Lezione CEEG 12/10/20

Riprendendo la logica dell’accesso: è necessario che le sequenze regolative siano disponibili per i
diversi fattori di trascrizione, i quali sono molto ingombrati e hanno bisogno di un accesso che sia
anche regolato nel tempo, cioè vi deve essere un ordinato ingresso di fattori sul promotore. La
complessità del sistema, partendo dal livello del nucleosoma, passando per strutture più
complesse a partire dalla fibra da 10 nm fino all’organizzazione ad anse e successivamente al
compattamento all’interno del nucleo, va a limitare in maniera consistente l’accesso del materiale
regolativo al DNA.
Affinché vi sia un accesso funzionale è necessario che intervengano elementi quali chaperones
istonici e rimodellatori della cromatina.
Gli Chaperones sono in generale quelle proteine che permettono una deposizione di componenti
sulla cromatina (per quanto riguarda gli Chaperones della cromatina), in particolare, si forma il
nucleosoma e succesivamente, ad esempio, quando questo deve destrutturarsi. Uno dei casi in cui
il nucleosoma si destruttura è quando viene attraversato dall’onda di trascrizione. Si può ad
esempio immaginare la RNA pol che deve attraversare il DNA avvolto negli ottameri istonici,
situazione in cui si troverebbe davanti degli ostacoli, interviene allora una serie di fattori come ad
esempio il fattore FACT che apre la cromatina momentaneamente e a richiuderla subito dopo il
passaggio della polimerasi (struttura dinamica).
Anche nella deposizione degli istoni,però, intervengono altri fattori quali il CAF e HIRA che sono
altri elementi responsabili della costruzione della cromatina (struttura statica).
Per passare da una struttura chiusa ad una permissiva o aperta sono necessari dei rimodellamenti

Remodelling Machines

Sono complessi proteici in grado di agire sulla particella nucleosomale e sulla fibra da 30 nm.
Utilizzano ATP poiché la particella nucleosoma è una particella piuttosto stabile quindi c’è bisogno
dell’intervento di un surpluss energetico
Vi è bisogno quindi di
a. elementi che sappiano cambiare la composizione del nucleosoma per esempio
sostituendo componenti che si trovano nell’ottamero degli istoni.
L’ottamero degli istoni canonico, ovvero i cosìdetti istoni del core nucleosomale (H3, H4 e
i dimeri di H2A e H2B), in alcune situazioni quali attivazione trascrizionale, danno al DNA o
in certe regioni del cromosoma, va incontro ad una variazione della tipologia degli istoni
che fanno parte del nucleosoma. Ad esempio vengono messi: l’istone H2AZ (il dimero ora
sarà H2AZ-H2B) l’istone H3.3, l’istone H2AX che è il tipico elemento di segnalazione di
una regione che si trova in uno stato di danno al DNA oppure vi è un istone centromerico
che viene posto nelle regioni del DNA che sono associate e coinvolte nella formazione del
centromero chiamato CEN-PA e fa parte della famiglia degli istoni H3 e viene incorporato
nella cromatina del centromero.
b. Posizionamento: data una sequenza associata agli istoni quindi non facilmente
raggiungibile, si può liberarla facendola scivolare verso destra o sinistra.
c. Modificazione delle code amminoterminali: queste code fuoriescono parzialmente dalla
struttura e permettono di mantenere un contatto elettrostatico con il DNA, essendo
fortemente a carica positiva e sono regioni di interazione con proteine regolative che le
possono raggiungere.
Si può vedere come delle code possono essere modificate con ad esempio acetilazione, in
questo caso infatti la lisina perde la struttura carica perdendo i contatti efficaci che aveva
con la doppia elica rendendo il nucleosoma leggermente più instabile.

Fra le operazioni che vengono svolte dai fattori di rimodellamento vi sono anche:
1. L’espulsione di una particella nucleosomale
2. Svolgimento parziale della doppia elica a contatto con l’ottamero
Il rimodellamento della cromatina espone il promotore
Il rimodellamento della cromatina serve ad esporre le regioni regolative, come il promotore.
Talvolta la modifica della cromatina richiama il rimodellatore quindi i diversi tipi di interventi
possono essere coordinati tra di loro

Modifiche della cromatina

L’acetilazione è tipica delle lisine.
La metilazione va sulle lisine e sulle arginine.
La fosforilazione va prevalentemente sulla serina.
Ubiquitinazione e sumoilazione vanno sia sulle lisine che su altri residui.

La cromatina attiva rispetto a quella silente mostra un pattern di digestione diverso. La nucleasi
micrococcica viene utilizzata per vedere quanto la cromatina sia accessibile verso un enzima che
taglia il dna misurando indirettamente l’accessibilità di una regione.
Nel profilo eterocromatico si evidenzia una digestione molto regolare da parte della MNasi
indicando una cromatina perfettamente organizzata, molto rigida in quanto la micrococcale è
riuscita ad andare solo sui linker. Invece nel profilo eucromatico per quanto sia possibile
riconoscere la presenza almeno dei nucleosomi monomeri e dimeri, appare sfumato in quanto vi
sono, ad esempio, regioni prive di nucleosoma oppure nucleosomi in posizioni diverse
evidenziando una cromatina più disordinata. Questo si traduce in un accesso alla micrococcale
molto diverso.
Inoltre è possibile guardare alle modifiche chimiche evidenziando, per esempio, che l’acetilazione
è prevalente nell’eucromatina a differenza della metilazione che è maggiormente presente
nell’eterocromatina. Quindi l’acetilazione è generalmente associata ad una struttura più lassa e
meno trascrivibile mentre la metilazione ha doppia valenza in quanto può essere associata sia alle
regioni attivamente trascritte sia a quelle trascrizionalmente silenti.
Quando proviamo a mettere in relazione l’accessibilità di n promotore e la presenza di determinati
elementi si nota che all’alta accessibilità si associano promotori molto forti e man mano che si
scende con l’accessibilità si attenua anche la forza dei promotori fino ad arrivare alla formazione di
eterocromatina ed in alcune situazioni estreme anche ad eterocromatina costitutiva. Si vede anche
come i nucleosomi sono scarsi nelle regioni ad alta accessibilità e viceversa per quelle a bassa
accessibilità

In conclusione quindi:
Il compattamento, dovuto alla formazione del nucleosoma core, è uno dei principali ruoli che
possiede anche se secondo diversi autori il ruolo principale è la regolazione della trascrizione. A
sostegno di ciò si nota come posizionando un nucleosoma su un promotore in una determinata
posizione esso possa prevenire l’inizio della trascrizione.
L’insieme della cromatina previene genericamente la trascrizione su tutto il genoma. Quindi il
nucleosoma è collegato alla generica regolazione negativa.
E’ vero che il nucleosoma da un contributo al compattamento ma il suo vero contributo è nella fase
trascrizionale in quanto il vero compattamento avviene con la formazione delle anse. Questo è
stato visto in esperimenti in vitro (Brown) e poi in vivo (Grunstein). Quest’ultimo ha sfruttato la
capacità del lievito di essere manipolato in quanto possiede solo due copie di geni per ogni istoni
e ha generato una delezione in una delle due copie di H4 e la rimanente è stata messa sotto il
controllo di un gene inducibile ( cioè trascritto se il lievito è cresciuto in galattosio e spento se in
glucosio), quindi se il lievito viene cresciuto in glucosio non avrà l’aiuto dell’H4 per formare la
cromatina invece con il galattosio la situazione è normale. Si è andati poi a vedere sia la cromatina
sia la trascrizione di un lievito che veniva passato da galattosio a glucosio evidenziando un
momentaneo impoverimento della cromatina che comincia ad aprirsi e un impennamento della
trascrizione.
Un fattore di trascrizione di 100 KD impedisce l’accesso a 20 bp mentre un nucleosoma a circa
200.
Inoltre il rimodellamento è essenziale in quanto un suo impedimento potrebbe essere letale.
Quindi il nucleosoma ha una duplice funzione dando sia un contributo al compattamente che alla
regolazione della trascrizione.

Se si controllano l’accesso dei fattori al DNA e quindi la trascrizione attraverso modifiche che
vanno sugli istoni sulla loro posizione o eventualmente sul ripiegamento della fibra di DNA
vediamo che tutto questo non ha mai alterato la sequenza del DNA, quindi si può rendere un gene
acceso o spento agendo sul suo stato cromatinico e quando questo risponde ad un progetto
genetico diciamo che è uno strumento epigenetico ma geneticamente programmato, se invece
l’utilizzo di questi elementi risponde a componenti estranee come per esempio quelle ambientali
allora non è più una risposta direttamente controllata in maniera genetica ma è un processo che è
regolato in maniera genetica.

Metilazione del DNA

Chi è in grado di controllare ulteriormente l’espressione genica agendo questa volta direttamente
sul DNA è il processo di metilazione.
Si consideri un DNA non associato in cromatina e quindi libero perché dalla metà degli anni 70 si è
scoperto che la citosina del DNA degli eucarioti va incontro ad una modifica molto tipica, cioè la
metilazione in posizione 5 nella formazione della 5metilcitosina. Si considerano gli eucarioti in
quanto la metilazione batterica ha funzioni e logica piuttosto diversa da quella degli eucarioti, in
quanto per i primi è essenzialmente legata alla replicazione ed è un ottimo modo per impedire alla
cellula di rireplicare determinate regioni, riconoscere i filamenti di nuova sintesi nel caso della
riparazione e anche nel caso della necessità di fare delle riparazioni nei siti chi. Negli eucarioti
invece è legato essenzialmente alla trascrizione.
Nel caso della metilazione non vi è modifica della sequenza ma della sola base ed è una modifica
chimica. E’ una modifica reversibile.

La citosina in presenza di un enzima chiamato DNAmetiltransferasi viene convertita in

5metilcitosina usando come substrato è la SAdenosilMetionina (SAM) che è il donatore di metili.
Gli enzimi in gioco sono le metilasi, DNMT1, DNAMT2A e DNMT3B e le demetilasi TET1, TET2 e
TET3. Infine vi è la componente proteica di ciò che legge la modifica, ovvero i metil binding domain
(MBD) che è tipico delle proteine che sanno riconoscere il dna metilato. Quindi vediamo che le
DNAmetiltransferasi sono i writers, le demetilasi sono gli erasers e le proteine che leggono la
modifica (MBD) sono i readers.

Profili di metilazione del DNA

Vi sono una serie di elementi che vengono fortemente metilati. Ipermetilati per esempio sono i
DNA ripetuti, gli elementi trasponibili e le sequenze telomeriche, mentre sono metilati in maniera
intermedia come le sequenze ripetute mediamente come il DNA ribosomale. Per quanto riguarda
le sequenze di tipo unico, quindi in genere quelle che trascrivono proteine, c’è una differenza se i
geni sono attivi o inattivi.
Nei geni inattivi c’è una certa variabilità, mentre per quelli attivi la metilazione in genere è piuttosto
bassa, quindi possiamo dire che mentre la scarsa metilazione si accoppia a trascrizione mentre
metilazione intermedia si accoppia ad attività trascrizionale ridotta. Questo è per quello che
riguarda il promotore
Per quanto riguarda il corpo del gene la metilazione è abbastanza sostenuta.
La distribuzione della metilazione del dna è on omogenea e viene associata a sequenze GC island
che sono regione che presentano la sequenza GC ma sono anche raggruppate tra loro. Fra queste
vi sono isole che vengono metilate molto raramente ed altre che vengono metilate più spesso.
Le isole GpC sono delle regioni di concentrazione potenziale della metilazione ed in alcuni casi è
associato con lo stato trascrizionale dei geni.
Generalmente sono di circa 200 bp e la quantità di CG è intorno al 50%. Nel genoma non si
trovano quantità di CG molto frequenti questo perché una citosina metilata per deamminazione
tende a divenire uracile quindi nell’appaiamento durante la replicazione si appaierà come se fosse
una T producendo una mutazione. Quindi il fenomeno della metilazione generalizzata è
controselezionato in quanto può portare a mutazione specialmente nelle regioni codificanti. Le
isole si trovano spesso nei promotori e in particolare hanno basso livello di metilazione se il
promotore è trascrizionalmente attivo.
Il fatto che un gene non metilato sia tendente a una buona espressione genica rispetto a uno
metilato può essere dovuto a vari fattori tra cui il richiamo piuttosto consistente di proteine che si
legano al dna metilato in quanto proteina come MeCP2 sono in grado di riconoscere il DNA
metilato ed a loro vola possono richiamare elementi che possono rendere la cromatina più
compatta come ad esempio HDAC cioè una istone deacetilasi ed eventualmente anche un
corepressore. In questo modo il gene è trascrizionalmente inattivo. Questo sistema di repressione
a volte è circolare perché richiama la DNA metiltransferasi rendendo al sequenza ancora più
metilata. Si evidenzia come vi sia una connessione tra lo stato di metilazione del promotore e la
trascrizione del gene a valle.
Andando a vedere il corpo del gene, se ampiamente metilato come sarebbe richiesto non permette
alla polimerasi di trovare siti criptici, cioè regioni dove partire in maniera impropria.
Le sequenze ripetute fungono da serbatoio per esempio di sequenze trasposoniche e vanno
incontro a forte metilazione andando ad evitare che vi sia la produzione di trasposasi attive così
che il trasposone non si muova. Se non vi fosse metilazione o non fosse sufficiente vi è la
produzione di trasposasi che innescano i processi di partenza dei trasposoni.
Di solito le regioni che devono essere controllate da metilazione sono quelle che vengono
mantenute represse
Vi sono anche situazioni particolari come i geni che subiscono l’imprinting. L’imprinting è una
espressione monoallelica, quindi in presenza dei due alleli solo uno è attivo e in genere l’elemento
che ci permette di vedere che un gene imprinted è deregolato è quando delle due coppie o
entrambe sono demetilate e quindi attive o una è demetilata quando non dovrebbe o sono
entrambe spente.
La metilazione può portare ad una serie di eventi:
1. 5metilcitosina in caso di deamminazione diventa timina e fa si che all’evento di replicazione
successivo vi sarà l’incorporazione di una base sbagliata (vedi prima)
2. Deregolazione sulla crescita di una cellula in quanto vi è la disattivazione di un tumor
soppressor che normalmente è in uno stato metilato
3. Dei trasposoni tendono ad accendersi
Sia nel caso di trasformazione tumore come nell’invecchiamento vi è un profondo cambiamento
nello stato di metilazione del DNA dell’individuo.
La metilazione è importante anche in processi come lo splicing. Gli elementi di un certo gene che
sul DNA possiedono un certo livello di metilazione saranno quindi incorporati nella proteina finale
anche se come sono collegate non è chiarissimo in quanto tra DNA e trascritto primario
l’informazione di metilazione si perde. Sono state fatte dell’ipotesi sulla presenza di determinate
proteine sul DNA in ragione della presenza della metilazione può rallentare la trascrizione andando
poi a condizionare la tipologia di splicing.
Se un elemento viene mantenuto nello splicing questo era ipermetilato sul DNA originario, se fosse
stato poco metilato non sarebbe stato presente nel prodotto maturo
La metilazione ha una sua comunicazine con procesi successivi come la acetilazione la
metilazione della cromatina, quindi un DNA h sia metilato richiama altri livelli di metilazione come
h3k9 che richiama una proteina tipica dell’etero cromatina HP1 che a sua volta può richiamare dei
fattori di spicing. Quindi i livelli di interbvento in cui la cromatina può inerferire con i rocessi di
splicing possono richiamare un’assemblaggio di fattori diversi che condizionano sia la trascrizione
che lo splicing ma non è ancora compreso come processo
Un motivo per cui un gene potrebbe non essere trascritto in quanto metilato è che la proteina che
riconosce il MBD interferisce con la presenza di altri fattori escludendoli oppure chiama dei fattori
di compattamento
Può succedere anche che dei determinati fattori trovando la propria sequenza metilata non la
leghino più. Sp1 che è uno dei fattori che si lega alla sequenza GC ripetuta, invece, non sente la
presenza della metilazione.

Slide Setting up and interpreting the mark…

a. Si può vedere il fattore di trascrizione che tenta di legarsi alla sequenza ma trova il gruppo
metilico e non riesce
b. IL complesso tenta di accedere al punto di inizio della trascrizione ma trova l’ostacolo non
solo dal fatto che il dna è metilato ma anche dalla presenza della proteina MBD
c. Il gruppo metilico ha richiamato dei fattori di silenziamento come altre HDAC o proteine che
metilano gli istone
d. Ancora una proteina che lega il dna che con la sua presenza blocca il passaggio

Il dominio di legame che riconosce il dna metilato presenta foglietti beta che alfa eliche
Tra le proteine che possiedono il dominio MBD vene sono diverse:
MeCP2 è la più studiata e tra le prime ad essere identificata ed inoltre si associa alla sindrome di
Rett. Le bambine con sindrome di rett sono caratterizzate dalla mutazione in MeCP2 e questa
difficoltà da art dell’apparato trascrizionale a riconoscere il dna metilato ha degli effetti devastanti
sulla patogenesi.
In alcuni casi sono state riconosciute anche altre componenti della proteina come ad esempio il
dominio zinc finger o domini di repressione
Quindi l’azione delle proteine che si legano al DNA si basa sull’esistenza di questo dominio e sulle
interazioni che queste proteine hanno con altri componenti come ad esempio MeCp2 che sa
richiamare HDAC o dei repressori
Una caratteristica delle mutazioni che si associano alla mancanza di MeCP2 è la sindrome di rett
Anche funzioni come la riparazione del DNA possono essere alterate