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IL CICLO CELLULARE

Il ciclo cellulare comprende tutte quelle tappe che la cellula deve percorrere per potersi duplicare;
in generale è costituito da quattro fasi:
9 G1 phase (G = gap): nella quale la cellula monitora le sue dimensioni e l’ambiente esterno
e cresce sintetizzando RNA e proteine
9 S (S = synthesis): durante la quale avviene la replicazione del materiale genetico. Il DNA
passa da 2n a 4n
9 G2: rappresenta una fase in cui avviene il controllo dell’avvenuta replicazione di tutti i
cromosomi e una crescita secondaria prima della mitosi. In questa fase il DNA ha un
corredo 4n
I tre precedenti steps fanno parte dell’interfase; segue la divisione cellulare.
9 M (M = Mitosis): si compone di profase, metafase, anafase e telofase e citochinesi

Alcuni tipi cellulari non si dividono più (cellule terminalmente differenziate), sono usciti
irreversibilmente dal ciclo cellulare, altre cellule entrano in uno stato di quiescienza chiamato G0 e
possono essere stimolate a lasciare G0 e a rientrare nel ciclo cellulare.

La lunghezza di G1 riflette il fatto che le cellule per lo più richiedono più tempo per crescere e
raddoppiare la massa di proteine e organelli che per duplicare il DNA e dividersi.

Se le condizioni extracellulari sono sfavorevoli, per esempio, la cellula ritarda la progressione in G1


e può anche entrare in una fase di quiescienza detta G0.

In una cellula animale che duplica , questa sequenza di eventi si ripete ogni 18-24 ore. La fase G1
in genere occupa tra le 6 e le 12 ore nelle cellule che crescono più rapidamente. La fase S dura 6-
8h , la G2 è la fase più corta dell’interfase, e la fase M è un breve interludio di circa 1 ora. Nelle
cellule embrionali ai primi stadi di divisione cellulare, la replicazione del DNA comincia nel
momento in cui finisce la mitosi, quindi con una fase G1 cortissima.
La sintesi di RNA e proteine avviene continuamente durante il ciclo, mentre la sintesi di DNA
avviene in modo discreto durante la fase S.
Ci sono due momenti in cui la cellula deve prendere la decisione se procedere attraverso un altro
ciclo cellulare
1. Se le condizioni ambientali in G1 sono soddisfacenti (fattori di nutrimento, segnali
extracellulari), la cellula si impegna a entrare nel programma di divisione, questo momento si
chiama START nel lievito e RESTRICTION POINT negli animali
2. L’altro punto è l’impegno a entrare nella divisione mitotica, che avviene in G2. Se la cellula
non si divide in questo momento resta nella condizione tetraploide 4n.

Per le cellule animali in coltura il controllo G1 è il punto principale di decisione, mentre il controllo
G2/M è accessorio. Le cellule in coltura non si arrestano in G2. I nuclei di alcuni stadi di divisione
embrionale in Drosophila si arrestano in G2, questo probabilmente conferisce una protezione
contro il danno al DNA (due copie del genoma)

I lieviti possono usare o G1 o G2 come controlli primari, questo dipende dai fattori di nutrimento.
Nello stadio aploide usano in genere G2 come punto di controllo.
Esistono 4 checkpoints in un ciclo cellulare standard, dei punti di controllo in cui il ciclo cellulare
può procedere solo se alcuni eventi precedenti sono stati completati :

La cellula in fase G1 accresce le sue dimensioni. Al termine di questa fase troviamo il

9 G1 checkpoint: controllo delle dimensioni cellulari, della presenza di un ambiente


favorevole

Superato il primo checkpoint la cellula entra in fase S e duplica il proprio materiale genetico.

9 G1/S checkpoint: controllo dell’assenza di danni genetici, es. radiazioni ionizzanti


possono indurre rotture nel DNA

Successivamente entra in fase G2, durante la quale si accresce nuovamente.

Al termine di questa fase troviamo il

9 G2 checkpoint: controllo delle dimensioni, della completa duplicazione e dell’integrità


di tutto il materiale genetico. È durante questo checkpoint che vengono riparati gli
eventuali danni rilevati al DNA.

A questo punto la cellula entra in fase M, durante la quale incontriamo l’ultimo checkpoint

9 M checkpoint: controllo dell’assemblamento corretto dei cromosomi al fuso mitotico.


La formazione, l’attivazione e il disassemblamento del complesso ciclina-Cdk (cyclin-dependent
kinase), rappresentano l’evento pilota che guida la cellula attraverso il ciclo cellulare. L’attività delle
chinasi Cdk aumenta e scompare mentre la cellula progredisce lungo il ciclo cellulare. Le
oscilazioni portano direttamente a cambiamenti ciclici nella fosforilazione di proteine intracellulari
che iniziano o regolano i maggiori eventi del ciclo cellulare – la replicazione del DNA, la mitosi e la
citochinesi . Un aumento dell’attività delle Cdk all’inizio della mitosi, per es., porta ad un aumentata
fosforilazione delle proteine che controllano la condensazione dei cromosomi, la rottura della
membrana cellulare e l’assemblaggio del fuso mitotico.
I cambiamenti ciclici nell’attività delle Cdk sono controllati da un complesso di enzimi e altre
proteine. I più importanti sono le cicline. Come implica il loro nome, le chinasi cdk sono dipendenti
dalle cicline per la loro attività. Le cicline furono chiamate cos ìperchè vanno incontro a cicli di
sintesi e degradazione in ciascun ciclo cellulare. I livelli di Cdk invece sono costanti.

Trigger mitosis machinery

G2 cyclin
MPF

M
Cdk
G2
Cdk G1
S

G1 cyclin

Trigger DNA replication machinery


"The factors which determine the onset of the process of cell division are completely
unknown" (Hughes, 1952).

Durante gli anni 70, due scuole di pensiero si contrapponevano nell’affrontare il problema della
regolazione del ciclo cellulare. Quella di Arthur Kornberg, lo scopritore della replicazione del DNA,
argomentava che non era possibile capire il controllo del ciclo cellulare finchè non si fossero capiti i
dettagli biochimici della replicazione del DNA. A questa scuola si opponevano i genetisti e gli
embriologi, che rivendicavano che la logica del ciclo cellulare potesse essere capita trattando la
replicazione del DNA e la mitosi come scatole nere che ricevevano messaggi misteriosi da un
controllore del ciclo cellulare e mandavano indietro ugualmente misteriosi messaggi. Questa
seconda scuola di pensiero vinse in maniera spettacolare tra gli anni 70 e 90.
Tre linee di lavoro condussero insieme a produrre il primo modello di regolazione del ciclo
cellulare: La scoperta biochimica delle cicline nelle uova fertilizate del riccio di mare da parte di
Tim Hunt, lo studio dei mutanti del ciclo cellulare del lievito, da parte di Paul Nurse e Leland
Hartwell, che vinsero il Nobel in Fisiologia e medicina nel 2001 e l’identificazione del maturation-
promoting factor MPF, da parte di Yoshio Masui.

Leland H. Hartwell Sir Paul M. Nurse R. Timothy (Tim) Hunt


1/3 of the prize 1/3 of the prize 1/3 of the prize
USA United Kingdom United Kingdom

Fred Hutchinson Imperial Cancer Imperial Cancer


Cancer Research Center Research Fund Research Fund
Seattle, WA, USA London, United Kingdom London, United Kingdom
b. 1939 b. 1949 b. 1943
Indizi importanti sulla natura della regolazione del ciclo cellulare furono trovati da Rao e Johnson,
che pubblicarono su Nature nel 1970 un paper in cui fornirono la prime evidenze della natura
unidirezionale del ciclo cellulare e diedero prova del fatto che questo è controllato da una serie di
segnali chimici che sono in grado di diffondere facilmente tra nucleo e citoplasma.

Essi utilizzarono, infatti, il virus di Sendai inattivato al fine di fondere insieme cellule di mammifero
a diversi stadi del ciclo cellulare e osservare i cambiamenti indotti. Gli eterocarionti risultanti
possedevano due diversi nuclei e condividevano lo stesso citoplasma. Il comportamento dei due
nuclei veniva esaminato marcando il DNA di nuova sintesi per seguire la fase S.

Nel primo esperimento schematizzato, la fusione di un nucleo in fase S con uno in G1, porta alla
rapida induzione della replicazione del DNA anche nel nucleo in G1 facendo ipotizzare la presenza
di un fattore diffusibile chiamato S phase activator che spingesse la cellula a progredire lungo il
ciclo cellulare.

Gli stessi risultati non erano ottenuti utilizzando nuclei in fase G2; infatti gli eterocarionti risultanti
non mostravano l’entrata in fase S del nucleo G2 evidenziando un meccanismo protettivo contro la
ripetizione della duplicazione del DNA.

Anche gli eterocarionti G1-G2, nel terzo esperimento, non proseguivano nella fase S e ogni nucleo
rimaneva tal quale. Questo indicava che il passaggio attraverso la mitosi è richiesto per la cellula
per ripristinare l’abilità di andare incontro alla fase S.

S phase activator
S + G1 S + G2 G1 + G2
E’ possibile indurre i nuclei G2 nella fase M? SI!
M + Interphase

M phase+ Interphase: induces mitosis

L’identificazione di questo “fattore”, in grado di spingere cellule in interfase in mitosi, è stato


oggetto di ricerca negli anni seguenti; fino al raggiungimento della definizione dell’MPF. Durante gli
anni 60, gli scienziati stavano cercando furiosamente il fattore che media questo processo, ma fu
solo nel 1971 che Yoshio Masui e Clement Markert identificarono il Maturation-Promoting Factor
(MPF). Ci vollero poi altri 17 anni prima che questo fattore fosse purificato da Manfred Lohka,
Marianne Hayes and James Maller, che successivamente identificarono le due subunità in Cdc2 ,
quella con attività chinasica, e ciclin B.
Identification of MPF
(Maturation Promoting Factor)

• Masui Y, Markert CL. Cytoplasmic control of nuclear behavior during


meiotic maturation of frog oocytes. 1971 . J Exp Zool. 177:129-45..
• Lohka MJ, Hayes MK, Maller JL. Purification of maturation-promoting
factor, an intracellular regulator of early mitotic events. 1988 Proc Natl Acad
Sci U SA.85:3009-13.
• Gautier J, Norbury C, Lohka M, Nurse P, M aller J. Purified maturation-
promoting factor contains the product of a Xenopus homolog of the fission
yeast cell cycle control gene cdc2+. 1988 Cell. 29:433-9.
• Gautier J, M inshull J, Lohka M, Glotzer M , Hunt T, M aller JL. Cyclin is a
component of maturation-promoting factor from Xenopus. 1990 Cell. 60:487-
94.

Masui si concentrò sulla maturazione e l’attivazione dell’oocita di Xenopus.

Appropriati stimoli ormonali, agiscono sull’oocita immaturo arrestato in fase G2, inducendo il
passaggio alla fase M della prima divisione meiotica. L’ovulazione avviene quando l’ormone
progesterone rilascia l’arresto e l’oocita prosegue in un secondo ciclo cellulare, ma si arresta
durante la metafase della seconda divisione meiotica, raggiungendo lo stadio di oocita maturo. La
fertilizzazione sblocca l’arresto in metafase così che l’uovo possa completare la seconda divisione
meiotica ed entrare nell’interfase del primo ciclo cellulare embrionale. L’uovo di rana è molto
grande, circa 1 mm di diametro, e contiene tutto il materiale necessario per le successive divisioni.
La fertilizzazione innesca una serie di cicli molto rapidi di divisione cellulare chiamati cleavage, in
cui la fase S si alterna alla fase M. Dalle uova si potè isolare facilmente l’estratto citoplasmatico.
Oociti immaturi di Rana pipiens venivano indotti in vitro alla maturazione mediante progesterone al
fine di prelevarne il citoplasma e iniettarlo a tempi diversi in oociti immaturi.

Il citoplasma iniettato si è rivelato capace di indurre, sempre, la maturazione perchè contenente il


maturation-promoting factor (MPF).

L’importanza del fattore MPF nell’indurre la mitosi fu confermata dal suo andamento ciclico negli
stadi successivi di maturazione dell’oocita fertilizzato e durante il cleavage. Il suo livello sale
durante la mitosi, e il fattore scompare durante la successiva fase S . L’MPF causa anche il
germinal vescicle breakdown (la rottura della membrana nucleare) e induce una serie di eventi
mitotici come la condensazione dei cromosomi e lka formazione del fuso mitotico, suggerendo che
si tratti di un enzima (allora le chinasi erano di moda) che fosforilando dei substrati ne controlla il
funzionamento.

9 Di qui i molti significati dell’MPF: maturation promoting factor, M phase promoting factor, M phase
kinase
Una volta identificato nelle uova di rana, non solo l’MPF è stato ritrovato in tutte le specie che sono
state testate successivamente, ma si è anche osservata una corrispondenza nell’oscillazione della
sua concentrazione durante il progredire del ciclo cellulare.

9
Negli anni 70 e 80 la meiosi e la mitosi delle uova di Xenopus laevis e del riccio di mare si
prestavano molto bene a studi di tipo biochimico e quindi generarono preziose informazioni che
furono complementari agli studi genetici nel lievito. Nel 1976, Tim Hunt studiava la sintesi proteica
a Cambridge e gli capitò di invitare a Cambridge Tom Humphreys che lavorava sulla sintesi
proteica nelle uova del riccio di mare a Woods Hole. Fu a sua volta invitato per un Summer Course
a Woods Hole per l’estate successiva. Pur non conoscendo nulla di embriologia e attirato dall’idea
di studiare la sintesi proteica nel riccio di mare, cosa impossibile a Cambridge, accettò e nel
giugno del 1977 imparò a lavorare sulle uova del riccio di mare. Mancava però tutta la
strumentazione per la biologia molecolare nessun apparecchio per gel elettroforesi, né azoto
liquido o freezers –80°, e quindi Tim tornò l’estate successiva con una valigia piena di tubi
eppendorf e puntali, apparati da gel etc. e poi ancora le estati successive. Fece un lavoro sul
controllo della sintesi proteica negli ovociti delle vongole e sentì un seminario sul MPF, un’attività
biochimica che catalizzava l’ingresso in mitosi. Ma il suo chiodo fisso era la traduzione proteica.
Tim mise a punto l’estrazione delle uova fertilizzate e la corsa SDS in una dimensione. Finchè
nell’estate del 1982 fece l’esperimento che gli fece scoprire le cicline. Durante un primo
esperimento di SDS page volto ad analizzare l’espressione proteica in uova fertilizzate del riccio di
mare marcate metabolicamente con [35S]metionina ad intervalli regolari, Tim Hunt osservò
l’adamento ciclico di una proteina particolare che fu successivamente denominata ciclina B. che
veniva prodotta e distrutta ciclicamente nel ripetersi di diversi cicli cellulari.

9
Si è giunti, quindi, all’elaborazione di un primo modello in cui le cicline venivano prodotte durante
l’interfase raggiungendo massime concentrazioni durante la mitosi per essere poi degradate subito
dopo la divisione. Nel loro lavoro su Cell fu commentato il parallelismo tra il comportamento di
MPF e quello delle cicline e tuttavia, come sottolinea Hunt nel Commentary di Cell, furono molto
lenti a realizzare che le cicline e la chinasi Cdc2 erano partners fisici.

Successivamente le cicline furono identificate in molti altri organismi dimostrando l’universalità del
fenomeno. Joan Ruderman clonò e sequenzio la cyclin A delle vongole nel 1986, e dimostrò che
induceva la maturazione degli oociti di Xenopus .

L’osservazione che il comportamento oscillatorio della ciclina identificata nelle uova di riccio di
mare fosse rispecchiato da quello dell’MPF nello xenopus ha portato alla conclusione che la ciclina
B, insieme alla Cdc2 chinasi, sono le subunità costituenti l’MPF.
MPF o M phase kinase consiste di due tipi di subunità:

1. Cdc2 è la subunità catalitica che fosforila su residui di ser e thr proteine bersaglio. E’ chiamata
così dal suo omologo nel lievito

2. Il suo partner è la ciclina, una subunità regolatoria necessaria per la funzione della chinasi

La subunità catalitica è inattiva di per sé, diventa attiva solo quando è unita alla ciclina
L’attività della M phase kinase (cdc2) è regolata dalla fosforilazione, defosforilazione e dalla
degradazione proteica. I 3 aminoacidi fosforilati sono la Thr14, la Tyr15 e la Thr161. I primi due
sono nell’ATP binding site. Le cicline mitotiche sono la ciclina A e la ciclina B che formano
complessi distinti con cdc2. L’attivazione del complesso richiede una fosforilazione della Thr 161 e
una defosforilazione delle Thr14 e Tyr15 (dual fosfatasi). L’inattivazione del complesso avviene per
distruzione rapida da proteolisi.

Cyclin
Inactive MPF

cdc2

Wee1

Inhibitory

cdc25

Active MPF Inactive MPF


La ciclina B di neo sintesi associa con la forma defosforilata di cdc2. Il dimero è parzialmente attivo
e catalizza la fosforilazione su Thr14 e Tyr15, inducendo quindi la sua inattivazione. Il dimero
resta inattivo finche il fosfato non viene rimosso dalla fosfatasi. Un’altra fosforilazione avviene
sulla Thr161 di cdc2 (mediata dalla CAK (Cdc2 activating kinase). Il gruppo fosfato è aggiunto in
G2 e rimosso alla fine della mitosi. Mutazioni che rendono non fosforilabile questo sito inattivano
l’attività della chinasi.
MAMMIFERI

Se paragonate alle cellule di lievito, quelle di mammifero presentano tipi di cicline diverse che
entrano in gioco a diversi stadi del ciclo cellulare. È da notare anche la disponibilità di differenti
Cdk (circa 10 geni); ciò fornisce la possibilità di ottenere vari complessi specifici.
La M phase kinase innesca la mitosi attraverso la fosforilazione di un ampio spettro di substrati,
così come la Cdk associata alle G1 cyclins innesca la replicazione del DNA fosforilando dei
substrati. Dal momento che l’attività della chinasi deve essere inattivata per uscire dalla mitosi o
dalla fase S, gli eventi regolati dalle Cdk devono essere reversibili :per tornare dalla fase M
all’interfase gli stessi substrati devono essere defosforilati.

Potenziali substrati della fase M sono :l’istone H1, le lamins (rottura della membrana nucleare),
nucleolin (arresto della sintesi dei ribosomi) , condensin (richieste per la condensazione dei
cromosomi), proteine che regolano i miotubi.

Trigger mitosis machinery

G2 cyclin
MPF

M
Cdk
G2
Cdk G1
S

G1 cyclin

Trigger DNA replication machinery


Gli studi genetici sui lieviti hanno consentito di elaborare un modello degli eventi necessari
all’attivazione del complesso Cdc2/ciclina . Infatti il legame della Cdk alla ciclina non è sufficiente
per l’attivazione; seguono due fosforilazioni da parte di due chinasi differenti, ma quella importante
è quella inibitoria, in tirosina (la prima scoperta in lievito) a carico di Wee1. L’azione successiva
della fosfatasi Cdc25 rimuove la fosforilazione inibitoria e porta all’attivazione dell’MPF.

Trigger mitosis machinery

G2 cyclin
MPF

M
Cdk
G2
Cdk G1
S

G1 cyclin

Trigger DNA replication machinery


Molti mutanti del ciclo cellulare sono stati trovati in screening nellievito. I due tipi di lieviti, S.
pombe e S. cerevisiae hanno un ciclo cellulare articolato in step diversi. Pombe si divide per
fissione e ha un ciclo standard, con una fase G1, S, G2 e M. Cerevisia si divide per gemmazione ,
per cui la fase G2 è praticamente inesistente, in quanto dopo la fase S la gemma non cresce
ulteriormente ma si stacca subito e crescerà poi in G1.

I mutanti cdc cell division cycle sono temperatura sensibili, cioè la perdita di funzione si
manifesta solo oltre una certa temperatura. Questo consente di far proseguire il ciclo cellulare fino
a una fase precisa per poi alzare la temperatura e osservare gli effetti della perdita della proteina.
Se il ciclo veniva bloccato, in Pombe le cellule crescevano senza dividersi, diventando molto
allungate; in Cerevisiae non producevano la gemma.

Sono stati individuati due fenotipi opposti per il gene cdc2:

9 Mutanti lunghi: cdc2 è richiesto nel ciclo cellulare perchè in sua assenza non si passa
dalla fase G2 alla M ⇒ arresto.
9 Mutanti corti: cdc2 è implicato anche nella durata del ciclo in quando modificazioni
della sua regolazione portano ad accelerazione del ciclo e divisione senza precedente
accrescimento.
Oltre 80 geni cdc sono stati identificati in ciascuna specie, molti sono geni metabolici, per es
enzimi che replicano il DNA o sintetizzano i precursori dei nucleotidi.

cdc2 è la chinasi di Pombe, cdc28 di cerevisiae. Proteine che assomigliano alle cicline B,
dimostrando quindi che CDC2 è evolutivamente conservato, inoltre il gene umano è stato usato
per complementare il difetto in lievito.

Geni implicati nel controllo della dimensione cellulare sono stati identificati con proprietà opposte a
quelle dei mutanti cdc. Il gene wee1 è richiesto per inibire l’ingresso in mitosi finche la massa della
cellula non è adeguata. La perdita di funzione di Wee1 quindi fa avanzare le cellule in mitosi e le fa
dividere con una dimensione ridotta (fenotipo corto).

Wee1 codifica per una dual chinasi che fosforila ser/thr e tyr. La fosforilazione in Tyr 15 è inibitoria
(nel lievito manca la thr 14).

I prodotti di Cdc25 e Wee1 hanno funzioni antagoniste, la fosfatasi agisce sulla stessa tyr attivando
la cdc2. Mutanti che overesprimono CDC25 hanno lo stesso fenotipo corto di Wee1. Questi geni
sono conservati nel lievito e nei mammiferi.
Il danno al DNA innesca un checkpoint che blocca il ciclo finche il danno non è stato riparato. Una
risposta alternativa è quella di innescare una risposta apooptotica.
Un complesso di proteine si legano al DNA danneggiato e innescano un signaling pathway.
Ci sono molte pathways che rispondono al danno DNA. Le cellule sono molto sensibili alle rotture
del doppio o anche in un singolo filamento.

Un tipico checkpoint comprende tre componenti:


9 i sensori, che scoprono gli eventuali difetti ed emettono un segnale, si legano al DNA
danneggiato
9 la cascata dei segnali di trasduzione, la quale possiede la funzione di trasmettere il
segnale dai sensori fino agli effettori e di amplificare il segnale tramite fosforilazione
9 gli effettori, ovvero il macchinario attivato

In Cerevisiae , al danno che avviene in S rispondono tre proteine che formano un complesso che
si assembla nel punto di rottura: RAD17, RAD24 e MEC3. A queste si associano due chinasi di
trasduzione del segnale MEC1 e TEL1, che fosforilano e attivano gli effettori RAD53 (Chk2) e
Chk1 , delle chinasi che a loro volta fosforilano gli effettori finali. L’omologo umano di TEL1 è ATM,
il gene dell’ataxia telengiectasia. I pazienti con questa malattia sono enormemente sensibili al
danno al DNA e hanno difetti cellulari dovuti ad errori che avvengono durante la normale divisione
cellulare, che non possono essere riparati a causa del difetto nel checkpoint, che non viene
attivato.
ATM attiva la chinasi Chk2 e anche Chk1hk2 fosforila CDC25 che quindi viene legata e
sequestrata dalla proteina 14-3-3, che la mantiene in uno stato inattivo, Come risultato CDC25 non
può più defosforilare Cdc2, e quindi si ha un arresto in G2/M.
Il danno al DNA attiva anche la trascrizione di geni che sono necessari per riparare il DNA, mentre
ATM fosforila direttamente proteine coinvolte nella ricombinazione omologa e nel l’unione
dell’estremità non omologhe.
La sintesi delle Cicline D nei mammiferi è attivata dai fattori di crescita, che stimolano il rientro nel
ciclo dalla fase G0. Hanno una vita media molto corta, e i loro lkivelli declinano rapidamente
quando il fattore di crescita è rimosso. La perdita della ciclina D può innescare l’uscita dal ciclo e
l’ingresso in G0.

L’attività delle cicline D è richiesta durante l’ultima parte di G1, ma non vicino al confine G1/S.
Hanno una funzione ridondante, ma differiscono per la diversa suscettivilità agli inibitori.

L’attività della ciclina E cdk2 è necessaria per entrare in S.

La progressione attraverso la fase S richiede il complesso cyclinA-cdk2. E’ anche associata a cdc2


per entrare in mitosi, quindi viene usata sia per entrare in g1/s che in G2/M.
RB è un substrato importante di cdk-G1 cyclin, la sua fosforilazione è necessaria per iniziare la
fase S
Il circuito di base nelle cellule quiescienti o durante la prima fase G1 è che RB è legato a E2F, un
fattore di trascrizione che promuove geni essenziali della fase S, sequestrando E2F RB inibisce
l’ingresso in S, inoltre il complesso E2F-RB reprime la trascrizione di altri geni. La fosforilazione di
RB rilascia E2F che attiva i geni della fase S e rilascia la repressione dei geni. Ci sono anche p107
e p130, parenti di RB, che legano il gruppo dei fattori E2F.
CKI proteins cadono in due famiglie INK4 (legano cdk4, cdk6) e KIP (legano anche cdk2).
Come sono degradate le cicline? Tramite ubiquitinazione che direziona verso la degradazione nel
proteasoma. Due complessi di ubiquitine ligasi E3:

APC o ciclosoma SCF

Le cicline hanno una breve sequenza vicina all’N-terminale, chiamata destruction box, che
rappresenta un target per la proteolisi ubiquitina dipendente. Sono quindi degradate nel
proteosoma. La ciclina B priva della regione N-terminale non viene degradata e causa un arresto
in anafase, la mitosi non viene completata.

A N Arg Thr Va Leu Gly Val Il Gly As C


B1 N Ar Thr Al Leu Gly Asp Il Gly As C
B2 N Ar Ala Al Leu Gly Glu Il Gly As C
Il primo evento che capita è la degradazione della ciclina A in metafase.
La separazione dei cromosomi in anafase richiede l’attività del proteosoma, ma non richiede la
degradazione delle cicline. Il bersaglio di quest’evento è Psd1, la cui degradazione innesca il
pathway che consente ai cromatidi di separarsi
Poi in anafase, le cicline B devono essere inattivate per inattivare la chinasi di M phase. Questo è
necessario per consentire che le fosforilazioni dei substrati catalizzate in M siano revertite alla fine
della mitosi.
Due fattori regolatori, CDC20 e Cdh1 (o Hct1) si legano ad APC e attivano la sua attività di
ubiquitinazione. CDC20 è necessario per degradare Pds1, che controlla la transizione tra metafase
e anafase .
Le coesine sono quelle molecole che mantengono uniti i cromatidi fratelli in seguito alla
duplicazione del DNA e fanno in modo che si mantengano uniti anche durante l’allineamento al
centro della cellula quando si attaccanoal fuso mitotico.
Per proseguire, però, con la mitosi bisogna che dopo l’ancoraggio al fuso i cromatidi fratelli si
stacchino per segregare ai due poli della cellula e procedere all’anafase.

La proteasi che taglia le coesine è chiamata Separina (Esp1) ed è mantenuta inattiva durante le
prime fasi della mitosi da una Securina (Pds1). APC ubiquitina la securina al fine di attivare la
separina, che taglia il complesso delle coesine e promuove l’anafase.
Il sistema delle coesine è il bersaglio di un checkpoint. La progressione attraverso la mitosi
richiede che tutti i cinetocori siano appaiati con i loro omologhi.

Il checkpoint consiste di un sistema di sorveglianza che è innescato dalla presenza di un


cinetocoro non attaccato. Mutazioni nei geni Mad e Bub consentono alla mitosi di andare avanti in
maniera aberrante in presenza dei cinetocori non appaiati. Le proteine Mad controllano la
segregazione dei cromatidi. Legano CDC20 e prevengono l’attivazione di APC. Quando tutti i
cinetocori sono attaccati un segnale causa il rilascio delle Mad da CDC20.