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ELETTROFORESI SU GEL

Permette la separazione di frammenti di DNA/RNA


da una miscela complessa

E una tecnica fondamentale per:


lanalisi (elettroforesi analitica)
la purificazione degli acidi nucleici (elettroforesi preparativa)

catodo

anodo

RNA e DNA sono


carichi negativamente

Effetto setaccio in un gel uniforme

ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO

Lagarosio
un polisaccaride
costituito da residui alternati di Dgalattosio e 3,6-anidro-L-galattosio.

ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO

Consente la separazioni di molecole di


grandi dimensioni: 0.1 - 20 kb

Concentrazione
di agarosio

0.8% : 0.5 20 kb
2% : 0.1

3 kb

Risoluzione

Come si prepara un gel dagarosio

Si scioglie l
lagarosio in
polvere in una soluzione
tampone a 100
100C

Alla soluzione d
dagarosio
si aggiunge Etidio Bromuro
(EtBr)
EtBr)

ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO

generatore di corrente

100V

tampone
elettroforetico

0,2A

Polo Polo +

scatola elettroforetica
gel di agarosio 1.2%

ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO

100V

0,2A

Polo Polo +

Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene
Contiene glicerolo, Blu di
bromofenolo e Blu di xilencianolo che migrano nel gel a velocit
velocit diversa.

ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO

ON

100V

0,2A

Polo Polo +

Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene
Contiene glicerolo, Blu di
bromofenolo e Blu di xilencianolo che migrano nel gel a velocit
velocit diversa.

ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO

ON

100V

0,2A

Polo Polo +

Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene
Contiene glicerolo, Blu di
bromofenolo e Blu di xilencianolo che migrano nel gel a velocit
velocit diversa.

Etidio Bromuro (EtBr):


colorante fluorescente
assorbe la luce UV a 300 nm
dando colore giallo-arancio
E utile sia per visualizzare,
sia per quantificare il
campione: lintensit della
fluorescenza , infatti,
proporzionale alla quantit
del campione.

Per frammenti lineari di DNA


e/o RNA la distanza di
migrazione inversamente
proporzionale alle dimensioni
della molecola (ovvero alla
sua lunghezza in basi)

Conoscendo la distanza di
migrazione di frammenti di
dimensione nota (M) posso
interpolare la lunghezza
delle molecole A e B

A = 2.5 kb
B = 6 kb

Dai Geni ai Genomi


-EdiSES-

Non tutte le molecole di DNA sono lineari (es.: plasmidi batterici)


pBR322

plasmide circolare
rilassato

nick

migra pi lentamente
rispetto ad un DNA
lineare o superavvolto
della stessa massa

plasmide
superavvolto

Sebbene le due forme abbiano le stesse dimensioni, esse migreranno


in maniera differente
pBR322

pBR322
dopo digestione

plasmide
linearizzato

ELETTROFORESI IN CONDIZIONI
DENATURANTI
NB
Gli acidi nucleici a singolo filamento (come lRNA)
tendono a formare complesse strutture secondarie,
pertanto la loro corsa elettroforetica fortemente
influenzata dal modo in cui si ripiegano.

NB
LRNA prima di essere separato per elettroforesi deve
essere prima denaturato, al fine di mantenere le molecole
in forma lineare

Agenti denaturanti comunemente usati:


calore, formaldeide, formammide, urea

Separazione in gel dagarosio di molecole di RNA


in condizioni denaturanti

28S (3400 nt)


18S (1800 nt)

Per ottenere una buona separazione dei pesi molecolari durante la corsa nel gel,
lRNA deve essere denaturato, ossia le molecole devono essere liberate sia da
appaiamenti con altre molecole sia da strutture secondarie intramolecolari.
La denaturazione si ottiene scottando (90-95C) il campione e aggiungendo
formaldeide al gel. Anche il loading dye contribuisce alla denaturazione poich
contiene formaldeide e formammide.

ELETTROFORESI IN GEL DI
POLIACRILAMMIDE (PAGE)


 Separazione
Separazionedi
di frammenti
frammenti minori
minori di
di 11kb
kb

 Permette
Permette di
di separare
separare frammenti
frammenti che
che differiscono
differiscono di
di
una
una sola
sola base
base (determinazione
(determinazione della
della sequenza
sequenza del
del
DNA)
DNA)

Formazione di un gel di poliacrilammide

ELETTROFORESI IN GEL DI
POLIACRILAMMIDE (PAGE)

Spessore del gel


0,4-1,5 mm
Il gel composto da
acrilamide e bis acrilamide in
un rapporto caratteristico 29:1
che determina lo spessore dei
pori. Esso inoltre contiene urea
che funziona da denaturante.

acrilamide/bis acrilamide 29:1 (6-15%)+ 7M Urea


Risoluzione: 20 - 1000 nt

1000V

Polo -

Polo +

22 mA

ON

1000V

Separazione di RNA totale


dopo PAGE 6%
Polo -

5.8SL(circa 150 nt)


5.8SS

5S (circa 120 nt)

Polo +
pre-tRNAs/
tRNAs (circa 80 nt)

22 mA

1000V

RNA
circolare

22 mA

RIASSUMENDO
Acido nucleico
dsDNA
ssDNA oligo
RNA > 1kb (mRNA, rRNA ecc.)
piccoli RNAs (siRNA, miRNAs ecc.)

Agarosio

PAGE

Condizioni
denaturanti

Pulsed field gel


electrophoresis (PFGE)
L'elettroforesi su gel di agarosio utilizzata per
separare DNA di 60 kb o di dimensioni inferiori.
L'introduzione della PFGE e le successive
varianti introdotte sulla tecnica di base
permettono oggi la separazione di frammenti di
DNA della lunghezza di 2 kb.
Ci consente la separazione in elettroforesi di
cromosomi interi.

Il metodo consiste in una elettroforesi su


gel di agarosio nella quale due campi
elettrci con differenti angolazioni
vengono applicati alternativamente per
periodi di tempo definiti (ad esempo 60s).
L'azione del primo campo elettrico causa
uno stiramento lungo il piano orizzontale
delle molecole avvolte e il loro movimento
all'interno del gel.
L'interruzione di questo campo e
l'applicazione del secondo campo
elettrico fa s che le molecole si muovano
nella nuova direzione.

Per una molecola lineare a catena lunga esiste


una relazione tra il cambiamento
conformazionale indotto da un campo elettrico
e la lunghezza della molecola stessa
le molecole pi piccole si riallineeranno pi
velocemente nel nuovo campo elettrico e,
quindi, continueranno a muoversi attraverso il
gel.
Molecole pi grosse, viceversa, impiegheranno
pi tempo per allinearsi.
In questo modo, variando continuamente la
direzione del campo, si separano le molecole pi
piccole da quelle pi grandi.

Blotting di Acidi Nucleici:


Southern e Northern Blot
Permettono di studiare:
Struttura ed organizzazione del genoma
Regolazione dellespressione genica
1. Elettroforesi su gel
2. Trasferimento (blotting) su membrana
3. Ibridazione con una sonda marcata
radioattivamente

Trasferimento di acidi nucleici


(Blotting)

Southern
Northern

Schema trasferimento

Schema ibridazione

Metodi di trasferimento

Capillare
Elettroblot

Assemblaggio del blot capillare

vaschetta
tampone
carta 3MM
carta 3MM

membrana nylon
gel
supporto

Assemblaggio dellelettroblot
carta 3MM
spugnette

tampone

membrana nylon
gel

Analisi di espressione con Northern blot