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catodo
anodo
Lagarosio
un polisaccaride
costituito da residui alternati di Dgalattosio e 3,6-anidro-L-galattosio.
Concentrazione
di agarosio
0.8% : 0.5 20 kb
2% : 0.1
3 kb
Risoluzione
Si scioglie l
lagarosio in
polvere in una soluzione
tampone a 100
100C
Alla soluzione d
dagarosio
si aggiunge Etidio Bromuro
(EtBr)
EtBr)
generatore di corrente
100V
tampone
elettroforetico
0,2A
Polo Polo +
scatola elettroforetica
gel di agarosio 1.2%
100V
0,2A
Polo Polo +
Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene
Contiene glicerolo, Blu di
bromofenolo e Blu di xilencianolo che migrano nel gel a velocit
velocit diversa.
ON
100V
0,2A
Polo Polo +
Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene
Contiene glicerolo, Blu di
bromofenolo e Blu di xilencianolo che migrano nel gel a velocit
velocit diversa.
ON
100V
0,2A
Polo Polo +
Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene
Contiene glicerolo, Blu di
bromofenolo e Blu di xilencianolo che migrano nel gel a velocit
velocit diversa.
Conoscendo la distanza di
migrazione di frammenti di
dimensione nota (M) posso
interpolare la lunghezza
delle molecole A e B
A = 2.5 kb
B = 6 kb
plasmide circolare
rilassato
nick
migra pi lentamente
rispetto ad un DNA
lineare o superavvolto
della stessa massa
plasmide
superavvolto
pBR322
dopo digestione
plasmide
linearizzato
ELETTROFORESI IN CONDIZIONI
DENATURANTI
NB
Gli acidi nucleici a singolo filamento (come lRNA)
tendono a formare complesse strutture secondarie,
pertanto la loro corsa elettroforetica fortemente
influenzata dal modo in cui si ripiegano.
NB
LRNA prima di essere separato per elettroforesi deve
essere prima denaturato, al fine di mantenere le molecole
in forma lineare
Per ottenere una buona separazione dei pesi molecolari durante la corsa nel gel,
lRNA deve essere denaturato, ossia le molecole devono essere liberate sia da
appaiamenti con altre molecole sia da strutture secondarie intramolecolari.
La denaturazione si ottiene scottando (90-95C) il campione e aggiungendo
formaldeide al gel. Anche il loading dye contribuisce alla denaturazione poich
contiene formaldeide e formammide.
ELETTROFORESI IN GEL DI
POLIACRILAMMIDE (PAGE)
Separazione
Separazionedi
di frammenti
frammenti minori
minori di
di 11kb
kb
Permette
Permette di
di separare
separare frammenti
frammenti che
che differiscono
differiscono di
di
una
una sola
sola base
base (determinazione
(determinazione della
della sequenza
sequenza del
del
DNA)
DNA)
ELETTROFORESI IN GEL DI
POLIACRILAMMIDE (PAGE)
1000V
Polo -
Polo +
22 mA
ON
1000V
Polo +
pre-tRNAs/
tRNAs (circa 80 nt)
22 mA
1000V
RNA
circolare
22 mA
RIASSUMENDO
Acido nucleico
dsDNA
ssDNA oligo
RNA > 1kb (mRNA, rRNA ecc.)
piccoli RNAs (siRNA, miRNAs ecc.)
Agarosio
PAGE
Condizioni
denaturanti
Southern
Northern
Schema trasferimento
Schema ibridazione
Metodi di trasferimento
Capillare
Elettroblot
vaschetta
tampone
carta 3MM
carta 3MM
membrana nylon
gel
supporto
Assemblaggio dellelettroblot
carta 3MM
spugnette
tampone
membrana nylon
gel