BIOLOGIA MOLECOLARE E GENETICA MICROBICA

• Mutazioni
• Traferimento genico nei bacteria
• Recombinazione genica
• Transformazione
• Trasduzione
• Coniugazione
• Trasposoni
• CRISPR

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 Overview genetica microbica

DNA mutations and mechanisms of DNA transfer contribute to the

genetic diversity of Bacteria and Archaea. Transduction, transformation,
and conjugation are the three known ways by which prokaryotic cells
can exchange genes. 2
 Genetica microbica

Definizione di mutazione. Una mutazione è un cambiamento ereditabile nella sequenza

di base di quel genoma, cioè un cambiamento che viene trasmesso dalla cellula madre
alle cellule della progenie.

Le mutazioni possono portare a cambiamenti nelle proprietà di un organismo; alcune

mutazioni sono benefiche, altre dannose, ma la maggior parte sono neutre e non hanno
alcun effetto.

Sebbene il tasso di mutazione spontanea sia basso, l'impressionante caratteristica della

crescita esponenziale di Batteri e Archea assicura che le mutazioni che si accumulano in
una popolazione sia sorprendentemente veloce.

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Mutazioni and Mutanti

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 Genotipo vs Fenotipo

Genotipo di un organismo: si riferisce all'insieme di tutti i geni che compongono

il DNA (corredo genetico / identità genetica / costituzione genetica) di un
organismo o di una popolazione. È designato da tre lettere minuscole seguite da
una lettera maiuscola (tutta in corsivo) che indica un particolare gene.

Esempio, il gene hisC di E. coli codifica per una proteina chiamata HisC che funziona nella biosintesi
dell'amminoacido istidina. Le mutazioni nel gene hisC sarebbero designate come hisC1, hisC2.

Il fenotipo di un organismo è l'insieme di caratteristiche o tratti osservabili. È

designato da una lettera maiuscola seguita da due lettere minuscole, con un
apice più o meno per indicare la presenza o l'assenza di quella proprietà.

Esempio, un ceppo His+ di E. coli è in grado di produrre la propria istidina, mentre un ceppo His- non è in
grado di produrla

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Mutazioni selezionabili e non selezionabili

Praticamente qualsiasi caratteristica di un

organismo può essere modificata da una
mutazione.
Alcune mutazioni sono selezionabili, conferendo
un certo tipo di vantaggio agli organismi che le
possiedono, mentre altre non sono selezionabili

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7
 Screening di autotrofi nutrizionali

Incubate and examine

plates

l metodo della replicazione può essere utilizzato per il rilevamento di mutanti nutrizionali. Le colonie dalla piastra master vengono trasferite utilizzando
uno stuzzicadenti sterile su una piastra a griglia contenente diversi supporti per la selezione. Le colonie che non compaiono sul terreno selettivo sono
etichettate come auxotrofi. Il terreno selettivo mancava di un nutriente (l'amminoacido leucina) presente nella piastra master. Pertanto, le colonie sulla
piastra completa del terreno che non sono rappresentate sulla piastra del terreno selettivo sono leucina auxotrofi (Leu–).

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 Basi molecolari della mutazione

Mutazioni spontanee sono mutazioni che si verificano senza intervento esterno e la maggior parte deriva da errori
occasionali nell'accoppiamento delle basi da parte della DNA polimerasi durante la replicazione del DNA.

Le mutazioni indotte, al contrario, sono quelle causate da agenti ambientali e includono mutazioni fatte
deliberatamente dall'uomo. Le mutazioni indotte possono derivare dall'esposizione a radiazioni naturali (raggi
cosmici e così via) che alterano la struttura delle basi nel DNA, o da una varietà di sostanze chimiche che modificano
chimicamente il DNA.

Mutazioni puntiformi: mutazioni che cambiano solo una coppia di basi e si verificano quando si verifica una singola
sostituzione di una coppia di basi nel DNA. Molte mutazioni puntiformi in realtà non causano alcun cambiamento
fenotipico. Qualsiasi cambiamento fenotipico risultante da una mutazione puntiforme dipende esattamente da dove
si verifica la mutazione nel genoma e dalla natura del cambiamento nucleotidico.

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Mutazioni dovute a sostituzione di una coppia di basi
Tirosina

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 Slittamento nello scheda di lettura di mRNA

Il frame di lettura nell'mRNA viene stabilito posizionando correttamente il messaggio sul ribosoma.
L'mRNA viene letto a partire dall'estremità 5' (verso sinistra nella figura) e procede per unità di tre basi
(codoni). Il normale frame di lettura è indicato come frame 0, quello mancante di una base il frame –1 e
quello con una base extra il frame +1.
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Sopressione delle mutazioni nonsenso

L'introduzione di una mutazione senza senso in un gene

che codifica per una proteina comporta l'incorporazione
di un codone di stop (indicato da *) nell'mRNA
corrispondente. Questa singola mutazione porta alla
produzione di un polipeptide troncato. La mutazione
viene soppressa se si verifica una seconda mutazione
nell'anticodone di un tRNA, un tRNA caricato con
glutammina in questo esempio, che consente al tRNA
mutato o al tRNA soppressore di legarsi al codone senza
senso.

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 Frequenza mutazioni

• Gli errori nella replicazione del DNA si verificano con una frequenza da 10-6 a 10-7 per 1000 basi durante un
singolo ciclo di replicazione. Un tipico gene ha circa 1000 paia di basi.

• In una coltura batterica con 108 cellule/ml, è probabile che ci siano un numero di mutanti diversi per ogni dato
gene in ogni millilitro di coltura. Gli eucarioti con genomi molto grandi tendono ad avere tassi di errore di
replicazione circa 10 volte inferiori rispetto ai batteri tipici, mentre i virus a DNA, in particolare quelli con genomi
molto piccoli, possono avere tassi di errore da 100 volte a 1000 volte superiori a quelli degli organismi cellulari. I
virus a RNA hanno tassi di errore ancora più elevati a causa della correzione di bozze della polimerasi meno
efficace e della mancanza di meccanismi di riparazione dell'RNA.

• È più alta laprobabilita’ che gli errori puntiformi (singola base) durante la replicazione del DNA portino a
mutazioni missenso che a mutazioni senza senso

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 Mutagenesi: Mutageni chimici e radiazioni

a) Il 5-bromouracile può
appaiarsi alla guanina, causando
sostituzioni da AT a GC
l risultato è l'incorporazione di una base non
corrispondente nel nuovo filamento di DNA e
quindi l'introduzione di una mutazione.
Durante la successiva segregazione di questo
filamento nella divisione cellulare, viene
rivelata la mutazione.

(b) La 2-aminopurina può

appaiarsi con la citosina,
causando sostituzioni da AT a
GC

Analoghi di basi nucleotidiche. Struttura di due comuni analoghi di basi

nucleotidiche utilizzati per indurre mutazioni rispetto alle normali basi di acido
nucleico per le quali sostituiscono.
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15
Lunghezze d’onda radiazioni

Luce UV. L'effetto mutageno primario è la produzione di

dimeri pirimidinici, in cui due basi pirimidiniche adiacenti
(citosina o timina) sullo stesso filamento di DNA si legano
in modo covalente l'una all'altra. Questo puo’ ostacolare
notevolmente l'attività della DNA polimerasi o aumentare
la probabilità che la DNA polimerasi legga erroneamente la
sequenza in questo punto.

I raggi X, i raggi cosmici e i raggi gamma causano la

ionizzazione dell'acqua e di altre sostanze, con
conseguente formazione di radicali liberi come il radicale
idrossile

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 Meccanismo di riposta SOS ai danni DNA

In E. coli, in cui il processo di mutagenesi è stato studiato in dettaglio, le due polimerasi di riparazione soggette a errori sono la DNA polimerasi V, un
enzima codificato dai geni umuCD, e la DNA polimerasi IV, codificata da dinB. Entrambi sono indotti come parte del sistema di riparazione SOS.

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 Trasferimento genico nei Bacteri

Il trasferimento genico
orizzontale consente
alle cellule di acquisire Destino del DNA trasferito:
rapidamente nuove • Può essere degradato dagli enzimi di
caratteristiche e restrizione della cellula ricevente o da altri
alimenta la diversità sistemi di distruzione del DNA
metabolica. • Può replicarsi da solo (ma solo se possiede
una propria origine di replicazione, come
un plasmide o un genoma fagico)
• Può ricombinarsi con il cromosoma della
cellula ricevente.
ll trasferimento del
DNA avviene in
genere in una sola
direzione, dal
donatore al ricevente.

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 Trasferimento genico nei Bacteri

Il trasferimento genico
orizzontale consente
alle cellule di acquisire Destino del DNA trasferito:
rapidamente nuove • Può essere degradato dagli enzimi di
caratteristiche e restrizione della cellula ricevente o da altri
alimenta la diversità sistemi di distruzione del DNA
metabolica. • Può replicarsi da solo (ma solo se possiede
una propria origine di replicazione, come
un plasmide o un genoma fagico)
• Può ricombinarsi con il cromosoma della
cellula ricevente.
ll trasferimento del
DNA avviene in
genere in una sola
direzione, dal
donatore al ricevente.

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 Eventi molecolari ricombinazione omologa
Ricombinazione o riarrangiamento di frammenti di DNA con
conseguente un nuova sequenza nucleotidica.

La ricombinazione è lo scambio fisico di DNA tra elementi genetici

(strutture che trasportano informazioni genetiche).

Due sequenze di DNA si dicono omologhe quando hanno quasi la

stessa sequenza.

RecA è essenziale in quasi tutti i percorsi di ricombinazione

omologa. Proteine simili a RecA sono state identificate in tutti i
batteri esaminati, così come negli Archaea e nella maggior
parte degli Eukarya.

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 Effetti della ricombinazione omologa sul fenotipo

Affinché lo scambio fisico di segmenti di DNA

possa essere rilevato, le cellule risultanti dalla
ricombinazione devono essere
fenotipicamente diverse da entrambi i
genitori.

Gli incroci genetici nei batteri di solito

dipendono dall'uso di ceppi riceventi che
mancano di alcuni caratteri selezionabili che
acquisiranno i ricombinanti.

Di conseguenza, se la copia cromosomica di un

gene è difettosa a causa di una mutazione, è
possibile fornire una copia funzionale (wild-
type) del gene su un plasmide o batteriofago.
Questo processo è chiamato
complementazione perché si dice che il gene
wild-type completi la mutazione.

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Trasformazione Batterica

La trasformazione è un processo di trasferimento genetico mediante il

quale il DNA libero viene incorporato in una cellula ricevente e
determina un cambiamento genetico.

ll DNA non attraversa liberamente la membrana citoplasmatica; quindi

una cellula che è in grado di assorbire il DNA e per poter essere
trasformata si definisce cellula competente.

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Competenza nella trasformazione
V. cholerae compete in modo aggressivo per i nutrienti
utilizzando il suo sistema di secrezione di tipo VI per
iniettare molecole di tossine nelle cellule vicine

Proteine del sistema di secrezione di tipo VI di V.

cholerae marcate con una proteina fluorescente
verde (GFP) e proteine corrispondenti al uptake del
DNA marcate con una proteina fluorescente rossa

Le cellule di V. cholerae che esprimono entrambi i

tipi di proteine appaiono rosse con "balestre" verdi
all'interno, mentre le cellule concorrenti prive di
un sistema di secrezione di tipo VI appaiono come
cellule verdi solide. Al tempo 0, le frecce bianche
indicano le cellule preda che sono state uccise.
Queste cellule circolano alla morte. Dopo 30
minuti, le proteine di assorbimento del DNA si
localizzano per un efficace assorbimento del DNA
dalle cellule uccise
23
 Pilo e uptake del DNA in Vibrio

Nelle cellule Gram+, i pili o gli omologhi dei sistemi di secrezione di tipo II vengono utilizzati per legare il DNA e portarlo
attraverso lo spesso strato della parete cellulare. Una volta nel periplasma delle cellule Gram- o attraverso la parete
cellulare nelle cellule Gram+, il DNA si lega alle proteine all'interno del sistema di competenza associato alla membrana
citoplasmatica.

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Generali meccanismi di trasformazione

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 Regolazione della competenza

• Competenza naturale in Bacillus subtilis, una specie facilmente trasformabile, è regolato dal quorum sensing, un sistema di regolazione che
risponde alla densità cellulare
• La competenza in V. cholerae è controllata non solo dal rilevamento del quorum, ma anche dal rilevamento della chitina e dalla repressione
dei cataboliti

Le cellule di V. cholerae con geni reporter fluorescenti legati ai promotori dei geni di competenza sono state coltivate in presenza di sfere di
chitina. La linea tratteggiata bianca indica il bordo della superficie. (a) Cellule con il promotore pilA (proteina pilus) collegato a una proteina
fluorescente verde (GFP). (b) Cellule con il promotore comEA (proteine di assorbimento del DNA) legato a una proteina fluorescente rossa. (c)
Immagine unita delle parti a e b che illustrano l'espressione dei geni di competenza nelle cellule associate alla perla di chitina.

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 Trasduzione batterica

Nella trasduzione, un virus batterico (batteriofago) trasferisce il

DNA da una cellula all'altra. I virus possono trasferire i geni
dell'ospite in due modi.

1. Trasduzione generalizzata. Il DNA derivato praticamente da

qualsiasi porzione del genoma ospite è confezionato all'interno
del virione maturo al posto del genoma del virus.

2. Trasduzione specializzata. Il DNA di una regione specifica del

cromosoma ospite è integrato direttamente nel genoma del
virus, di solito sostituendo alcuni dei geni del virus. Ciò si
verifica solo con alcuni virus temperati come phage lambda.

27
 Batteriofagi (or phagi)

La maggior parte dei fagi isolati (> 95%) scoperti fino ad oggi
hanno genomi di DNA lineare a doppio filamento (dsDNA)
racchiusi in un capside proteico a coda. Altri gruppi di fagi
possono avere capsidi senza coda con genoma dsDNA o
capsidi senza coda con DNA a filamento singolo (ssDNA) o
genomi di RNA

I fagi sono noti per essere molto abbondanti in ambienti multipli, e

nella maggior parte degli ambienti superano in numero quello degli
ospiti batterici. Nell'acqua di mare, dove i fagi ambientali sono stati
studiati intensamente 106-107 particelle per millilitro. Oltre a modellare
direttamente le comunità batteriche attraverso l'uccisione dei batteri, i
fagi cambiano il metabolismo batterico attraverso geni metabolici
codificati dai fagi e possono interrompere le crescite batteriche
(blossum) attraverso l'induzione di del ciclo lisogeno

Tassonomia dei fagi basata sulla morfologia e sulla

composizione del genoma. Tra parentesi è riportato un
fago di tipo rappresentativo per ciascun gruppo
tassonomico
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Struttura batteriofago T4

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 Produzione e rilascio di virioni batteriofagi: Esempio di T4

Following injection of DNA, early and middle mRNAs are produced that encode proteins needed for DNA replication. Following
injection of DNA, early and middle proteins needed for DNA replication are produced. Late proteins are virion structural proteins
and T4 lysozyme, which is needed to lyse the cell and release new virions.

Dopo l'iniezione di DNA, vengono prodotti mRNA precoci e medi che codificano per le proteine necessarie
per la replicazione del DNA. Dopo l'iniezione del DNA, vengono prodotte le proteine iniziali e intermedie
necessarie per la replicazione del DNA. Le proteine tardive sono proteine strutturali del virione e lisozima T4,
necessario per lisare la cellula e rilasciare nuovi virioni (genoma T4 da 170 kilobasi).
30
Impacchettamento del DNA del fago T4

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 Trasduzione generalizzata

Si noti che i virioni "normali" contengono geni fagici, mentre una particella trasducente contiene geni
ospiti. S. enterica con il fago P22 ed è stato anche studiato con il fago P1 in E. coli.
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 Visualizzazione della trasduzione generalizzata

Le cellule di Citrobacter freundii sono state mescolate con il

batteriofago P1 trasportante il gene β-lattamasi (bla) per 10 minuti.

(a) Micrografia a fluorescenza che mostra le cellule mediante

colorazione DAPI.
(b) Rilevamento di un singolo trasduttore di C. freundii contenente il
gene bla ricombinato nel genoma come visualizzato dall'ibridazione in
situ fluorescente (FISH). Le frecce indicano la cellula che viene
trasdotta.

Solo una piccola parte delle particelle nel lisato sono difettose e ognuna di queste contiene solo un
piccolo frammento di DNA del donatore, la probabilità che una data particella trasduttrice contenga un
particolare gene è piuttosto bassa. Tipicamente, solo circa 1 cellula su 106-108 cellule viene trasdotta per
un dato gene. 33