30/03/2022

ANALISI MOLECOLARE
RICERCA DI SEQUENZE GENICHE
Diagnosi diretta rapida: nel caso di diagnosi rapida o di agenti difficilmente coltivabili è possibile ricercare
direttamente nel materiale patologico la presenza di:
➢ Antigeni
➢ Sequenze geniche (sequenze di DNA o RNA)
È possibile dunque mettere in evidenza la presenza di questi microrganismi attraverso il riconoscimento delle
sequenze geniche.

Si definisce “ibridazione in situ” in quanto prevede il fissaggio delle cellule che contengono il DNA sul
vetrino, in maniera tale da poter rimuovere successivamente tutto ciò che non si è legato per evitare che
rimanga la fluorescenza sul vetrino.
Si possono inoltre, identificare le sequenza geniche attraverso un’amplificazione (n volte) in modo tale che
la sequenza sia altamente specifica, oppure in presenza di sequenze molto piccole che possono essere messe
in rilievo perché il segnale viene amplificato e poi messo in evidenza.
Polymerase Chain Reaction (PCR): prevede l’utilizzo dei primer che innescano la reazione (in quanto è
necessario utilizzare una DNA polimerasi termoresistente) e quindi l’amplificazione n volte quella sequenza
geniche che poi verrà messa in evidenza.
L’utilizzo della PCR prevede dunque i seguenti step:
➢ Denaturazione: le due eliche del DNA bersaglio vengono separate mediante il calore (breve
esposizione a 94°C o più);
➢ “annealing” (appaiamento): la temperatura viene abbassata consentendo l’appaiamento della coppia
di primer alle rispettive sequenze complementari sul DNA bersaglio;
➢ Estensione della reazione: la temperatura viene di nuovo elevata consentendo alla DNA polimerasi
termoresistente di estendere le sequenze tra i primer;
➢ Cicli di denaturazione, appaiamento e allungamento ripetuto 20-30 volte per ottenere massiccia
amplificazione del DNA.

VARIANTI DELLA PCR

➢ NESTED PCR: il DNA bersaglio viene amplificato utilizzando due coppie di primer e due serie di
cicli di amplificazione. Vantaggi: maggiore sensibilità e specificità. Svantaggio: maggiori rischi di
contaminazione;
➢ MULTIPLEX PCR (PCR multipla): prevede l’uso della stessa reazione di più coppie di primer
specifici per diversi bersagli (ad es acidi nucleici di patogeni diversi); questa co-amplificazione di
bersagli multipli può essere utilizzata per numerosi scopi, ma a livello diagnostico, soprattutto per
consentire la ricerca di più patogeni in un unico materiale patologico (es: agenti di infezioni
respiratorie in un materiale proveniente da tali vie);
➢ BROAD-RANGE PCR (PCR ad ampio spettro): a differenza delle precedenti, questa reazione
prevede l’uso di primer omologhi a sequenze altamente conservate e quindi comuni a più patogeni;
in questo modo è stato possibile identificare diversi nuovi agenti batterici, per niente o difficilmente
coltivabili, direttamente dal sangue o da biopsie tissutali;
➢ PCR REAL-TIME: la quantità di prodotto ottenuto mediante PCR viene costantemente monitorata
in “tempo reale” mediante sonde o coloranti fluorescenti, introdotti nella reazione.
PCR a transcriptasi inversa o PT-PCR
➢ È utilizzata per amplificare RNA bersaglio
(soprattutto virali, ma anche di agenti
microbici);
➢ L’RNA viene preventivamente convertito a
DNA complementare (cDNA) ad opera di una
trascrittasi inversa, con successiva
amplificazione mediante PCR;
➢ La trascrittasi inversa utilizza un
oligonucleotide complementare (primer 1) per
iniziare la sintesi di DNA utilizzando RNA
come stampo;
➢ Il DNA a singolo filamento è poi utilizzato
come stampo per la sintesi di un secondo
filamento di DNA mediante l’utilizzo del
primer 2;
➢ Utilizzata per N. gonorrhoeae, C. trachomatis,
M. tubercolosis, Citomegalovirus, Enterovirus, ecc.
CRESCITA DEI BATTERI

È l’anello che si viene a formare nella zona

equatoriale nel momento in cui una cellula si
Rappresenta il momento allunga talmente tanto da arrivare a quasi il
della divisione cellulare doppio delle sue dimensioni. Prima della divisione
l’anello prima si polimerizza (attraverso l’aggiunta
di altro materiale di membrana) e poi si
depolimerizza, e si ha così la divisione cellulare.

Per “crescita dei batteri” intendiamo l’aumento del numero delle cellule quando queste ultime trovano
condizioni ambientali (temperatura, pH, ossigeno) e nutrizionali favorevoli. Di conseguenza una cellula
procariotica si predispone alla divisione in due nuove cellule mediante scissione o fissione binaria.
Una singola cellula si accresce ordinatamente o dopo essersi allungata circa il doppio della lunghezza ed
aver duplicato tutti i costituenti compreso il cromosoma e le macromolecole si divide in due cellule figlie
estremamente uguali.
Tempo di duplicazione:
➢ Tempo richiesto per svolgere un ciclo di crescita completo;
➢ Dipende da fattori nutrizionali, ambientali e genetici, può variare da una ventina di minuti per E.
Coli (crescita rapida) a 12-13 ore per M. tubercolosis (crescita lenta).
Per osservare una colonia di Mycobatteri bisogna aspettare 15 giorni, in quanto la parete cellulare è costituita
da un elevato tenore di lipidi (sono impermeabili), e di conseguenza la colorazione di questi batteri è molto
difficile.
CICLO CELLULARE
Il ciclo cellulare batterico è rappresentato da una serie coordinata di eventi:
➢ replicazione e segregazione del cromosoma;
➢ formazione del setto e successiva divisione cellulare.
Durante tale ciclo, alcune sintesi macromolecolari procedono ininterrottamente, mentre altre come
duplicazione cromosomica e formazione del setto avvengono in fasi definite del ciclo.

ANELLO FtsZ
Contemporaneamente al termine della replicazione del DNA e all’inizio della segregazione, inizia la fase di
divisione, caratterizzata dalla polimerizzazione di una proteina simile alla tubulina: la FtsZ (ha il compito di
formare un anello al centro della cellula detto “anello Z”, nella regione dove si formerà il setto divisionale).
Sembra che sia proprio il completamento della sintesi del DNA il segnale per l’inizio dei processi di
divisione.

La localizzazione delle proteine FtsZ nella parte centrale della cellula è mediata da proteine denominate Min
(MinCD) che impedisce la formazione dell’anello Z in diverse zone dell’equatore e MinE che è capace di
interagire con i nucleotidi.
Localizzazione dell’anello FtsZ
(proteine filamentose sensibili alla
Temperatura)
L’anello FtsZ, una volta che si forma, richiama
numerosissime proteine (circa 15), ognuna delle quali
svolge una funzione diversa.

IL DIVISOMA
Molecole di FtsZ polimerizzano per formare un anello completo, capace poi di richiamare altre proteine Fts,
circa 15 a costruire un complesso detto divisoma, il quale dirige la sintesi di nuova membrana e materiale
parietale finché la cellula non raggiunge il doppio della sua lunghezza e inizia la formazione di un
restringimento con separazione delle due figlie.

Divisoma: proteine Fts MurG, MraY, le PBP, le autolisine (AmiC), ZipA, FtsA e ZipA insieme alle Mln
sono richieste per l’assemblaggio delle FtsZ alla membrana. Le autolisine durante la formazione del
divisoma hanno una funzione simile al lisozima, provocano piccole fessure nella parete a partire dall’anello
di proteine FtsZ permettendo attraverso queste l’aggiunta di materiale di nuova sintesi e nuove unità di
peptidoglicano.
Quando la cellula raggiunge il doppio della lunghezza restringimento anello Z con introflessione
della membrana formazione del setto di separazione e depolimerizzazione anello Z
separazione delle cellule figlie.
LA FORMA CELLULARE
Proteine specifiche omologhe dell’actina sono responsabili della forma cellulare. MreB partecipa alla
formazione di un citoscheletro actino-simile. Le proteine Mre si dispongono al di sotto della membrana
citoplasmatica a formare bande filamentose spiraliformi all’interno della cellula. Presumibilmente MreB
definisce la fora cellulare generando una forza contro la membrana citoplasmatica.
La “mancanza” di MreB conferisce una morfologia sferica, mentre il riarrangiamento dei filamenti di MreB
determinano la forma bastoncellare e altre morfologie.

SINTESI DELLA PARETE CELLULARE

Sintesi del peptidoglicano

Durante la crescita cellulare, la sintesi di peptidoglicano richiede la rottura controllata del peptidoglicano
preesistente da parte delle autolisine e l’inserzione di nuovi precursori.
Il il trasporto dei precursori del peptidoglicano (NAM-NAG e pentapeptide) attraverso la membrana
citoplasmatica viene facilitato dal bactoprentolo (undecaprenoisosfato) un alcol a 55 atomi di C fortemente
idrofobico che, raggiunto il periplasma, interagisce con gli enzimi che intervengono nell’inserzione dei
precursori nel punto di crescita e nella catalisi dei legami glicosidici.
ANALISI DELLA CRESCITA BATTERICA
Curva di crescita
L’andamento della crescita di una popolazione
batterica può essere analizzata mediante due
sistemi:
➢ Sistema chiuso (coltura di batch): crescita
in terreni di coltura liquidi in contenitori
che consentono solo scambi gassosi con
l’atmosfera di incubazione;
➢ Sistema aperto: crescita di terreni di
coltura liquidi in contenitori che
consentono l’apporto continuo di nuove
sostanze nutritive e l’allontanamento di
terreno “vecchio”
La crescita batterica può essere valutata in termini di torbidità o mediante il conteggio delle cellule vitali
(determinazione delle UFC).
➢ In un sistema chiuso: la curva di crescita misura la variazione del numero di cellule o massa totale
di batteri nel tempo, mediante un grafico semilogaritmico.
➢ Scala logaritmica: i dati relativi al numero delle cellule
➢ Scala aritmetica: il tempo
➢ Curva sigmoide, nella quale si distinguono 4 fasi: latenza, logaritmica, stazionaria, declino
➢ Andamento simile per tutte le specie batteriche, maggiore o minore pendenza della curva.
FASE DI LATENZA

➢ Fase di adattamento della cellula al mezzo culturale

➢ Fase di sintesi enzimatica
➢ Sintesi di nuovi componenti strutturali cellulari

N.B. Durante questa fase non vi è un aumento del numero delle cellule, ma solamente un aumento
volumetrico cellulare.
La durata dipende da:
➢ Stato fisiologico cellulare;
➢ Numero del terreno di coltura;
➢ Volume dell’inoculo.
FASE ESPONENZIALE O TROFOFASE
➢ Il numero di batteri aumenta in modo esponenziale: ad intervalli di tempo costanti la popolazione
raddoppia;
➢ Vi è proporzionalità tra il numero di cellule e la massa cellulare. La crescita è bilanciata e la
popolazione uniforme: raddoppiano le cellule, ma anche la concentrazione dei componenti cellulari
(DNA, RNA, proteine, ecc.);
➢ Coltura non sincronizzata: ogni cellula si riproduce a tempi leggermente differenti. In ogni istante
sono presenti cellule in tutti gli stadi del ciclo cellulare;
➢ Velocità di crescita esponenziale variabile;
➢ Attivazione di sistemi Quorum sensing con produzione di fattori di virulenza;
➢ In una coltura in batch è autolimitante.
FASE STAZIONARIA O IDIOFASE
Periodo tra tarda fase esponenziale e fase stazionaria: fase di produzione di metaboliti secondari, quali gli
antibiotici
La crescita esponenziale è mantenuta solo per alcune generazioni, a causa di:
➢ Esaurimento dei nutrienti;
➢ Accumulo di prodotti tossici;
➢ Elevata densità cellulare;
➢ Bassa pressione parziale di O2;
➢ Variazione del pH.
FASE DI DECLINO
Fase di morte: la conta totale può rimanere costante, mentre la conta vitale diminuisce lentamente. La
deplezione dei metaboliti o l’accumulo di prodotti tossici interrompono la sintesi, mentre continuano le
degradazioni e si ha cosi la perdita della capacità di divisione, infatti molte cellule muoiono. In alcuni casi, il
tasso di mortalità rallenta a causa della presenza di cellula resistenti.
I segnali che attivano strategie di sopravvivenza sono:
➢ Sporulazione;
➢ Assorbimento di eDNA (trasformazione);
➢ Stato di cellule vitali non coltivabili (VNBC).
Modello matematico
➢ Aumento del numero di cellule durante la crescita esponenziale secondo progressione geometrica in
base 2
➢ Tempo di generazione g: tempo necessario ad una popolazione per duplicarsi

La maggior parte dei batteri ha un g tra 20’ e 60’; alcuni crescono rapidamente dividendosi in 10’, mentre
altri in giorni. G può essere influenzato dal terreno e dalle condizioni di crescita.
CRESCITA DIAUXICA
In presenza di due substrati, una specie batterica può
utilizzare il secondo substrato dopo aver utilizzato il
primo.
Curva diauxica con crescita bifasica: comparsa di
due fasi logaritmiche consecutive precedute dalle
relative fasi di latenza.
La degradazione del glucosio avviene ad opera di
enzimi costitutivi, quella di altri saccaridi avviene ad
opera di enzimi inducibili.
Repressione di catabolita: effetto glucosio
Controllo di tipo positivo mediato da un attivatore: in
presenza di due zuccheri, il glucosio viene utilizzato
per primo perché inibisce la sintesi di cAMP
richiesto per l’inizio della trascrizione degli enzimi
inducibili necessari per il metabolismo del secondo
zucchero.
cAMP normalmente attiva una proteina allosterica
CAP (catabolite activator protein) che si lega al
Promotore sull’operon e favorisce il legame ad esso
della RNA polimerasi per iniziare la trascrizione.

SISTEMA APERTO: COLTURE CONTINUE

È possibile mantenere una coltura costantemente in fase logaritmica (coltura continua) per lunghi periodi di
tempo senza avere variazioni della concentrazione cellulare e dell’ambiente mediante l’uso dei chemostati
(fermentatori): apparecchiatura con camera di crescita un volume di terreno che viene continuamente
rinnovato.
Sistemi che vengono utilizzati per la produzione industriale di prodotti microbici quali: enzimi, ormoni e
numerosi altri farmaci, e per lo studio di processi fisiologici e biochimici.