REGOLAZIONE TRASCRIZIONALE PROCARIOTI

La regolazione dell’espressione genica serve per cambiare il fenotipo della cellula e quindi per far esplicitare
delle funzioni piuttosto che altre.

Non vogliamo che tutti i promotori siano forti, e cioè che tutti i promotori leghino fortemente il fattore
sigma e producano sempre livelli basali di prodotti proteici elevati. Ci sono alcune proteine che devono
essere prodotte sempre ad alti livelli, ma non tutte, altrimenti non avrebbe senso quello che diciamo.

I geni sono controllati spesso da segnali extracellulari che vengono comunicati ad essi da proteine
regolatrici, che possono essere di 2 tipi:

 Regolatori positivi o attivatori: aumentano la trascrizione del gene regolato, può anche favorire
l’isomerizzazione da complesso chiuso a complesso aperto.
 Regolatori negativi o repressori: diminuiscono o eliminano la trascrizione di quel gene.

Il punto più comune di regolazione è l’inizio della trascrizione, ha due vantaggi principali:

1. È più efficiente dal punto di vista energetico, la decisione di esprimere o no un gene, presa al primo
passaggio, fa si che non venga sprecata energia.
2. È più semplice da portare a termine, c’è solo una copia di ciascun gene e quindi per controllare
l’espressione di un gene deve essere di norma regolato un solo promotore per molecola.

Ma anche la regolazione dei passaggi successivi può avere dei vantaggi:

1. Può avvenire in più punti

2. Può ridurre il tempo di risposta

Gli attivatori o i repressori si legano a sequenze specifiche.

I fattori di trascrizione sono generalmente costituiti da due domini.

Un dominio lega il DNA, e un dominio di attivazione o repressione,

sono indipendenti tra di loro e possono essere separati in laboratorio.

Le sequenze specifiche da legare sono formate dalle basi azotate e queste ultime si rivolgono verso
l’interno della doppia elica.

Le basi però hanno altri gruppi, accettori e donatori che si dispongono nel solco maggiore e nel solco
minore.

Le informazioni disposte in questi due solchi sono diverse tra le due coppie.

La coppia G-C è diversa dalla coppia C-G.

La coppia A-T è diversa dalla coppia T-A.

Nel solco minore le due coppie sono disposte in maniera simmetrica e

quindi sono indistinguibili, mentre nel solco maggiore sono disposti
asimmetricamente e quindi si hanno più informazioni.

Le proteine nella maggior parte dei casi interagiscono con il solco maggiore.
L’interazione più usata è l’inserimento di un’α-elica nel solco maggiore del DNA.

L’alfa elica come dimensioni si inserisce bene nel solco maggiore: chiaramente
sull’alfa elica ci saranno gli AA della proteina che faranno la loro interazioni con le
basi e gli elementi che il DNA espone nel solco maggiore.

Le alfa eliche possiedono anche un momento di dipolo, con parziale carica positiva
all’-N al terminale e questo può formare interazioni anche con i gruppi fosfato.

NEI PROCARIOTI:

Il motivo più utilizzato è il motivo elica-giro-elica.

Due α-eliche separate da un tratto destrutturato, ovvero che non ha struttura secondaria stabilità.

L’elica di riconoscimento si inserisce nel solco maggiore.

L’altra alfa elica invece crea delle interazioni per lo più con lo scheletro zucchero fosfato
per mantenere l’elica di riconoscimento nel solco maggiore, serve per il posizionamento
dell’elica di riconoscimento.

I fattori di trascrizione batterici funzionano come dimeri, per lo più come omodimeri.

i siti di riconoscimento che troviamo sul DNA hanno sequenze ripetute e invertite,
in maniera tale che il fattore di trascrizione si mette come dimero e riconosce due
sequenze che vanno in direzioni opposte, il che serve ad avere un legame più forte con il DNA.

L’operone lac è fondamentale per comprendere la trascrizione dei procarioti. L’operone lac fu il primo ad
essere stato individuato dai ricercatori, poi vincitori del Nobel, che capirono che la regolazione
dell’espressione genica avveniva tramite fattori di trascrizione.

Quindi è l’esempio storico e fondamentale per capire la regolazione della trascrizione nei procarioti.

L’operone è un’organizzazione di geni che si trovano uno dietro l’altro che vengono trascritti a partire da un
unico promotore e portano alla formazione di un messaggero policistronico.

I batteri preferiscono mettere insieme vari geni che fanno parte di uno stesso patway metabolico che può
essere o la sintesi di un AA o la sintesi di uno zucchero, ma non tutti i geni batterici sono organizzati in
operoni.

L’operone lac mette insieme dei geni che controllano l’uso del lattosio. Il batterio normalmente usa il
glucosio come fonte di carbonio. L’operone lac non serve sempre, ma solo in assenza di glucosio, per cui si
deve regolare la sua attivazione o meno.
L’operone è formato da tre geni:

- lacZ: codifica l’enzima -galattosidasi che scinde il lattosio in galattosio e glucosio.

- lacY: codifica la permeasi del lattosio, una proteina che si inserisce nella membrana cellulare e
trasporta il lattosio nella cellula.
- lacA: codifica la tiogalattoside-transacetilasi che modifica i tiogalattosidi altrimenti tossici per la cellula.
Il promotore lac,
posizionato all’estremità 5’
di lacZ, dirige la trascrizione
di tutti e tre i geni in un
unico mRNA, che viene
tradotto in 3 prodotti
proteici.
Il promotore dell’operone lac è un promotore debole: le sequenze -10 e -35 non sono sequenze ottimali di
legame con il fattore sigma.

Quando il repressore, il repressore lac, si lega al sito operatore questo impedisce il legame dell’RNA
polimerasi alle sequenze -10 e -35.

L’operatore lac si sovrappone al promotore, e quindi il repressore legato all’operatore

Impedisce fisicamente all’RNA polimerasi di legarsi al promotore e iniziare la sintesi.

È presente all’interno della cellula come tetramero, in condizioni basali il repressore è legato all’operatore,
quando entra il lattosio, questo viene convertito in allo-lattosio dalla -galattosidasi.

È in grado di legare il repressore in un sito allosterico che fa si che il dominio di legame al DNA subisce un
cambio conformazionale, in modo che le α-eliche che si devono inserire vengonro distorte e il repressore
non è più in grado di legare l’operatore e si distacca da essoq.

Ma comunque anche quando il repressore non c’è, l’RNA polimerasi si lega debolmente. Quindi per attivare
una buona trascrizione vi è bisogno di una proteina attivatrice che è la proteina CAP (catabolite activator
protein).

Lega il suo sito a monte delle sequenze -10 e -35,

si lega come dimero, avrà un sito di legame al DNA e un sito di attivazione.

Interagisce con la coda carbossi-terminale della RNA polimerasi e

mantiene l’RNA polimerasi tramite il fattore sigma ferma sul promotore stesso.

La proteina CAP viene regolata allostericamente da cAMP.

I suoi livelli aumentano quando i livelli di glucosio sono bassi.

La proteina CAP lega l’cAMP subisce un cambio conformazionale e si lega al suo sito attivatore.

In assenza di cAMP, CAP non è in grado di legare il DNA.

La proteina CAP può regolare più di 100 geni.

I livelli di cAMP e quindi l’assenza o la presenza di glucosio possono regolare una serie di geni.

L’operone del galattosio è regolato negativamente da un altro repressore che è il repressore del galattosio:
è lo stesso concetto dell’operone Lac, posso usare galattosio se non c’è glucosio, quindi c’è un repressore,
c’è un attivatore che è lo stesso e cioè è di nuovo la proteina CAP.

Ricevettero il premio Nobel per la medicina perché furono i primi a

scoprire come veniva regolata l'espressione genica.

E che ci poteva essere una proteina, un fattore in trans, che andava a

regolare l’espressione di un gene.

Un altro modo per regolare la trascrizione sono i fattori  alternativi.

Il fattore σ 70 è il fattore sigma dell’espressione basale: i geni che servono normalmente a Coli per vivere
hanno tutti delle sequenze di riconoscimento -10 e -35 che vengono riconosciute dal fattore σ 70.

Ma il genoma dei procarioti codifica molte altre subunità  che in alcune circostanze, si possono sostituire a
70
σ ,che possono dirigere la polimerasi su promotori alternativi.
Uno di questi fattori alternativi è il fattore  inducibile al calore, σ 32.

Quando E. Coli viene sottoposto a uno shock termico, nelle cellule aumenta la quantità di questo nuovo
fattore , il quale si sostituisce a σ 70 su una certa percentuale di RNA polimerasi portando questi enzimi a
trascrivere quei geni il cui prodotto protegge la cellula dagli effetti dello shock termico.

In definitiva, quando ha uno stress in Coli, l’espressione basale non la deve più fare: Coli deve bloccare la
trascrizione degli altri geni perché non serve che si metta a fare proteine che poi si denaturano, si devono
piuttosto produrre proteine che vengono in aiuto alle proteine denaturate.
Un altro fattore  alternativo guida il programma di espressione genica quando il batteriofago SPO1 infetta
Bacillus subtilis, e li cresce secondo il ciclo, generando la progenie fagica.

Questo processo richiede che il fago esprima i propri geni in modo estremamente controllato.

I fagi sono dei virus delle cellule

batteriche e quindi sfruttano tutto
il sistema della cellula batterica.

In seguito all’infezione, la RNA polimerasi batterica riconosce i cosiddetti promotori fagici precoci che
codificano le proteine necessarie nei primi momenti dell’infezione.

Il gene 28 codifica un fattore  alternativo.

Che prende il posto del fattore σ 70 batterico e dirige la polimerasi su

una seconda serie di promotori del genoma fagico.

Quelli associati ai geni chiamati intermedi.

A sua volta uno di questi geni codifica il fattore  necessario ai geni virali tardivi.

Questa regolazione assicura che i geni virali siano espressi esattamente nello stesso ordine in cui sono
richiesti per portare a termine l’infezione.
NtrC controlla l’espressione dei geni coinvolti nel metabolismo dell’azoto.

Quando ci sono bassi livelli di azoto il fattore Ntrc verrà fosforilato.

Subendo un cambio conformazionale e in questo modo lega la RNA polimerasi.

L’RNA polimerasi già legata al promotore ma in una conformazione

di complesso chiuso che non consentiva il passaggio a complesso aperto.

Quando la Ntrc viene fosforilata e lega la RNA

polimerasi,
induce la transizione a complesso aperto e attiva
l’espressione dei geni a valle.
La proteina IHF induce una piegatura nel DNA
che porta NtrC nella giusta posizione.

merT è un gene che serve alle cellule per resistere alla presenza di mercurio, che è un metallo tossico per le
cellule.

Il promotore merT è anomalo, ovvero il suo spaziatore è di 19 bp.

Questo comporta che i due elementi di sequenza riconosciuti da , non sono né caratterizzati da una
distanza ottimale ne allineati, infatti si trovano ruotati uno rispetto all’altro, esposti su due facce divere
della doppia elica.

Quando il mercurio è assente la proteina

MerR,proteina che attiva il gene merT, si lega al
promotore e stabilizza la forma inattiva.

In presenza di mercurio MerR subisce un cambio

conformazionale che induce il DNA nel centro del
promotore a ruotare.

Questo riporta le regioni -10 e -35 in una disposizione favorevole per legare
il fattore  e affinché la RNA polimerasi possa iniziare la trascrizione.
AraC controlla l’operone araBAD
Il promotore dell’operone araBAD di E. Coli è attivato in presenza di arabinosio e in assenza di glucosio e
dirige l’espressione dei geni che codificano gli enzimi necessari al metabolismo dell’arabinosio.

L’araC è una proteina che a seconda se lega o meno arabinosio può fare cose diverse. Ci sono due siti di
legami vicini al promotore ed un sito di legame più distante.

 In presenza di arabinosio
araC lega l’arabinosio e lega
due sequenze I 1 e I 2, in
prossimità del promotore in
modo tale da interagire con
la RNA polimerasi e attivare
la trascrizione.

 In assenza di arabinosio
La struttura di araC cambia e la
proteina, invece di legare i due siti
adiacenti, lega i siti I 1e un sito più
distante araO 2, che interagendo
tra loro impediscono ad araC di
legare l’RNA polimerasi e
impediscono di attivare la
trascrizione.
L’operone del triptofano unisce insieme i geni che servono per la biosintesi del triptofano:

 Se il triptofano è assente i geni devono essere espressi

 Se il triptofano è presente i geni devono essere spenti

Nell’operone del triptofano dopo il promotore vi è una sequenza leader, seguita poi dai vari geni.

Vi sono 4 sequenze auto appaianti, la 1 con la 2,la 2 con la 3 e la 3 con la 4.

La regolazione di questo operone avviene a due livelli, ed è un meccanismo utilizzato da molti batteri:

1. Il primo è trascrizionale, simile a quello dell’operone lac ma diverso nel come si esplica. Anche
l’operone del triptofano usa un repressore, il repressore triptofano.
Se il triptofano è basso, il repressore non si deve legare; se è alto, si deve legare. Il repressore dovrà
subire un cambio di conformazione, come il repressore lac, ma in seguito a legame con il triptofano.

Induce un cambio conformazionale, espone il dominio elica-giro-elica e

si lega alla sequenza operatrice. Ma questo livello non basta.

2. Il secondo livello di controllo è post-trascrizionale, coinvolge un fenomeno detto attenuazione.

In generale, i batteri utilizzano il fenomeno dell’attenuazione formando

un terminatore Rho-indipendente, si forma una forcina di terminazione.

Due sequenze che si appaiano tra di loro, che nel caso specifico
del triptofano sono la sequenza 3 e la 4, seguite da un tratto di poli-uridine.

Questo tratto di poli-uridine è necessario affinché la sequenza 3 e la 4 formano la forcina di terminazione.

(cosa che non avviene nelle altre sequenze)

Quando vi è questo appaiamento termina la trascrizione.

Il peptide leader deriva dalla traduzione della sequenza leader e contiene due codoni per il triptofano.

Nei batteri la trascrizione e la traduzione avvengono contemporaneamente.

 Quando il triptofano è elevato, e quindi ci sono sufficienti amminoacil-tRNA caricati con triptofano,
appena esce il trascritto dalla RNA polimerasi, viene occupato dal ribosoma che comincia a tradurre il
peptide leader fino a che arrivi alla forcina di terminazione, dove termina la trascrizione e di
conseguenza anche la traduzione.
 Quando il triptofano è basso, e quindi bassi livelli di amminoacil-tRNA caricati con triptofano, quando il
ribosoma passa sulla sequenza che codifica il peptide leader incontra 2 codoni per il triptofano.

Il ribosoma si blocca sulla regione 1 perché non gli arriva l’amminoacil-tRNA giusto.

La regione 2 avrà il tempo di

appaiarsi con la regione 3, che a
questo punto non potrà appaiarsi
con la regione 4.

Non si formerà la forcina di

terminazione, così la trascrizione
andrà avanti e di conseguenza
anche la traduzione.

 In assenza di sintesi proteica invece, per altri motivi o perché non ci sono sufficienti ribosomi o perché
si è bloccata la sintesi perché la cellula è in stress:

si formano sia la forcina 1-2 che la

forcina 3-4 e quindi termina la
trascrizione perché non ci può essere
traduzione.

Il processo del triptofano è un controllo trascrizionale che dipende dalla traduzione e ciò dal passaggio
del ribosoma e da quanto il ribosoma sosta su una regione piuttosto che un’altra.

Regolazione della produzione delle proteine ribosomiali a livello traduzionale.

 Le proteine ribosomiali fungono da repressori della propria traduzione.

Questo perché il loro messaggero ha una struttura che somiglia

al RNA ribosomiale che normalmente legano nel ribosoma.

Per esempio: la proteina S8 lega l’RNA ribosomiale 16S, in una

specifica regione.
Il suo messaggero a monte ha una regione che somiglia a quella
dell’RNA ribosomiale 16S e che lega anch’essa la proteina S8.

Cosa succede allora nella cellula?

 Se c’è RNA ribosomiale la proteina viene sintetizzata e va
a legare l’RNA ribosomiale e a formare il ribosoma.

 Se non c’è RNA ribosomiale è inutile produrre

proteine ribosomiali, la proteina ribosomiale
viene prodotta, lega il 5’ del suo messaggero e impedisce la traduzione, ovvero si lega in
una regione che blocca il ribosome binding site e impedisce di legare il messaggero
dell’operone.