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Ciclo cellulare e replicazione del DNA

Le cellule eucariotiche riproducono se stesse grazie ad una serie ordinata di eventi


che, invariabilmente, ad ogni divisione cellulare si ripetono con la medesima
sequenza e che termineranno, nella maggior parte dei casi, con una mitosi o, nel
caso delle cellule germinali, con una meiosi. Tale ordine stato rigorosamente
conservato nel coro dellevoluzione.
Questa sequenza ordinata di eventi sfocia nella riproduzione delle cellule ed stata
denominata ciclo cellulare. Lo scopo del ciclo cellulare quello di generare due
cellule figlie con lo stesso patrimonio cromosomico della cellula madre.
Il concetto di ciclo cellulare stato coniato per gli eucarioti ma vale per tutti gli
organismi viventi. Non viene per chiamato propriamente ciclo per i procarioti,
poich non sono stati identificati, per tante regioni storiche, le fasi nellambito di
questi organismi. Certamente comunque nei procarioti le fasi sarebbero solamente
due: la fase di replicazione del DNA e di divisione cellulare. Mentre in un eucariote
come luomo, secondo stime generalmente accettate, il ciclo cellulare dura 24 ore
nella sua totalit, i procarioti possono invece duplicarsi anche ogni 20 minuti.
Durante il ciclo cellulare la cellula svolge molte attivit, ma tre eventi sono
fondamentali affinch la cellula possa dividersi; essa deve:
1. Replicare il DNA
2. Prepararsi alla divisione, modificando in modo appropriato i propri organuli ed il
proprio genoma
3. Separare fisicamente in due parti il citoplasma attraverso un processo
chiamato citodieresi.
Se noi dovessimo descrivere in maniera tridimensionale il ciclo, non avrebbe una
forma piatta, ma avrebbe, in posizione laterale, una forma elicoidale.
La cellula che entra in fase M1 sar diversa dalla cellula che entra in fase M2 e poi in
fase M3. Sono cellule che hanno un genoma differenti e quindi teoricamente possono
avere anche un fenotipo differente, pur essendo formalmente appartenenti allo
stesso istotipo.

Le differenti fasi del ciclo cellulare


1. La fase M dura circa unora; durante questa fase si ha la divisione cellulare con
la produzione di due cellule figlie, ognuna delle quali deve contenere un
genoma completo con tutto il corredo degli organuli citoplasmatici necessari
per lo svolgimento del ciclo cellulare; questo processo chiamato mitosi (,
filo, con riferimento alle strutture filiformi dei cromosomi) Il lungo periodo che
separa una mitosi dalla successiva invece definito interfase;
2. La fase G1 dura dalle 6 alle 8 ore. Durante questa fase si verificano diversi
fenomeni dovuti alla sintesi di macro molecole e piccole molecole
intracellulari,e, per cos dire, la cellula si ingrandisce, preparandosi alla
duplicazione del DNA;

3. La fase S , come indicato dallacronimo, la fase durante la quale avviene la


sintesi del DNA. Durante questa fase infatti, che dura dalle 8 alle 10 ore, viene
duplicato quasi lintero genoma cellulare. La parte che non viene duplicata
nella fase S corrisponde al centromero dei cromosomi. La duplicazione non pu
essere completata perch i due cromatidi, prodotti dalla duplicazione, sono
ancora tenuti insieme a livello del centromero. La loro separazione avverr
durante la mitosi, precisamente allanafase. In quel momento lattrazione delle
fibre del citoscheletro attiver i meccanismi della duplicazione post fase S, che
completer la sintesi della regione centromerica e questo completamento
permetter una separazione dei due cromatidi, prodotti dalla duplicazione,
sono ancora tenuti insie me a livello del centromero. La loro separazione
avverr durante lanafase della mitosi, quando lattrazione delle fibre del
citoscheletro attiver i meccanismi della duplicazione post fase S, che
completer la sintesi della regione centromerica e questo completamento
permetter una separazione dei cromatidi.
4. In fase G2 vengono effettuati altri fenomeni di sintesi. A completamento di
questa fase la cellula entra in mitosi.
Al confine tra la fase G1 ed S e tra la fase G2 e la fase M esistono dei restriction
point (punti di restrizione). Sono dei check point cellulari che ogni cellula subisce
ed a livello dei quali viene effettuato il blocco della progressione nel ciclo se la cellula
presenta certe caratteristiche inappropriate. In particolare il check point al termine
della fase G1 verifica che il genoma cellulare non contenga mutazioni tali da
sconsigliare lutilizzazione di quel genoma per la duplicazione. Le cellule che
dovessero contenere delle mutazioni che possiamo giudicare pericolose per
lorganismo sono bloccate. Questo restriction point basato sullattivit di alcune
proteine che eseguono un primo scanning, cio un controllo della struttura del
genoma, con il quale possibile individuare mutazioni. Queste proteine, coordinando
la propria attivit di controllo con altre proteine che svolgono la funzione di bloccare
la progressione della cellula nel ciclo, possono eventualmente indirizzare la cellula
alla fase G0.
5. La fase G0 riguarda le cellule che sono fuoriuscite dal ciclo per due possibili
motivi:
a) perch sono state identificate come contenuti mutazioni grossolane del
genoma e quindi da verificare ulteriormente. Alla fase G0 il danno pu
essere riparato, quindi la cellula pu eventualmente rientrare nel ciclo
oppure il sistema intracellulare pu individuare un danno che non
correggibile e pericoloso per lorganismo e allora tali cellule vengono inviate
in apoptosi
b) oppure ancora in fase G0 si trovano tute le cellule che sono furiuscite dal
ciclo cellulare perch stanno subendo un processo di differenziamento.
Questultima osservazione ci fa capire quanto sia grande il numero di cellule
che si trovano in fase G0 allinterno dellorganismo poich molte sono di
fatto le cellule che si stanno differenziando. Tali cellule non si replicano pi,
quindi hanno bloccato i meccanismi che potrebbero permettere la loro
progressione nel ciclo e invece hanno iniziato il differenziamento secondo

tutte le possibili linee specifiche che possono essere seguite allinterno


dellorganismo.
Un altro restriction point localizzato al termine della fase G2 prima dellingresso
nella fase M. In
questo caso, i parametri che vengono controllati sono
profondamente differenti da quelli gi identificati per il passaggio dalla fase G1 alla
fase S. In questo caso, infatti, la cellula ha gi subito la duplicazione del suo genoma
e sta per entrare nella fase di divisione cellulare per cui la caratteristica che ci
aspettiamo debba essere controllata la corretta duplicazione del genoma cellulare.
Nel caso in cui tutte le cellule non risultassero adeguate secondo definiti parametri
molecolari verrebbero bloccate ed anche in questo caso stato dimostrato che il pi
delle volte le cellule vengono inviate in fase G0 e poi in apoptosi.

Replicazione del DNA


Si definisce replicazione il processo di duplicazione semiconservativa del DNA. Il
processo definito semiconservativo poich le due nuove doppie eliche di DNA
sono formate entrambe da uno dei vecchi filamenti e da un nuovo filamento
complementare e presuppone avvenga la rielaborazione dei legami idrogeno che
tengono unite le basi complementari dei due filamenti antiparalleli con lutilizzazione
dei due filamenti ottenuti come stampo per la sintesi di un filamento complementare.
Grazie alla replicazione, la cellula che si sta dividendo raddoppia il proprio materiale
genetico per trasmetterne una copia a ognuna delle due cellule figlie.
Affinch il DNA si duplichi, necessario che la doppia elica si apra onde consentire
alle due singole eliche disgiunte di costruire lo stampo per le eliche di nuova sintesi.
A livello molecolare la sintesi degli acidi nucleici avviene sempre con polarit 5-3,
sia che si tratti di RNA sia che si tratti di DNA. Ci vuol dire che lo stampo viene letto
con polarit antiparallela, cio sempre con polarit 3-5, sia che si tratti di un
segmento che devessere utilizzato per la trascrizione, sia che si tratti di un tratto di
genoma che devessere duplicato. Mentre tutto il genoma devessere duplicato prima
della mitosi o meiosi cellulare, invece la trascrizione un fenomeno che riguarda
alcuni segmenti del genoma, chiamati geni, i quali sono identificati grazie alla
presenza di alcuni elementi promotori. I fenomeni della duplicazione del DNA
avvengono fondamentalmente, come detto, nella fase S in cui avviene la
duplicazione della quasi totalit del genoma cellulare.
Nonostante il modello della duplicazione sia semiconservativo dobbiamo
immaginare che la duplicazione non possa coinvolgere lintero cromosoma nello
stesso momento ma debba avvenire per gradi.
Lo stratagemma messo a punto dallevoluzione per ovviare a questo inconveniente
il meccanismo dei repliconi, segmenti funzionalmente indipendenti luno dallaltro
dal punto di vista operativo caratterizzati da una lunghezza media di circa 300kb e
dalla presenza di una regione chiamata origine della duplicazione. Sono attivati in
batterie che coinvolgono diverse regioni cromosomatiche. Tale meccanismo di

attivazione fa si che alla fine della fase S si abbia il completamento della duplicazione
del genoma.
La conformazione che le molecole di DNA assumono quando avvenuta la
denaturazione dei due filamenti ed gi iniziata la loro utilizzazione come stampo
per la duplicazione chiamata bolla di replicazione. La duplicazione procede in
entrambi i versanti della bolla in seguito alla formazione di due forcelle di
replicazione. Ci definisce il progredire delle forcelle come bidirezionale ma in
ogni forcella di sintesi dei filamenti sempre 5P>3OH. necessario quindi,
allentare la tensione dovuta alla torsione in modo da permetter al DNA di tornare in
forma rilassata e tale compito svolto dagli enzimi topo isomerasi.
Nessuna delle DNA-polimerasi identificate fino ad oggi in grado di cominciare la
sintesi ex novo di un filamento di DNA. Per cui, quando viene denaturata la regione
del replicone e in particolare la regione che comprende lorigine della replicazione, gli
enzimi che iniziano lattivit di sintesi non sono DNA-polimerasi DNA-dipendenti ma si
tratta di RNA-polimerasi DNA-dipendenti (primasi).
Gli enzimi DNA-polimerasi DNA dipendenti sono caratterizzati dalla processivity,
ovvero sono capaci di riconoscere ed interagire in maniera stabile per tutto il tempo
necessario con lo stampo, di conseguenza devono essere capaci di interagire con
almeno 150 kb di stampo prima di staccarsi, altrimenti viene interrotta la loro
capacit di sintesi. Mentre le RNA-polimerasi DNA-dipendenti sono caratterizzati da
una mancanza totale di processivity: interagiscono con un tratto di stampo che
lungo non pi di 10-20 bp e poi si staccano.
Quindi il primo passaggio, una volta denaturata la doppia elica, linterazione di una
RNA-polimerasi della classe delle primasi con uno stampo. Viene poi sintetizzato dalla
primasi un breve tratto di RNA che svolge la funzione di primer. Il filamento guida
il filamento la cui duplicazione avviene con la stessa polarit con cui si svolge la
doppia elica. Quindi su ognuna delle due forcelle che caratterizzano i repliconi, i due
filamenti guida saranno ai due opposti. La differenza tra filamento guida e
filamento ritardo sta nel fatto che il filamento guida viene sintetizzato in maniera
ininterrotta, partendo da un primer; sul filamento ritardo invece necessario che
vengano continuamente sintetizzati nuovi primers che verranno costruiti man mano
che si ha lo svolgimento della doppia elica (frammenti di Okazaki).
La reazione catalizzata dalle polimerasi definita sintesi di coda: il monomero che
viene aggiunto alla catena polimerica possiede i legami ad alta energia che
permettono la sua aggiunta al polimero ed un meccanismo che vale per acidi
nucleici e polisaccaridi. A differenza della sintesi di testa in cui il polimero che
viene sintetizzato possiede i legami ad alta energia necessari per laggiunta del
monomero, questa sintesi viene utilizzata per proteine e acidi grassi.
Le DNA polimerasi DNA dipendenti hanno la funzione fondamentale di garantire che
lappaiamento sia quello appropriato. La struttura coinvolta nella duplicazione negli
eucarioti la cromatina, che si trova in stati di diversa compattezza.

Leterocromatina una regione di cromatina particolarmente


(es. centromeri); leucromatina invece in uno stato de condensato.

compatta

Il primo momento della duplicazione non pu che essere il riconoscimento di segnali


particolari a livello della cromatina, rappresentati da specifiche sequenze di basi.
La duplicazione inizia da origini autonome (ARS). Ma mentre nel mondo dei procarioti
non si parla di ARS ma di origine della duplicazione, invece nel genoma eucariotico
ogni cromosoma ha pi origini della duplicazione. Nei proocarioti una volta
riconosciuto un punto dorigine, si viene a formare un complesso nucleo proteico che
coinvolge proteine dette DNA binding capaci di legare il DNA quando si trova
ancora sottoforma di doppia elica. La formazione di questo complesso determina lo
svolgimento del DNA, causando la torsione della molecola con la rottura dei legami
idrogeno e la separazione dei due filamenti, e poi porta alla duplicazione perch dei
due filamenti viene reso disponibile per lutilizzazzione come stampo della DNA
polimerasi.

DNA polimerasi procariotiche


Alla fine della duplicazione del genoma procariotico attiva la DNA polimerasi I.
Questo enzima possiede tre attivit, quindi tre siti differenti:
1) Grazie alla sua capacit esonucleolitica con polarit 5- 3 riesce ad eliminare
i tratti di primer e contemporaneamente colma le brecce stesse.
2) I due frammenti di Okazaki non sono uniti tra loro. Nel momento in cui viene
attivata la DNA polimerasi I, lenzima utilizza come primer il 3 libero dei
frammenti di Okazaki cosicch la DNA polimerasi inizia la sua azione che
porter intanto ad allungare il frammento di Okazaki e daltra parte
contemporaneamente ad idrolizzare il tratto di ribonucleosidi-monofosfato che
costituiscono il 5 del frammento stesso. A questo punto perch i vari
frammenti possano essere uniti tra loro interviene lenzima DNA ligasi, il
quale utilizza una fonte estrogena di energia per catalizzare la formazione dei
legami fosfodiestere necessari perch vengano sigillate tutte le brecce
presenti.
3) Le elicasi sono enzimi ATP dipendenti i quali hanno la capacit di determinare
la denaturazione della doppia elica. Quindi la denaturazione iniziale
determinata dalle proteine ed proseguita dalle elicasi, che, agendo al livello
del vertice della forcella di duplicazione, permettono lapertura della doppia
elica. Nel momento in cui avviene la denaturazione della doppia elica, si hanno
i tratti di DNA a singolo filamento. Si possono cos determinare delle
complementariet intrafilamento e venirsi a formare una struttura
tridimensionale chiamata forcina, bersaglio di endonucleasi.
Lavanzare del complesso determina la denaturazione della doppia elica a monte, ma
a valle determina un superavvolgimento che sottopone la molecola a tensioni che
potrebbero determinare molecole cos avvolte su se stesse da essere inutilizzabili. Il
meccanismo escogitato durante levoluzione per evitarlo stata la comparsa di
enzimi chiamati topoisomerasi. Sono individuati due classi di questa proteina. La

differenza tra la prima e la seconda classe di topo isomerasi sta nel fatto che quelle
della prima classe rompono entrambi i filamenti del DNA e quindi lenzima che
svolge la funzione di perno per lo svolgimento della doppia elica, mentre invece nel
caso delle topoisomerasi della seconda classe lenzima introduce la rottura del
legame fosfodiestere su uno dei due filamenti, laltro rimane intatto e svolge la
funzione di perno.
La DNA polimerasi II capace di riempire i gap (buchi) di DNA, che hanno quindi
una singola elica, senza bisogno di un primer a RNA; svolge quindi una funzione di
"gap filling", ovvero riempie zone della molecola di DNA non complete.
La DNA polimerasi III invece lenzima che catalizza la replicazione del genoma ed
chiamato oloenzima, ovvero un enzima che svolge la sua funzione solo quando
contiene tutte le subunit che lo compongono. Tutti gli enzimi DNA polimerasi
possiedono un attivit esonucleasica (proofreading), cio un processo di
correzione delle bozze basato su unattivit chimica idrolitica con polarit 3-5.
Lenzima aggiunge un nucleotide alla volta e man mano che li aggiunge si sposta con
polarit 5 3. Esiste per un attimo, durante la reazione, nel quale lenzima ha
catalizzato la formazione del legame fosfodiestere per non si ancora spostato. Una
delle cause pi comuni derrore durante lincorporazione la presenza di dNTP in
stato tautomerico (stato transitorio). Lenzima allora pu incorporare una purina
anzicch laltra che ha come conseguenza una mutazione per transizione. In questi
casi lenzima si ferma, torna indietro e identifica la regione caratterizzata dalla
presenza di coppie alterate e solo dopo aver corretto lalterazione ricomincia la sua
attivit polimerasica.

DNA polimerasi eucariotiche


Negli eucarioti sono state caratterizzate 5 diversi tipi di DNA polimerasi DNA
dipendenti: , , , , . Gli enzimi coinvolti nella duplicazione del genoma sono la DNA
polimerasi (sul filamento guida) e la DNA polimerasi (sul filamento ritardo).