ,e in effetti ormai si dà abbastanza per acquisito che il cancro possa essere identificato come una patologia in cui si verificato una mutazioni di queste 4 classi di geni di cui abbiamo già parlato. Per cui ora in questa e la prossima lezione vedremo quali sono i possibili bersagli, anche perché già assodato dalla clinica, dello sviluppo di molti tipi di tumori. Partiamo dai PROTONCOGENI. Abbiamo detto che questi sono la controparte normale degli oncogeni, allora secondo un concetto molto semplice a questo punto gli ONCOGENI li possiamo definire come geni trasformanti. Geni trasformanti che sono diventati tali per una attivazione , una mutazione della loro controparte normale che come abbiamo detto prima è adibita alla stimolazione della proliferazione di cellule normali, quindi tutte le nostre cellule hanno dei protooncogeni, ma se questi vanno incontro a mutazione allora avremmo dato origine ad un oncogene. In realtà questo concetto che appare semplicissimo è stato originato da una serie di studi che avevano preso un indirizzo completamente diverso. I due signori che per primi hanno introdotto il concetto di oncogene sono il signor Loro in realtà si occupavano di virus , e secondo il loro concetto gli oncogeni erano geni virali,ora ovviamente si sa che questo non è vero nel senso che sono geni che noi abbiamo .In realtà si pensava che questi fossero dei geni alieni che venivano portati dai virus , perché studiavano particolari virus , retrovirus trasformanti acuti, che in natura non esistono e sono stati creati in laboratorio. E si chiamano retrovirus trasformanti acuti perché iniettati in cellule normali inducono subito trasformazione,e quindi tumori. Studiando questo fatto loro pensavano quindi che gli oncogeni fossero dei geni che presenti nel genoma virale e che quando il virus infettava le cellule inseriva in queste un pezzo del suo DNA che era trasformante, questi geni infatti inizialmente venivano detti V-onc, dove V stava per virale perché si pensava fossero di origine virale , come vedremo ora generalmente si scrive C-onc perche sono oncogeni cellulari. Quindi secondo i primi studi questi erano oncogeni cellulari che venivano in qualche modo catturati dal virus, inseriti nel loro genoma e dopo di ché questi virus infettavano altre cellule e rimpiazzavano queste sequenze trasformate nella cellula ospite. Il nome derivava dal tipo di virus e dal tipo di tumore che questi virus trasformanti inducevano. Successivamente si notò che in molte di queste sequenze trasformanti erano assolutamente assenti in molti virus che comunque causavano trasformazione . Per es. in altra classe di virus, come virus trasformanti lenti ad RNA e che appunto causano leucemie nei roditori ma dopo un periodo piuttosto lungo ,ecco perché si chiamano lenti, si vedeva che in realtà non c'era nessuna di queste sequenze presenti in quelli trasformanti acuti e in seguito ad una serie di studi si vide che quello che succede in realtà è che questi virus sono in grado di integrare parte del loro DNA in prossimità di un protooncogene, quindi di un gene normale della cellula infettata. Inserendo un pezzetto di virus vicino al protooncogene succede che si modifica la struttura del protooncogene e quindi si da luogo ad un gene aberrante, il quale ovviamente codificherà una proteina anomala e in questo caso

abbiamo mutato quel gene e abbiamo determinato la sua attivazione ad oncogene. E'anche possibile, e succede in molti più casi,un altra cosa che questi retrovirus inseriscano parte del loro genoma vicino al protooncogene e in questo caso non stiamo modificando la struttura del gene ma stiamo facendo si che questo gene diventi trascrizionalmente molto più attivo. Produce sempre proteine che in questo caso non sono proteine anomale, ma sono proteine normale che vengono prodotte in quantità enormi il risultato è sempre lo steso perché se queste proteine sono implicate nella proliferazione è chiaro che ne produciamo tantissime ed avremo una continua eccitazione alla proliferazione cellulare pur in presenza di una proteina che è strutturalmente normale. Quindi quando si parla di virus trasformanti lenti vuol dire che quel virus inserisce qualche promotore virale vicino al protooncogene, dopo di ché si ha una stimolazione continua di quel gene che stimola la proliferazione cellulare e a questo punto stiamo favorendo al trasformazione neoplastica. I tumori nell'uomo associati a virus sono pochissimi, i virus sono in grado di causare solo pochi tipi di tumori perché la maggior parte dei tumori non è addebitale a virus. Un passaggio successivo fu quello di capire se anche nei tumori umani ci fossero delle sequenze trasformanti indipendentemente dalla presenza di virus e questo fu dimostrato da una serie di studi in cui praticamente si è preso un tumore , da questo tumore furono isolate delle cellule , dalle cellule isolato il DNA e frammentato in tanti piccoli pezzettini dopo di ché questo DNA veniva trasferito in altre cellule, su fibroblasti che normalmente proliferano facilmente in coltura e si è visto che mentre la maggior parte di fibroblasti proliferavano in maniera abbastanza controllata , altri avevano la capacità di formare dei foci di fibroblasto che crescevano in maniera particolare e che avevano tutte le caratteristiche delle cellule trasformanti. furono presi solo quei fibroblasti trasformati e iniettati nei topi si vedeva che dopo un certo periodo di tempo insorgeva un tumore nel topo, quindi non solo venivano trasformati in fibroblasti ma questi evidentemente delle sequenze trasformanti tanto è vero che iniettati nell'animale inducevano cancro. A questo punto si presero le cellule tumorali formate nel topo e di nuovo il dna frammentato per poi cercare di capire se questi tratti di dna del tumore che partivano da un tumore umano e poi ricreavano tumore nel topo potessero ibridizzare con il dna umano normale e si vide che effettivamente esistevano delle sequenze in queste cellule tumorali che ibridizzavano con il nostro DNA. Questo significa che nel nostro DNA ci sono delle sequenze molto simili a quelle trasformanti che non sono altro che i nostri protooncogeni. I meccanismi di questi avvenimenti sono l'integrazione del dna , laddove il virus è implicato vicino ad un oncogene, in questo caso può succedere che o l'inserzione determina una modificazione del gene delle nostre cellule , quindi gene mutato e proteina anomala, oppure che l'inserimento di un promotore virale vicino ad un protooncogene fa si che la sua stessa regolazione venga completamente alterata con il risultato che questo gene è sempre attivo , in questo caso si ha un iperespressione , ossia un lavoro continua di espressione di una proteina normale. In realtà esiste una serie di situazioni on legate ai virus in cui evidentemente si creano in seguito ad esposizione a cancerogeni chimici. Quali sono i protooncogeni che dobbiamo studiare quando siamo interessati a capire quali di questi sono implicati nel processo tumorale? Sono principalmente geni che codificano per fattori di crescita , geni che codificano per i

recettori dei fattori di crescita , perché i fattori di crescita di per se è inutile se non ha un partner che è il suo recettore col quale legarsi, possono essere alterazioni del segnale di trasduzione , perché il legame fattore di crescita-recettore non serve ad altro se non stimolare delle vie di trasduzione del segnale, che poi dovranno favorire la traslocazione nucleare di fattori di trascrizione, quindi anche i fattori di trascrizione sono dei geni che noi dobbiamo in qualche modo sospettare di essere coinvolti nella crescita anomala di queste cellule, e infine l'ultima classe è quella che riguarda i geni che codificano per proteine coinvolte nelle varie fasi de ciclo. Il ciclo viene avviato dai fattori di crescita che si legano ai recettori ed inducono il sistema di trasduzione del segnale, poi vengono espresse quelle proteine che servono per la regolazione del ciclo..etc Supponendo di avere una mutazione del DNA che riguardi un gene implicato in una di queste tappe,partiamo dall'alterazione dei fattori di crescita..supponiamo che la mutazione di questo gene faccia si che vengano prodotti molti più fattori di crescita di quanti non dovrebbero esserci, la presenza di fattori di crescita in eccesso porterà al fatto che questi saranno sempre più in grado di legarsi ai loro recettori. Questi legami porteranno al fatto che ci sarà una continua stimolazione delle vie di trasduzione del segnale che porterà ad una eccessiva stimolazione cellulare.Quindi mutazioni a geni che codificano per fattori di crescita debbono essere in qualche modo collegati con una maggiore insorgenza tumorale e queste sono a livello umano , evidenze che ci dicono che situazioni in cui vengano prodotti più fattori di crescita sono associati ad un aumento di certi tumori. Es. Il Protooncogene SIS codifica per il PDGF(fattore di crescita derivante delle piastrine) un aumento della sua espressione è associato a tumori come: osteosarcoma e astrocitoma. un altro fattore di crescita la cui espressione è spesso aumentata è l' FGF( fattore di crescita dei fibroblasti) fattore implicato nella rigenerazione delle ferite anche perché è importante nei processi di angiogenesi. Quello da dire per quanto riguarda i fattori di crescita è che solo raramente si ha una mutazione del gene, normalmente l' alterazione è dovuta o ad una iperespressione oppure ad un processo di amplificazione genica Fenomeno per il quale non è che il gene lavora più di quanto dovrebbe ma amplificazione vuol dire che un tratto del cromosoma contiene sequenze ripetute dello stesso gene ,per cui in realtà si fanno più proteine perché ci sono tanti geni in questo caso int-2 che stanno producendo più proteine. Tabella. Fattore di crescita Protooncogene Tumore PDGF SIS maggiore espressione osteocarcinoma Astrocitoma FGF hst-1 maggiore espressione carcinoma dello stomaco int-2 amplificazione tumore della vescica, mammella, melanoma In realtà per quanto riguarda l'uomo sembrano essere più importanti mutazioni che riguardano i recettori , più di quanto non lo siano quelle a carico dei fattori di crescita. Una mutazione a carico dei recettori dei fattori di crescita , vuol dire che si possono produrre più recettori e quindi più recettori sono in grado di catturare quei pochi fattori di crescita circolanti quindi c'è una stimolazione oppure,evento ancora più frequente, mutazioni di questi recettori fanno si che i recettori siano attivi anche in assenza di ligando.

Alterazioni recettoriali per fattori di crescita associate a tumori sono quelle per es. i recettori per le EGF (fattori di crescita dell'epidermide) . Una modificazione di questi recettori è associata ad un aumento notevole dei tumori del polmone ,glioblastomi e nell'80 % e 100% dei tumori della testa e del collo. In questo caso stiamo parlando del recettore delle EGF che è detto Erb 1 , c'è una seconda forma Erb 2 (noto anche come HER2/neu) che invece che invece è associato a tumori della mammella dell'ovaio e dello stomaco, in questo caso si parla di amplificazione e non di iperespressione. Mutazione della struttura ma di una anomala espressione. Un'altro recettore nominato Met, recettore del fattore di crescita epatocitario,(HGF) la cui espressione è aumentata ad es. nei carcinomi papillari sporadici della tiroide. Infine un altro recettore , FMS, sono i recettori dei fattori stimolanti le colonie CFS, poi recettori per il TGFbeta, questi sono alterati nel carcinoma del colon non associato a poliposi sono alterarti come conseguenza originaria di una alterazione a carico dei sistemi di riparazione che non riparando i danni del dna alla fine favoriscono l'insorgenza di mutazioni in altri geni tra cui quelli che codificano per il recettori. il risultato finale è che questi recettori non vede più il TGFbeta e quindi non attiva più segnali di regolazione negativa, perché il TGF beta nelle cellule epiteliali è un inibitore negativo, quindi se il recettore non funziona non riesce più a comunicare alla cellula che deve smettere di dividersi. Infine un recettore molto importante la cui alterazione è stata scoperta da 2gruppi italiani ,napoli e milano, riguarda un recettore (ret) trovato alterato per una mutazione puntiforme nelle neoplasie endocrine multiple e in carcinomi midollari familiari della tiroide . Inoltre una mutazione di questo recettore che porta alla formazione di un dimero recettoriale e una sua attivazione incontrollata è stata associata anche nelle neoplasie endocrine multiple di tipo 1. Questo gene ret è presente nel cromosoma 10 e codifica per un recettore con azione tirosin chinasica, quindi un recettore che serve per fosforilare. E un recettore per un fattore neurotrofico espresso dalle cellule neuroendocrine e si è osservato come nelle sindromi da carcinomi neuroendocrine siano presenti delle mutazioni puntiformi, queste mutazioni possono essere o a carico della porzione extracitoplasmatica, in questi caso si forma un dimero che perennemente attivo oppure nella MEN2b 8neoplasia endocrina multipla tipo 2b) le mutazioni riguardano il dominio intracitoplasmatico del recettore. In entrambi i casi la tirosin-chinasi funziona troppo e quindi i segnali di trasduzione generati da questo tipo di mutazione sono molto più attivi di quanto dovrebbero essere, cioè in pratica non sono più controllati. E' stata scoperta un' altra mutazione a carico di questo recettore dovuta a riarrangiamento del cromosoma 10 dove è presente il gene che lo codifica, che pone il gene ret sotto il controllo di geni che sono normalmente attivi, ossia che il gene viene continuamente attivato e soprattutto si ha la formazione di un gene ibrido che non esiste normalmente in natura e determina la sintesi di proteine assolutamente anomale,come succede in altri tipi di tumori. La proteina ibrida si comporta come un oncogene perché stimola continuamente la proliferazione. Questo tipo di mutazione è presente in 1 su 5 carcinomi papilliferi della tiroide. Abbiamo visto che alterazioni di geni che codificano per fattori di crescita sono importanti, perché se si hanno mutazioni che portano ad una eccessiva produzione di fattori di crescita ovviamente ci sarà uno stimolo anomalo per la proliferazione cellulare. abbiamo visto come alterazioni a carico di recettori dei fattori di crescita sono di notevole importanza perché se

questi sono mutati in maniera tale da diventare praticamente indipendenti dalla presenza del ligando questi funzioneranno in modo disregolato da quelle che sono le normali necessità dell'organo e quindi stimoleranno continuamente la proliferazione . Siamo arrivati alla terza classe che riguarda le Alterazioni della trasduzione del segnale , mandati ai complessi ligando-recettore per poi arrivare al nucleo e stimolare una particolare risposta, in questo caso una risposta di tipo proliferativo. Mutazione di geni che codificano per proteine coinvolte nella trasduzione dei segnali sono molto frequenti nei tumori umani e indubbiamente uno dei geni emblematici di questa classe, è rappresentato dal gene Ras. Mutazioni del gene Ras sono molto frequenti nel tumore del polmone, tumore del colon , del pancreas e altri tipi di tumori. Il gene Ras codifica per una proteina che attiva è legata al gdp e serve per indurre una serie di reazioni che poi tratteremo. Prima di parlare del ras , volevo parlarvi di un'altra mutazione che è a carico del gene Abl, in questo caso(mentre nel caso del Ras si parla di una mutazione puntiforme che implica quel particolare codone , mutazione derivante da una transizione GC-----AT) si parla di attivazione di un oncogene che consiste in una traslocazione , ossia un pezzo del cromosoma 9 và a finire sul cromosoma 22 (è associato alla leucemia mieloide cronica, infatti ritenuto diagnostico per questo tipo di tumore). In questa traslocazione si forma un gene ibrido che codifica per una proteina ibrida: BCRABL; che è risultato di questa formazione che ha causato la comparsa di un gene normalmente non esistente e che naturalmente quando codifica crea una proteina assolutamente anomala, e la caratteristica di questa traslocazione è che coinvolge una tirosin chinasi che non è associata ai recettori come nella maggioranza dei casi, ma è una proteina presente nel citoplasma. Questa è una caratteristica particolare di questi tipi di tumore. In ogni caso il risultato di questa traslocazione è quello di far si che una regione regolatrice dell' attività tirosin chinasica venga a mancare, il che vuol dire che questa tirosin chinasi fosforila continuamente e quindi sostiene in maniera esagerata la trasduzione dei segnali e porta ad una maggiore proliferazione delle cellule. Per quanto riguarda il Ras si è detto che questo funziona in modo molto semplice. Quando la cellula non si sta divedendo il Ras è legato al GTP, in quanto tale è in forma inattiva , ossia non trasmette nessun tipo di segnale . In seguito alla formazione del complesso ligando-recettore, arrivano i segnali che devono favorire la proliferazione , si l'attivazione del ras che consiste nel fatto che si sgancia dal GTP e si lega al GDP, in questa forma è attivo, ossia in grado di reclutare o fosforilare altre proteine a valle, come la ras 1, che in certi casi è anch'essa mutata , dopo di che il ras 1 agisce su proteine che sono a valle che sono le MAC chinasi , dove mac sta ad indicare che sono proteine attivate da mitogeni; e l'attivazione delle mac chinasi fa si che ci siano continui processi di fosforilazione a cascata fino a quando viene fosforilata una proteina che si chiama ERC (!?) che è un fattore di trascrizione e una volta fosforilata è in grado (cosa che prima non poteva fare) di entrare nel nucleo e legarsi al dna , favorendo la trascrizione di geni importanti per la proliferazione . Per quanto riguarda il Ras è importante ricordare 2 cose, Il ras ha: 1) ha una porzione che favorisca l'idrolisi del GTP ( la proteina attivata ha nella sua struttura una porzione che favorisce l'immediata disattivazione del ras in quanto favorisce l'idrolisi del GTP e quindi un ritorno alla forma inattiva)Questa capacità del ras di auto disattivarsi non

sarebbe sufficiente e quindi succede che questa capacità di intervenire staccando il fosfato è aumentata in maniera elevata dal legame con le proteine Gap (proteine che attivano le gtpasi) quindi la loro presenza favorisce il ritorno allo stato inattivo. Questo fenomeno di scambio fra forma attiva e inattiva è ciò che una consente la regolazione della via di trasduzione del segnale. Il fatto che le proteine Gap siano importanti lo dimostra il fatto che nella NEUROFIBROMATOSI di tipo 1 è mutatp il gene che codifica per delle gtpasi, quindi il ras resta sempre attivo e allora il problema in questo caso il problema non sussiste nel fatto che è mutato il ras ma che è mutato qualcosa che deve regolarlo. In ogni caso il risultato è che il ras resta legato al gtp più di quanto non debba essere normalmente. E quindi è come se questo segnale di trasduzione fosse sempre acceso. Nella maggior parte dei tumori in realtà la mutazione è proprio a carico del ras , nel senso che una mutazione puntiforme fa si che questo la renda resistente alla capacità di staccare il fosfato e quindi ritornare allo stato inattivo. Bisogna ricordare che tutto questo succede a una condizione : che la proteina ras, normalmente presente nel citoplasma, possa ancorarsi alla parte interna della membrana cellulare, per fra si che i segnali possano essere attivati. Tanto è vero che una terapia proposta fu quella di intervenire su enzimi che operano il processo di farnesilazione che servono per agganciare il ras e attaccarlo alla membrana. Siccome su un gene mutato non si può operare più di tanto, se non fare una terapia genica che è molto più complessa, si pensava che sintetizzando dei farmaci in grado di poter inibire questi enzimi farnesilici e impedendo che il ras si ancorasse alla membrana si potesse bloccare tutto, nel senso che il ras era mutato ma non potendosi ancorare alla membrana non avrebbe prodotto nessun effetto negativo perché impotente nelle sua azione. In realtà l'applicazione di questi farmaci non ha prodotto risultati degni di interesse. Nel caso dell'Abl , la conoscenza dei meccanismi molecolari con cui questa proteina mutata creava danno, ha portato a produrre dei farmaci che essendo sintetizzati per bloccare quella tirosin chinasi che in seguito a traslocazione non era più sotto controllo si poté osservare che i risultati applicabili all'uomo erano incoraggianti. In questo caso la definizione della basi molecolari responsabili di quel tumore può favorire una terapia mirata contro quelle alterazioni responsabili del tumore. La fase successiva coinvolge i fattori di trascrizione,che normalmente sono presenti nel citoplasma ma inattivi perché non in grado di traslocare nel nucleo. Tra i fattori di trascrizioni uno molto importante riguarda il Myc , modificazioni del Myc sono associate a tumori umani.(linfomi di Burkitt, neuroblastomi, carcinomi polmonari, mammella , colon). Nel caso del Myc si verifica un'attivazione ad oncogene che ha come causa fenomeni di amplificazione genica o processi che portano a iperespressione del Myc.Quindi si ha la proteina Myc normale ma prodotta in eccesso. Ultima classe riguarda geni che codificano per proteine associate al ciclo cellulare. Uno degli effetti dei fattori di trascrizione è quello, una volta entrati nel nucleo, di legarsi a sequenze promotori presenti nel dna che stimolano la trascrizione di geni che codificano per proteine associate al passaggio fra le varie fasi del ciclo. Tra le proteine, le più importanti sono le cicline , alcune come la CICLINA-d è sintetizzata in fase G1 si lega a delle chinasi ciclino-dipendenti che al contrario della ciclina-d sono normalmente presenti perché costitutive, si forma il complesso .......................che va a fosforilare la proteina del retinoblastoma e la fosforilazione di questa proteina è indispensabile

perché si passi alla fase S , e una volta che si passa alla fase S la Ciclina-d viene degrada e se ne sintetizzerà un'altra , ad esempio la Ciclina-a che serve per fare attraversare la cellula nella fase S e così via e il ciclo prosegue facendo in modo che ogni proteina esaurisca il suo compito per poi essere degradata e subito dopo sintetizzarne una nuova per proseguire il ciclo. Questo assicura un'estrema fedeltà nei punti del ciclo. Perché normalmente la proteina del retinoblastoma blocca il ciclo? Perché questa proteina è normalmente associata al complesso E2F/DP1 , complesso che normalmente è legato al dna e funge da repressore trascrizionale. Quindi quando Rb è legato a questo complesso ( E2F/DP1/RB), e questo è legato al dna, impedisca a quest'ultimo di dividersi. Anche perché è legato anche con l'istone diacetilasi che mantiene la cromatina molto compatta e questo non favorisca la trascrizione genica che invece necessita di un certo rilassamento. Quando avviene un danno, le cicline fosforilano l'rb e questo viene staccato dal complesso , staccato anche l'istone , in questo modo la cromatina si rilassa e ciò che rimasto ossia il complesso E2F/DP1 stimola la trascrizione di geni importanti per la proliferazione del dna. In questo discorso è importante considerare la presenza di INIBITORI DEL CICLO, e per riassumerli sono: •TGFbeta :inibitori della crescita (che tratteremo nel contesto degli oncosoppressori) •P53: in parte già vista perché in presenza di danno è in grado di legarsi al dna stimolando la trascrizioni di inibitori quali P21 •P16: che abbiamo visto implicato nei melanomi familiari Quindi da un lato si hanno i fattori di crescita che tendono a stimolare il ciclo e dall'altro lato inibitori della crescita e il bilancio tra inibitori e fattori che favoriscono la proliferazione sarà quello che determinerà la regolarità degli eventi replicativi.

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