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Protocollo tossicologico

Irritazione /corrosione dermale acuta


Questo saggio viene fatto per osservare l’eventuale produzione di
alterazioni reversibili di tipo infiammatorio (irritazione) o di danni
irreversibili (corrosione) in seguito all’applicazione acuta di sostanze
sulla pelle e permette di classificarle in base alla loro pericolosità e
di etichettarle (soprattutto ai fini della sicurezza durante la
manipolazione ed il trasporto).
Sono oggi disponibili quattro saggi alternativi che consentono la
riduzione (TER) o la sostituzione (EPISKINTM, EpiDerm e
Corrositex) degli animali.
Misura della resistenza elettrica transcutanea
(TG430)
Potenziale corrosivo delle sostanze in esame.
Il protocollo sperimentale prevede l’uso della pelle
della zona dorsale del ratto della quale viene
misurata la resistenza elettrica transcutanea
(Transcutaneous Electrical Resistance, TER) dopo
trattamento con la sostanza in esame.

Il principio del test si basa sul fatto che se la


pelle viene danneggiata in seguito all’esposizione
alla sostanza, la resistenza elettrica diminuisce
ed è stato stabilito di considerare corrosive le
sostanze con valore di TER <5 kΩ. Si tratta quindi
di un saggio ex vivo che si basa sull’uso di animali,
ma che consente di ridurne il numero perché con
uno solo è possibile effettuare un certo numero di
prove.
Modelli di pelle umana ricostituita (TG431)
Episkin-TM, EpiDerm e Corrositex
Episkin-TM è un kit commerciale, costituito
da una matrice di collagene umano tipo I e
III che rappresenta il derma, coperta da un
film di collagene umano tipo IV su cui è
stratificata epidermide differenziata
derivata da cheratinociti umani. Questi ultimi
vengono esposti alla sostanza in esame e la
vitalità del tessuto è valutata misurando
l’attività mitocondriale con un test come
MTT, comunemente usato nei saggi di
citotossicità.
MTT ASSAY
Principle of assay:
This is a colorimetric assay that measures the reduction
of yellow 3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl
tetrazolium bromide (MTT) by mitochondrial
succinate dehydrogenase.
The MTT enters the cells and passes into the
mitochondria where it is reduced to an insoluble,
coloured (dark purple) formazan product.
The cells are then solubilised with an organic solvent
(eg. isopropanol) and the released, solubilised formazan
reagent is measured spectrophotometrically.
Since reduction of MTT can only occur in metabolically
active cells the level of activity is a measure of the
viability of the cells.
EpiDerm e Corrositex sono simili al
precedente ma, quest’ultimo può essere
utilizzato solo per identificare basi
organiche e acidi inorganici e loro
derivati.
Corrosivo? Vitalità < 50% dopo 3 minuti
Vitalità≥50% dopo 3 minuti e <15%
dopo 1 ora
Irritante? se la vitalità media dopo 20
minuti di esposizione e 42 ore di recupero
risulta <50% rispetto al controllo
negativo.
Irritazione oculare

• Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) TG437


Solo
• Isolated Chicken Eye (ICE) TG438 forteme
nte
• Isolated Rabbit Eye (IRE) irritanti
/irritan
• Hen’s Egg Test on the Chorio-Allantoic ti
Membrane (HET-CAM) danno congiuntivale
Fototossicità : saggio di assunzione del rosso
neutro con cellule Balb/c3T3 ( TG432)

La fototossicità: reazione acuta che può essere


causata da un singolo trattamento con una
sostanza contemporaneamente all'esposizione alle
radiazioni visibili o UV.
Saggio di assunzione del rosso neutro con cellule
Balb/c3T3 ( TG432): prevede l'uso di fibroblasti
di topo (Balb/c 3T3, clone 31), sui quali, dopo
trattamento con la sostanza in esame e dopo
opportuno irraggiamento, viene effettuato il test
di assunzione del rosso neutro.
Questo è un test di vitalità che si basa
sull'assorbimento del colorante vitale all'interno
dei lisosomi delle cellule ancora integre.
Test di genotossicità
TEST di MUTAGENESI programma ICH
(International Conference on Harmonization)

E’ un test di mutazione genica su batteri


Un test di mutazione genica in un sistema
procariotico in presenza o meno di
induttori del metabolismo (es AROCLOR:
miscela di bifenili policlorurati)
Un test di aberrazioni cromosomiche in
colture di cellule di mammifero
Un test in vivo
TEST di MUTAGENESI
Test a breve termine di uso routinario
In vitro
• Ames test (OECD 471)
• Test di mutazione genica in cellule di mammifero
(OE OECD 476)
• Test di aberrazioni cromosomiche (OECD 473)
• Test del micronucleo (OECD 487)
In vivo
• Test di aberrrazioni cromosomiche (OECD 475)
• Test del micronucleo (OECD 474)
• Test dell’UDS nel fegato del ratto (OECD 486)
• Comet assay in vivo/vitro
Test di Ames
Screening per gli agenti chimici che si
sospettano capaci di mutagenicità e
cancerogenicità utilizzando ceppi di
Salmonella typhimurium
Stabilisce la capacità della sostanza di indurre
mutazioni in un ceppo di salmonelle (in genere
istidina +) in cui è compromessa la via
biosintetica dell’istidina per mutazione
selettiva sul gene corrispondente ad un
enzima chiave della biosintesi (istidina -)
Il mutageno può determinare con alta
probabilità una nuova mutazione
corrispondente nel gene compromesso
(reversione), permettendo cosi al batterio di
risintetizzare l’aminoacido essenziale istidina
TEST DI AMES composto chimico
da analizzare
ceppo di salmonella (cancerogeno
che non sintetizza diretto)
istidina cresciuto
in medium contenente
istidina

Ciò casualmente,
può revertire il
fenotipo deficiente
la sostanza chimica (se dei batteri determi-
mutagena/cancerogena) induce nando la comparsa di
mutazioni nel genoma batterico. cloni in grado di sin-
+ tetizzare istidina
+ +
+

I batteri mutati (e quindi la mutagenicità/


cancerogenicità della sostanza in esame)
vengono evidenziati seminando i batteri in
terreno privo di istidina
• Il test così ideato non permette però lo
smascheramento dei procancerogeni in quanto,
per esercitare la loro attività oncogena queste
sostanze necessitano dell'attivazione
metabolica che avviene all'interno di tessuti di
organismi superiori.
Per sopperire alla lacuna, il test di Ames è stato
modificato, introducendo nel medium di coltura
delle salmonelle un estratto di enzimi
microsomali epatici, la frazione S9 appunto,
responsabili dell'attivazione di molti
procancenrogeni.
Limiti del test di AMES
Essendo condotto in cellule batteriche, il test di Ames
non consente di valutare la capacità dei mutageni di
alterare la struttura cromosomica del DNA umano, per
cui non può da solo costituire un elemento sufficiente di
valutazione del rischio genotossico, ma va eseguito
insieme a test su cellule eucariotiche (test dei
micronuclei, test della cometa, quantificazione degli
addotti al DNA) e su animali in vivo.
Vi è comunque una buona correlazione fra l'effetto
mutageno riscontrato nel test di Ames e la
cancerogeneità della sostanza negli organismi superiori.

Inoltre molti procancerogeni subiscono una attivazione


extraepatica, (stomaco, intestino, cute): in queste sedi
inducono tumori. L’uso della frazione S9 risulta inutile e
le sostanze in questione non vengono riconosciute come
mutagene.
Marcatori citogenetici
possono essere rilevati
mediante:
• analisi in metafase
(aberrazioni
cromosomiche
numeriche e strutturali,
scambi tra cromatidi
fratelli);
• analisi in interfase
(micronuclei).
Comet assay : Può essere condotto sia in
vitro che in vivo
La finalità del test è quella di verificare la
capacità clastogena di una sostanza chimica
o di un agente fisico, ovvero di saggiare se
questa sia in grado di generare danni strutturali
nei cromosomi, con conseguenti mutazioni
cromosomiche.
I danni possono essere rotture del singolo
filamento di DNA (SSB, single strand breaks) o
del doppio filamento (DSB, double strand
break): in entrambi i casi, a seconda delle
condizioni sperimentali, possono formarsi
frammenti cromosomici
Mediante l’analisi della migrazione del DNA
di singole cellule è possibile determinare la
presenza di rotture della catena del DNA
in modo molto sensibile.
In confronto ad altri metodi per la
rivelazione di danni al DNA, questo offre il
vantaggio
• di poter essere effettuato su una
quantità di cellule relativamente piccola
• di poter valutare danni su singola cellula
• di non richiedere la moltiplicazione
cellulare.
Il DNA non danneggiato si presenta nel
nucleo in forma condensata e non migra in
direzione dell’anodo, le rotture della
catena (e i siti labili che si sono risolti in
rotture) fanno si che si formino dei
frammenti che possono migrare dal nucleo
della cellula per dare una coda
caratteristica (coda di cometa)
Test della cometa (in vitro e in vivo)
(A) cellule con DNA
non danneggiato;
(B) cellule con DNA
moderatamente
danneggiato;
(C) cellule con DNA
fortemente
danneggiato.
Limiti comet assay
Il test della cometa è in grado di stabilire
se un agente induce la formazione di danni
al DNA, ma non permette di determinare
l'entità del danno o la porzione di
genoma che lo ha subito. Per questo, per
avere dei risultati sperimentali più
specifici, deve essere accompagnato da
altri test di mutagenesi come il test dei
micronuclei sperimentali più specifici,
TEST DEI MICRONUCLEI
Permette di identificare sostanze che causano perdita di
cromosomi o rotture cromosomiche, per cui un
micronucleo può contenere interi cromosomi o un
frammento acentrico.
Le cellule più comunemente usate sono i linfociti
umani di sangue periferico e le linee cellulari di Hamster
Le colture cellulari vengono esposte alla sostanza da
testare (max conc. 1 mM o 0.5 mg/ml) in assenza e in
presenza di un sistema di attivazione metabolica (S9)
Ad intervalli di tempo predeterminati, le cellule vengono
trattate con una sostanza che blocca la divisione
cellulare, raccolte, colorate ed analizzate al microscopio
per la presenza di micronuclei
TEST DEL MICRONUCLEO IN CELLULE DI
MAMMIFERO (OECD No. 487 DRAFT)
Test del micronucleo in • Rivela i danni sia cromosomici che
cellule eritropoietiche di dell’apparato mitotico che una sostanza
roditori (in vivo) (OECD o un suo metabolita può provocare dopo
474) somministrazione ad un roditore (topo
o ratto)
Micronuclei in • Il metodo è basato sull’aumento, nel
midollo osseo, degli eritrociti
reticolociti di topo
policromatici micronucleati negli
colorati con arancio animali trattati, rispetto agli animali di
di acridina controllo
• I micronuclei sono costituiti da
frammenti cromosomici o da cromosomi
interi che durante la mitosi non
raggiungono i poli del fuso e non
vengono inclusi nel nucleo delle cellule
figlie
• I micronuclei rimangono nel citoplasma
dell’eritrocita policromatico, mentre il
nucleo principale è espulso
SCHEMA SPERIMENTALE

Topi di 5-7 settimane o ratti di 7-9 settimane


5 maschi e 5 femmine per gruppo sperimentale
3 dosi della sostanza in esame + un controllo negativo
e un controllo positivo
La dose più alta dovrebbe essere la massima dose
tollerata (MTD) o la massima tecnicamente
somministrabile.
Singola somministrazione, anche se si possono
eseguire trattamenti ripetuti, in base ad indicazioni
tossicologiche
Il prelievo del midollo osseo viene eseguito 24 e 48
ore dopo la somministrazione della sostanza.
VALUTAZIONE DEI RISULTATI

La percentuale degli eritrociti policromatici


micronucleati dei gruppi trattati con la
sostanza in esame viene confrontata con il
gruppo di controllo utilizzando test statistici
La sostanza viene considerata positiva se
almeno due gruppi di trattamento, con una
relazione biologica tra di loro, inducono un
aumento statisticamente significativo degli
eritrociti policromatici micronucleati rispetto
al controllo negativo.
Valutazione dei risultati dei tests di mutagenesi

• I tests di mutagenesi (in vitro e in vivo)


individuano cancerogeni che agiscono
attraverso un meccanismo che implica un
danno genetico diretto. Non
individuano cancerogeni non genotossici.
• Se i risultati della batteria di tests
indicano l’assenza di un potenziale
genotossico
TOSSICOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE E
DELLO SVILUPPO
La tossicologia riproduttiva si occupa di:
• Studio delle azioni tossiche delle sostanze chimiche
in tutti gli ambiti della riproduzione
• Valutando in animali da laboratorio la possibilità che
uno xenobiotico induca:
1. Alterazioni della fertilità
2. Danni pre e postnatali
3. Difetti nelle generazioni successive
La tossicologia dello sviluppo si occupa di:
• Studio dei danni dell’organismo in crescita
riconducibili ad esposizione a sostanze chimiche
• prima del concepimento
• durante lo sviluppo intrauterino e postnatale
• fino alla maturazione sessuale
TOSSICOLOGIA DELLA
RIPRODUZIONE E DELLO SVILUPPO
• Fertilità maschile
• Fertilità femminile
• Fecondazione
• Periodo pre-impianto
• Impianto in utero
• Organogenesi
• Periodo fetale
• Parto e periodo post-natale
Le valutazioni del rischio per l’uomo nella
tossicologia del sistema riproduttivo sono
particolarmente difficili a causa della
complessità e della durata del ciclo
riproduttivo
• L’unione dei gameti maschili e femminili con
corredo cromosomico normale
• Il decorso della segmentazione, l’impianto, lo
sviluppo intrauterino, la nascita, la fase
postnatale con l’allattamento
• Lo sviluppo fino alla maturità riproduttiva
nelle generazioni successive
Alterazioni della fertilità
maschile
La spermatogenesi è ormono-dipendente, si
instaura dopo la pubertà e procede
continuamente, senza alcun ciclo, fino ad età
avanzata.
Avviene nei testicoli, all’interno dei tubuli
seminiferi, dove le cellule del Sertoli, oltre a
secernere ormoni e proteine importanti per il
processo, formano le basi funzionali per la
barriera sangue-testis, che impedisce
l’ingresso di sostanze polari e macromolecolari
nei tubuli.
Gli xenobiotici possono indurre i seguenti
danni al sistema riproduttivo maschile:
1. Impedimento alla formazione degli
spermatozoi (etanolo, metalli pesanti,
agenti citotossici)
2. Danno alla loro capacità fertilizzante
(antiandrogeni, sulfasalazina, agenti
citotossici)
3. Anomalie nella discendenza (agenti
citotossici)
Alterazioni della fertilità femminile
Nella donna, dalla pubertà alla menopausa,
maturano circa 400 oociti. Durante il ciclo
ovarico mensile nell’ovaia matura una sola
cellula uovo in ogni follicolo primario.
Durante la maturazione dell’oocita, poco
prima dell’ ovulazione avviene il
dimezzamento del corredo cromosomico
Agenti genotossici possono danneggiare il
DNA degli oociti durante la meiosi e alterare
la fertilità.
Danni di questo tipo portano a morte dell’
embrione nella prima fase della gravidanza.
PRINCIPI DELLA TERATOLOGIA
• La sensibilità dell’embrione o del feto nei confronti di agenti
tossici dipende dal suo genotipo e da fattori ambientali (salute
materna, ecc..)
• La sensibilità dell’embrione o del feto nei confronti di agenti
tossici dipende dallo stadio del suo sviluppo
• Agenti embriotossici differenti agiscono con relativamente pochi
meccanismo specifici che possono portare ad alterazioni dello
sviluppo embrionale
• In uno sviluppo embrionale danneggiato sono possibili i seguenti
processi:
1. Riparazione e sviluppo normale
2. Morte
3. Inibizione della crescita
4. Malformazioni
5. Alterazioni delle funzioni degli organi
6. Tumori
• Il modo con cui l’agente embriotossico raggiunge l’embrione
dipende dalle sue caratteristiche fisico-chimiche
• L’effetto embriotossico è dose-dipendente
Modalità d’azione di uno xenobiotico sul feto:

1) somministrazione diretta;
2) dopo passaggio transplacentare;
3) indiretta sulla placenta;
4) secondaria ad azione sull’organismo
materno.
Periodi vulnerabili o critici nello sviluppo
dell’embrione umano. I periodi molto vulnerabili
sono in grigio, quelli sensibili in bianco.
MECCANISMI DI TERATOGENESI
• Mutazioni
• Rottura di cromosomi (clastogenesi)
• Alterazioni della mitosi
• Citotossicità e morte cellulare
• Modificazioni strutturali e funzionali degli acidi nucleici
• Ridotto rifornimento di precursori o substrati
• Ridotto apporto energetico
• Alterazioni della membrana
• Squilibrio osmolare
• Inibizione enzimatica (diidrofolato reduttasi, sistema RAS)
• Alterazione del movimento cellulare
• Alterazione nell’espressione di geni che controllano lo
sviluppo embrionale
• Alterazione nella trasduzione dei segnali di controllo dello
sviluppo
BARRIERA PLACENTARE
• La placenta rappresenta un’efficace barriera
solo per singole somministrazioni di farmaci
idrosolubili. Per somministrazioni ripetute è
possibile che il farmaco raggiunga gradualmente
una concentrazione apprezzabile anche nel
sangue fetale.
• I farmaci liposolubili passano agevolmente la
barriera placentare
• La placenta è fornita di sistemi di trasporto
attivo e di attività endocitosica
• La barriera placentare è pienamente efficiente
alla fine del secondo mese di gestazione
CARATTERISTICHE DEI TERATOGENI

Un teratogeno può essere:


1. Specie specifico
2. Organo specifico (stadio dello sviluppo
embrionale)
3. Dose specifico (dose soglia e dose-
dipendenza)
La relazione dose-effetto in tossicologia
prenatale.
Solo in seguito al superamento di una dose
soglia si manifestano effetti
embriotossici e teratogeni negli
esperimenti su animali. I dati si basano sul
numero (in %) di embrioni danneggiati per
ogni madre.
PROTOCOLLI SPERIMENTALI
Linee guida internazionali (Conferenza internazionale di
armonizzazione: ICH) per lo studio della tossicologia del
sistema riproduttivo
ANOMALIE CROMOSOMICHE
METODO DEI DOMINANTI LETALI
Le cellule staminali degli spermatogoni si dividono lentamente
ogni 6 -8 gg.
Gli spermatogoni si dividono ogni 26 – 32 ore
L’elevato numero di mitosi è utile per rilevare la clastogenesi
Dopo il trattamento i maschi sono accoppiati a intervalli di 4 –
7 giorni con femmine non trattate
nel periodo compreso fra il 14° - 16° giorno di gestazione le
femmine sono sacrificate
Si valutano: riassorbimento, embrioni morti precocemente o
tardivamente
Le mutazioni dominanti letali si basano su aberrazioni
cromosomiche strutturali delle cellule germinali e danno
indicazioni indirette sull’azione clastogena di una sostanza
SEGMENTO I Studi di Fertilità
Per valutare gli effetti su:
Scopo: – Ciclo estrale
• Accertare la – Accoppiamento
– Fertilità
capacità
– Dimensioni della nidiata
riproduttiva di un
– Mortalità embrio/fetale
animale trattato – Peso dell’embrione e del
prima/durante feto
l’accoppiamento e – Morfologia del feto e
nella fase di della placenta
impianto – Vitalità degli spermi
SEGMENTO I Studi di Fertilità
Studi di Fertilità- Maschio Studi di Fertilità- Femmina

Somministrazioni- Somministrazione- 2
60 giorni prima settimane prima
dell’accoppiamento e
dell’accoppiamento
fino GD7
Accoppiamento Accoppiamento
Laparotomia Laparotomia GD 21
Esame esterno della
nidiata
SEGMENTO II Studi di Sviluppo
Scopo:
Individuare effetti • Accoppiamento-
tossici sulla femmina Femmine trattate/
gravida sull’embrione Maschi
/feto in seguito ad • Trattamento GD 6 -
esposizione nel periodo GD 15 (organogenesi)
dall’impianto a tutta • Laparotomia
l’organogenesi • Nati
– Esame esterno
– Esame interno
– Esame dello scheletro
SEGMENTO III Studi Peri/Post Natali
Scopo: Individuare Si esamina:
possibili effetti – Dimensioni della nidiata
tossici esercitati – Cure parentali postpartum
durante gestazione/ – Mortalità postnatale
allattamento e dopo la – Accrescimento
nascita dopo – Riflessi
esposizione dal periodo – Sviluppo morfologico
dell’impianto allo – Apprendimento e memoria
svezzamento 20. – Sviluppo delle funzioni
Lo sviluppo dei nati è riproduttive
seguito fino alla Riflessi
– Trasalimento acustico
maturità sessuale.
– Pupillare
Studi multigenerazionali

Sviluppo delle funzioni riproduttive


– Discesa dei testicoli
– Apertura della vagina
– Ciclo estrale (Femmine F1)
– Coabitazione/Accoppiamento
– Laparotomia
– Esame dei nati F2
- Esame dei nati F3
Studio multigenerazionale tossicità
riproduttiva
Sistema riproduttivo-endocrino
“Interferenti endocrini” “Immunotossici”:
(EDC)*: Agiscono
Influenzano il direttamente o
sistema endocrino indirettamente sul
agendo come sistema
antagonisti o immunitario
agonisti (inibizione,
disregolazione)

Interferenza con il sistema riproduttivo


Sistema endocrino
Il sistema endocrino è costituito da una rete
di ghiandole, ormoni e recettori
è importante per il controllo e la
regolazione di tutte le maggiori
funzioni e processi dell’organismo:
riproduzione,
crescita e sviluppo,
comportamento,
immunità,
controllo energetico
Endocrine Disrupting Chemicals (EDC)
Sostanze che alterano il funzionamento del
sistema endocrino, causando effetti
avversi alla salute di un organismo o alla
sua progenie……
….interferiscono con la produzione, il rilascio,
il trasporto, il metabolismo, il legame,
l’azione o l’eliminazione di ormoni che,
naturalmente presenti nell’organismo, sono
responsabili del mancato mantenimento
dell’omeostasi e
della regolazione dei processi di sviluppo,
della riproduzione e del comportamento
La riproduzione e lo sviluppo pre-e postnatale
sono le fasi biologiche più sensibili agli effetti
endocrini degli EDC
Gli effetti indesiderati degli EDC finora osservati,
mediante studi in vivo e in vitro sono:

-la compromissione della capacità


riproduttiva
-la presenza di difetti morfologici o
funzionali alla nascita
-lo sviluppo del cancro
-alcune alterazioni del sistema
immunitario e altri effetti
Fonti di interferenti endocrini
BIOACCUMULO E CATENA ALIMENTARE

Gli EDC hanno carattere lipofilo e questo


permette loro di diffondere attraverso la
membrana cellulare, di legare
eventualmente i recettori per gli ormoni
steroidei e di accumularsi a livello del
tessuto adiposo. Il loro bioaccumulo ha
sicuramente una notevole importanza dal
punto di vista tossicologico
Il bioaccumulo si attua lungo la catena
alimentare (un organismo superiore ingerisce e
accumula la somma dei composti chimici
presenti in grandi quantità di organismi
inferiori, che utilizza come cibo). Ciò spiega
come livelli molto bassi di un composto chimico
nell'aria, nell'acqua o nel suolo possano avere
come conseguenza livelli maggiori nelle piante,
più elevati negli erbivori, e ancora più elevati
nei carnivori. Il passaggio di queste sostanze
dall'acqua ai suoi abitanti (pesci, crostacei e
molluschi) determina il loro ingresso nella
catena alimentare
MECCANISMI
Meccanismi:
Mimare l’attività biologica di un ormone
legandosi a un recettore nucleare (effetti
agonisti).
Ostacolando il legame dell’ormone naturale
(effetti antagonisti).
Legarsi alle proteine di trasporto nel sangue
alterando la quantità di ormoni circolanti.
Interferire con i processi metabolici
incidendo sulla velocità e capacità di sintesi
degli ormoni
Androgenomimetici
Antiandrogeni
Estrogenomimetici
Antiestrogeni
Inibitori tiroidei
Agonisti dei
recettori degli
idrocarburi
arilici
Agonisti dei
retinoidi
GLI INTERFERENTI ENDOCRINI: CHI
SONO?
• FITOESTROGENI
• FTALATI
• BISFENOLO A (Alchilfenoli)
• ALCHILFENOLI
• PCBs e DIOSSINE *
• PESTICIDI
• PARABENI
• ALCUNI METALLI PESANTI (piombo,
cadmio e mercurio)
*contaminanti organici persistenti (acronimo
inglese, POPs)
Diossine
Con il termine generico di “diossine” si indica
un gruppo di 210 composti chimici aromatici
policlorurati, ossia formati da carbonio,
idrogeno, ossigeno e cloro, divisi in due
famiglie: dibenzo-p-diossine (PCDD o
propriamente “diossine”) e dibenzo-p-furani
(PCDF o “furani”). Si tratta di idrocarburi
aromatici clorurati, per lo più di origine
antropica, particolarmente stabili e
persistenti nell’ambiente, tossici per l’uomo,
gli animali e l’ambiente stesso; le diossine e i
furani costituiscono infatti due delle dodici
classi di inquinanti organici persistenti
(Persistent Organic Pollutants POPs*)
La tossicità delle diossine dipende dal numero
e dalla posizione degli atomi di cloro sull’anello
aromatico, le più tossiche possiedono 4 atomi
di cloro legati agli atomi di carbonio β
dell’anello aromatico e pochi o nessun atomo di
cloro legato agli atomi di carbonio α dell’anello
aromatico
Nella terminologia corrente il termine
“diossina”, al singolare questa volta, è talora
usato come sinonimo della 2,3,7,8-
tetracloro-dibenzo-p-diossina (TCDD), ossia
del congenere maggiormente tossico (unico
riconosciuto possibile cancerogeno per l’uomo),
che ha 4 atomi di cloro nelle posizioni β e
nessuno in α
• Le diossine sono sostanze semivolatili, termostabili,
scarsamente polari, insolubili in acqua, altamente
liposolubili, estremamente resistenti alla
degradazione chimica e biologica.
• Le diossine sono sostanze che si accumulano nei
tessuti grassi degli organismi, quindi se erba e suolo
contaminati vengono ingeriti da erbivori si verifica
un accumulo di queste sostanze nei grassi delle loro
carni e nei grassi del latte prodotto.
• L’ingresso delle diossine nella catena alimentare
acquatica avviene, soprattutto, ad opera del
particolato (deposizione secca ed umida, erosione,
scarichi, ecc.) che viene trasferito nell’ambiente
acquatico. La natura lipofilica (affine ai grassi) delle
diossine e la loro bassa solubilità in acqua fa sì che
queste siano adsorbite ai composti organici e
bioaccumulate negli organismi acquatici
L’uomo può venire in contatto con le diossine
attraverso tre principali fonti di esposizione:
accidentale, occupazionale ed ambientale.
La prima riguarda contaminazioni dovute ad
incidenti, la seconda riguarda gruppi ristretti di
popolazione (professionalmente esposti), come nel
caso di coloro che lavorano nella produzione di
pesticidi o determinati prodotti chimici.
La terza è esposizione ambientale, infine, può
interessare ampie fasce della popolazione e può
avvenire, per lo più, attraverso l’alimentazione con
cibo contaminato: recenti studi hanno stimato che
circa il 95% dell’esposizione alle diossine avviene
attraverso cibi contaminati ed, in particolare, di
grassi animali
Esposizione a PCDD, PCDF e PCB attraverso il
cibo (adattato da dati EPA 2004)

L’assunzione di latte e latticini


contaminati rappresenta
approssimativamente il 37%
dell’esposizione, tuttavia una percentuale
apprezzabile del totale deriva
dall’assunzione di carni bovine, suine e di
pesce.
Le diossine vengono emesse in atmosfera, da
una o più sorgenti, e possono essere
trasportate per grandi distanze e
successivamente depositarsi, ed essere
ritrovate nell’acqua, nei suoli e nei sedimenti.
Le diossine possono quindi depositarsi sul suolo
e sulle parti arboree dei pascoli e dei
seminativi rendendosi così disponibili per
l’ingestione da parte degli animali da pascolo e
da allevamento; possono inoltre essere
trasportate dalle acque superficiali e raccolte
nei sedimenti e raggiungere quindi la fauna
ittica SORGENTI SECONDARIE
Le diossine non vengono prodotte intenzionalmente,
non avendo alcun utilizzo pratico, ma sono
sottoprodotti indesiderati di una serie di processi
chimici e/o di combustione.
• Esse possono originarsi dai processi chimici di
sintesi relativi ai composti clorurati e dai
processi di combustione non controllata che
coinvolgono vari prodotti quali: materie plastiche,
termoplastiche, termoindurenti, ecc., nonché
reflui e rifiuti contenenti composti clorurati; per
questo motivo tali processi vengono indicati come
“sorgenti primarie”.
Le sostanze che producono diossine a
seguito della loro combustione vengono
indicate come “precursori”, mentre
quelle che presentano tracce/residui di
diossine in conseguenza del loro
processo di produzione costituiscono
delle “riserve” in grado di rilasciare
diossine nell’ambiente con modalità
dipendenti dal tipo di utilizzazione e
gestione
Il primo incidente industriale, ufficialmente registrato risale al
1949 e avvenne in un impianto chimico della Monsanto, a Nitro,
West Virginia47 (USA). L’impianto produceva il 2,4,5-T (acido
triclorofenossiacetico), un erbicida che costituiva circa il 50% del
defoliante “Agent orange”, a partire dal 2,4,5-triclorofenolo. Nel
1949, un reattore pressurizzato dell’impianto esplose,
determinando l’esposizione di centinaia di lavoratori.

Midland, USA (Anni ‘60) la Dow Chemical la più grande industria


chimica degli USA, leader nella produzione di plastiche e pesticidi.
Sin dal 1948, la Dow produceva gli erbicidi 2,4-D (acido
diclorofenossiacetico) e 2,4,5-T (acido triclorofenossiacetico),
entrambi contaminati da diossine, che si originavano nel processo
di produzione. Mescolando questi due erbicidi in parti uguali, la
ditta produceva il cosiddetto Agent Orange.
Vietnam (1963-1975) “Agent Orange”
(Agente Arancione) era il nome in codice di un
erbicida sviluppato per scopi militari, adatto,
principalmente, per applicazioni in territori con
clima tropicale soprattutto per il fogliame largo,
come quello che caratterizzava le giungle del sud-
est asiatico.
Il nome derivava dal colore della banda che
avvolgeva le cisterne usate per contenere il
prodotto. Si stima che durante la guerra, in
Vietnam, furono usati 72 milioni di litri di
questo prodotto.
Sabato 10 luglio 1976, a Seveso, una nube tossica
fuoriuscì da un reattore dell’impianto della azienda
chimica ICMESA (Industrie Chimiche Meda Società)
con 170 dipendenti e di proprietà della società
Givaudan di Ginevra, a sua volta acquisita dal gruppo
Hoffmann-La Roche. L’impianto era situato nel
comune di Meda, al confine con la cittadina di
Seveso, circa 15 km a nord di Milano, e produceva
intermedi per l’industria cosmetica e farmaceutica,
tra i quali il 2,4,5-triclorofenolo (TCP), composto
tossico non infiammabile utilizzato come base per la
sintesi di erbicidi
Meccanismo d’azione
La diossina agisce legandosi ad un recettore citoplasmatico
detto “Aryl Hydrocarbon Receptor” o AhR.

Il legame TCDD-AhR provoca il rilascio da AhR della proteina


regolatrice inibitoria Hsp90, una health shock protein,
(oltre ad un polipeptide simil chaperone detto p23), e la
migrazione del complesso nel nucleo dove, legato il fattore
ARNT (Ah Receptor Nuclear Traslocator), induce la
trascrizione di geni specifici.

Questi geni, denominati DRE (Dioxin Responsive Elements),


situati nelle adiacenze del gene CYP1A1, che regola le
sintesi del citocromo microsomiale P-450 ( induttori), sono
implicati nei meccanismi di differenziazione e divisione
cellulare, nel metabolismo di alcuni ormoni come quelli
tiroidei e di alcuni fattori di crescita.
Il tipo di geni trascritto dipende:

1. dal tipo di miscela diossina,


dall’affinità di questi di unirsi al
recettore AhR (ne esistono 3
isoforme)
2. dalla concentrazione dell’inquinante
dalle modalità di esposizione
3. dai tipi cellulari maggiormente
coinvolti
4. dalla variabilità biologica della
risposta metabolica individuale
Nell’uomo la TCDD è forse il più potente promotore tumorale
noto, non agisce cioè direttamente come sostanza
cancerogena, ma favorisce la progressione tumorale una
volta che la cellula sia stata a contatto con dosi
subcancerogene di un cancerogeno vero.
Il ruolo fisiologico del recettore AhR non è ancora
noto.

• È stato ad esempio riportato che AhR interagisce


fisicamente con il prodotto dell’oncogene del
retinoblastoma.
• La diossina è in grado di causare una forte
deplezione epatica di vitamina A, provocandone
una rapida escrezione nelle feci e nelle urine,
vitamina anch’essa coinvolta nei processi di
differenziazione cellulare.
• Molti degli effetti di intossicazione da diossina
sono infatti sovrapponibili a quelli da ipovitaminosi
A: ritardo nell’accrescimento, cheratosi, lesioni
epiteliali, immunosoppressione, ipofertilità e effetti
teratogeni
Tossicologia clinica
Le principali manifestazioni da intossicazione
da diossina comprendono la cloracne,
l’endometriosi, l’infertilità maschile,
malformazioni fetali e cancro.
Cloracne è una manifestazione dermatologica
simile all’acne giovanile, ma che si può
manifestare in qualunque parte del corpo e a
qualsiasi età in seguito all’esposizione di
diossina. È spesso accompagnata da gravi
sfigurazioni, dolori alle articolazioni, mal di
testa, affaticamento, irritabilità e
stanchezza cronica. La malattia può
protrarsi, nei casi più gravi, anche 30 anni
Endometriosi
si instaura quando frammenti di tessuto
endometriale si impiantano fuori della cavità
uterina
Questi tessuti ectopici rispondono ogni mese alla
normale azione ormonale come farebbero nel
tessuto uterino, ispessendosi, sfaldandosi e
sanguinando. I prodotti di questa azione, non
potendo essere allontanati naturalmente, restano
in loco, risultando responsabili di aggregati
ematici, di formazioni cistiche e trombi.
Negli animali da esperimento l’associazione è
dimostrata, nell’uomo meno, anche se
l’integrazione dei vari studi sembra appoggiare
questa ipotesi.
Infertilità maschile L’esposizione alla
diossina riduce i livelli di testosterone già a
una dose di accumulo di soli 17 ng/Kg, valori
facilmente riscontrabili anche in soggetti
non esposti professionalmente.
La diminuita conta spermatica sembra essere
correlata all’azione simil-estrogenica della
diossina, lo stesso motivo chiamato in causa
nell’endometriosi femminile.
La diossina colpisce con effetti teratogeni in
particolar modo l’apparato riproduttivo
maschile.
Sistema immunitario
Il sistema immunitario rappresenta uno dei
bersagli della diossina.
Molte evidenze sperimentali su animali da
laboratorio indicano un’attività immunosoppressiva
a carico della serie bianca su topi e scimmie
Rhesus già a concentrazioni normalmente
riscontrabili nelle popolazioni normali dei paesi
industrializzati (10 ng/Kg). Si riscontrano una
diminuzione della secrezione immunoglobulinica e
una minor resistenza alle infezioni batteriche,
virali e parassitarie
Il legame della diossina col recettore AhR
porta alla ubiquitinazione (processo
biochimico nel corso del quale le proteine da
degradare vengono marcate con l’ubiquitina e
poi avviate verso il proteasoma) dello stesso
e quindi l’avvio alla degradazione
proteasomica, l’emivita del recettore ne
risulta fortemente ridotta.
Il legame diossina-AhR porta alla degradazione
via ubiquitina-proteasomi del recettore alfa
per gli estrogeni (ERalfa) in linee cellulari di
cancro mammario umano, e gli autori
suppongono meccanismi simili in altre
distruzioni endocrine mediate dal recettore
AhR.
L’incidenza di cancro al seno è stata
dimostrata
Sistema nervoso
Significativi aumento di tutti gli indici di rischio per neuropatia
periferica nei veterani del Vietnam. A livello comportamentale
sono stati registrati un eccesso di casi di ansietà, depressione e
altre difficoltà psicologiche.
In generale, gli individui maggiormente esposti risultano essere i
neonati per la suscettibilità del loro stato ed il passaggio
transplacentare prima e col latte poi degli inquinanti.
È stata riscontrata immaturità motoria e iporiflessia alla
nascita e un diminuito score psicomotorio fino ai due anni di
età. Questi ed altri indici alterati sono stati tutti ampiamente
dimostrati su diversi animali da laboratorio.
Per quanto molte altre ricerche siano indispensabili, una base
biochimica di queste alterazioni sembra essere una
diminuzione di dopamina nei gangli della base
e nella corteccia prefrontale
Nelle scimmie il livello di accumulo in grado di ridurre le capacità
di apprendimento in soggetti giovani sono di 42 ng/Kg.
Cancro
• A 20 anni da Seveso è stato riscontrato un
aumento di mortalità per tutte le forme di
cancro considerate assieme
• Considerate isolatamente risultano
maggiormente aumentato il cancro al retto,
al polmone, linfomi Hodgkin’s e non-
Hodgking’s, leucemia mieloide.
• È stato riscontrato un aumento di incidenza
nel cancro al fegato nella popolazione
vietnamita residente nella zona della via Ho
Chi Minh rispetto alla popolazione di Hanoi
• In una recente meta-analisi è stato
riscontrato un aumento della mortalità da
cancro in lavoratori professionalmente
coinvolti.
PCB
I policlorobifenili (PCB) sono una serie di composti aromatici
biciclici costituiti da molecole di bifenile variamente
clorurate.
A differenza delle diossine, quindi, i PCB sono sostanze
chimiche prodotte deliberatamente tramite processi
industriali.
I PCB vengono ricavati a partire dal petrolio e dal catrame,
dai quali si estrae il benzene, che viene poi trasformato in
bifenile. Il bifenile viene successivamente clorurato a
policlorobifenile. In base alla posizione degli atomi di cloro
nella molecola del bifenile si possono ottenere 209 congeneri.
Solo 12 dei 209 congeneri dei PCB, i cosiddetti coplanari,
presentano caratteristiche chimico-fisiche e tossicologiche
paragonabili alle diossine e ai furani: questi vengono definiti
PCB dioxin-like (cioè simili alle diossine) e indicati con la sigla
PCBdl.
• Vengono utilizzati come fluidi dielettrici
(per limitare il flusso di corrente, per
esempio nei trasformatori) e come additivi
per antiparassitari, ritardanti di fiamma,
isolanti, vernici e altro.
I PCB sono scarsamente solubili in acqua, molto
solubili nei grassi, resistenti alla degradazione
chimica, fisica e biologica. Nell’ambiente si
accumulano nella componente organica dei suoli
e entrano nella catena alimentare
concentrandosi soprattutto nella parte lipidica
degli alimenti. Salendo lungo la catena
alimentare raggiungono l’uomo che li assume
soprattutto attraverso il consumo di grassi
animali.
La tossicità dei PCB, dimostrata su animali
di laboratorio, e sull’uomo in seguito a
esposizione occupazionale e accidentale, si
manifesta con:
1. disordini cutanei
2. perdita di peso
3. danni epatici
4. disfunzioni endocrine e riproduttive.
La IARC ha classificato i PCB come
probabili cancerogeni per l’uomo (Gruppo
2A) , ma li ha recentemente inseriti nella
lista delle sostanze da valutare o rivalutare
fra il 2010 e il 2014
Ftalati
Gli ftalati sono esteri dell'acido ftalico.
Sono sostanze in genere poco solubili in acqua,
molto solubili negli oli
I più noti composti di questa classe sono:
• il di-2-etilesilftalato (o diottilftalato, DEHP) - plastificante
principe del PVC per via del suo basso costo
• il diisodecilftalato (DIDP)
• il diisononilftalato (DINP)
• il benzilbutilftalato (BBzP) - usato nel PVC espanso
Gli ftalati sono una famiglia di composti chimici usati
nell'industria delle materie plastiche come agenti plastificanti,
ovvero come sostanze aggiunte al polimero per migliorarne la
flessibilità e la modellabilità.
Il PVC è la principale materia plastica addizionato ad esso, lo
ftalato consente alle molecole del polimero di scorrere le une
sulle altre rendendo il materiale morbido e modellabile anche a
basse temperature.
DEHP 7“makesplastic fantastic”(?)
utilizzato nella produzione di materiali di imballaggio
(pellicole trasparenti incluse) e da costruzione (vernici
incluse);
nei dispositivi medici (sacche per trasfusioni e dialisi;
cateteri; tubi e sondini gastrici, respiratori, etc.);
nei prodotti per la cura del corpo; etc…
legato non covalentemente al PVC →rilasciato nei fluidi
biologici e negli alimenti (p.es. latte e formaggi) con cui
viene a contatto
nei giocattoli per l’infanzia (dal 1999 l’Unione Europea ne
ha bandito l’uso nei giocattoli per i bambini)

E’ in via di sostituzione con altri composti meno tossici,


quali il di-isononilftalato(DINP) e il di-isodecilftalato(DIDP)
DEHP: effetti biologici su animali adulti
• Effetti sul sistema riproduttivo (anti-androgeno?)
• Embriotossico e teratogeno (a seguito di esposizione in
gravidanza)
• Cancerogeno (fegato, rene)
• Induttore della proliferazione dei perossisomi
(meccanismo proposto per la cancerogenesi, che però
non è evidenziato nell’uomo)
Interagisce con i recettori nucleari/fattori di
trascrizione della famiglia dei PPAR
(peroxisomeproliferator-activated receptor: PPAR-α,
PPAR-γ)
I recettori nucleari/fattori di trascrizione PPAR
regolano il metabolismo dei lipidi e dei carboidrati sia nel
tessuto adiposo che nel fegato
Alchilfenoli- BISFENOLO A

I composti maggiormente impiegati a livello industriale sono il


bisfenolo A
Dove si trovano:
nelle rifiniture di plastica dei cibi in scatola
resine dentarie
resine epossidiche
Altro: sono usati in alcune soluzioni sgrassanti e nella lavorazione tessile
e della pelle e nei liquidi antighiaccio, nelle vernici, nella plastica e nei
pesticidi.
I loro derivati etossilati vengono impiegati come detergenti industriali
Il 25/11/2010 l'Europa mette al bando i biberon con bisfenolo
(http://www.babygreen.it/2010/11/lue-mette-al-bando-i-biberon-
con.html). La decisione è stata presa dai rappresentanti dei 27 paesi Ue
che, a maggioranza qualificata, dopo un lungo negoziato. La produzione di
biberon con bisfenolo A è vietata dal primo marzo 2011, mentre la loro
commercializzazione dal 1 giugno 2011
• Si ritiene però che la principale fonte
di BPA associata alla dieta siano i
contenitori per alimenti.
• Il bisfenolo A è uno degli estrogeni
ambientali maggiormente studiati
• Possiede una struttura analoga a quella
del dietilstilbestrolo (DES), un potente
estrogeno di sintesi la cui esposizione
in fase prenatale può essere causa di
anomalie genitali e tumori all’utero
Studi condotti sull’animale
• Il modello animale ha confermato che il BPA,
per svolgere un’azione estrogenica,
interagisce non solo con i classici recettori
nucleari (ERα e ERβ), ma anche con e AhR
• Inoltre, dalla letteratura sono emerse
evidenze in merito a un’attività antagonista
del BPA sul recettore degli androgeni
• Da un punto di vista molecolare, il BPA, oltre
ad attivare l’espressione genica della
prolattina, regola anche quella del gene c-fos,
responsabile della up-regulation di sequenze
coinvolte nei processi proliferativi e
differenziativi a livello uterino e vaginale
Recenti studi hanno evidenziato che l’esposizione
a dosi elevate di BPA (in particolare durante la
gravidanza e l’allattamento) comporta effetti
sullo sviluppo animale, tra cui:

1. una riduzione della sopravvivenza


2. una diminuzione della crescita (≥300
mg/kg/giorno)
3. un ritardo dell’inizio dell’età puberale (≥50
mg/kg/giorno).
Studi condotti sull’uomo
• Aumento del testosterone in entrambi i sessi
• È stato dimostrato che livelli elevati
di BPA in urina o in campioni ematici sono correlati
con diminuzione dell’ormone follicolo stimolante
(FSH) in soggetti professionalmente esposti
• Sindrome dell’ovaio policistico
• Aborti ricorrenti e anomalie cromosomiche in
età fetale
Tuttavia, è necessario tener presente che i dati
sopra elencati, essendo stati ottenuti da una
casistica limitata, non permettono di trarre
conclusioni certe riguardo gli effetti del BPA sulla
riproduzione e sullo sviluppo.
Parabeni
I parabeni, dalla contrazione di "estere para-
idrossibenzoico" sono una classe di composti
organici aromatici, esteri dell'acido 4-
idrossibenzoico, utilizzati da oltre 50 anni
come conservanti nell'industria cosmetica,
farmaceutica, e alimentare per le loro
proprietà battericide e fungicide.
I parabeni più comuni sono metilparabene
(methylparaben, E218), etilparabene
(ethylparaben, E214), propilparabene
(propylparaben, E216) e butilparabene
(butylparaben)