Emostasi

E la capacit di impedire luscita del sangue dai vasi dopo un danno vasale Si possono distinguere due fasi:
Una precoce, l'emostasi primaria, che porta alla formazione del cosiddetto "trombo bianco", costituito principalmente da piastrine e scarsa presenza di fibrina una pi tardiva, emostasi secondaria, che presuppone la coagulazione del sangue, con formazione del "trombo rosso" principalmente composto da un reticolo di fibrina con piastrine e globuli rossi imbrigliati al suo interno.

EMOSTASI PRIMARIA
dovuta allazione integrata del fattore von Willebrand (VWF) e delle piastrine. Il VWF sintetizzato dalle cellule endoteliali e dai megacariociti, dove depositato sotto forma di multimeri ad altissimo p.m. rispettivamente nei corpi di Weibel-Palade e negli alfa-granuli the ultralarge

(RICORDA: ultralarge VWF forms that are initially released after synthesis are sticky and capable of binding to platelets in the circulation spontaneously; this may lead to unwanted thrombus formation as seen in thrombotic thrombocytopenic purpura).

EMOSTASI PRIMARIA
Il fattore von Willebrand: promuove l'adesione piastrinica legandosi al recettore piastrinico glicoproteina Ib (GPIb) e a strutture subendoteliali come il collagene e stabilisce un ponte fra le piastrine e il subendotelio nei vasi danneggiati promuove l'interazione piastrina-piastrina (aggregazione). Inoltre, il VWF ha indirettamente un ruolo anche nella coagulazione, in quanto legando il FVIII lo protegge dalla degradazione da parte della APC e lo localizza dove pu essere pi facilmente attivato, per promuovere la coagulazione (per es., in prossimit delle membrane piastriniche).

EMOSTASI SECONDARIA
II tappo emostatico (trombo bianco), che arresta temporaneamente il sanguinamento di piccole lesioni, si dissolverebbe in breve tempo se non si verificasse un consolidamento dello stesso mediante la formazione di un reticolo di fibrina.
La coagulazione del sangue il complesso di reazioni enzimatiche finalizzate alla trasformazione del fibrinogeno plasmatico in fibrina.

La coagulazione del sangue, porta alla formazione del "trombo rosso" principalmente composto da un reticolo di fibrina con piastrine e globuli rossi . imbrigliati al suo interno

II numero totale di piastrine circolanti, normalmente di 250.000-450.000/mcL, il risultato del rapporto tra piastrine prodotte a livello midollare e piastrine distrutte in sede periferica. stato calcolato che la piastrinopoiesi midollare normale produce circa 100 miliardi di piastrine al giorno

La vita media piastrinica nel normale di circa 8-10 giorni. La durata di vita media piastrinica pu essere determinata mediante infusione di piastrine autologhe od omologhe, previa marcatura con 111-Indio

La piastrinocateresi avviene a livello del SRE, soprattutto splenico, ma anche epatico, e in piccola parte forse nel midollo osseo e nei linfonodi. Normalmente il rapporto tra cateresi splenica ed epatica di 3:1, ma considerando le dimensioni dei due organi si deduce che l'attivit splenica circa 20 volte superiore a quella epatica

Funzioni delle piastrine

Adesione
Aggregazione = trombo piastrinico emostatico. Attivit procoagulante

Stabilizzazione e retrazione del coagulo

Adesione piastrinica
dove c una lesione dellendotelio le piastrine aderiscono alle strutture sottoendoteliali (collagene, microfibrille e fibre elastiche dei grossi vasi) mediante le glicoproteine di membrana Ia e Ib con l'intervento del VWF e di altre proteine adesive di origine endoteliale (fbronectina, vibronectina, trombospondina, laminina) e si appiattiscono allargandosi (spreading) in modo da riparare la breccia endoteliale (trombo emostatico piastrinico) L'adesivit piastrinica risulta diminuita nella rara carenza congenita di GPIa, nella sindrome di Bemard-Soulier per carenza di glicoproteina piastrinica Ib e nella malattia di von Willebrand per deficienza di VWF.

1. Initiation
Platelet

Il Tissue Factor (TF) rimane in prossimit della superficie cellulare da cui sintetizzato Il complesso TF/FVIIa si avvicina alla superficie piastrinica
Platelet
Va

Platelet

Platelet

Endothelial cell
TF

Endothelial cell
TF
TF

TF/ FVIIa
X

Xa

IIa

II

Aggregazione piastrinica

Le piastrine perdono la normale forma discoide per assumere una forma sferica, con superficie spinosa e protrusione di pseudopodi e aderiscono fra di loro. Il processo di aggregazione stimolato da induttori naturali quali l'ADP, la trombina, generatasi in sede di lesione vascolare dall'innesco del processo coagulativo indotto dai fattori tromboplastici tissutali, e dalle fibre collagene messe a nudo dalla lesione.

2. Amplification
Platelet

Le piastrine aderiscono alla superficie dellendotelio danneggiato (sub-endotelio) Piccole quantit di trombina generate dal TF/FVIIa/Xa amplificano la fase procoagulante

Platelet

Platelet

Activated Platelet

Platelet

Endothelial cell
Va TF TF

Endothelial cell
TF
TF

VIIa
X

Xa

Thrombin

Attivit procoagulante

I fosfolipidi a carica negativa delle membrane piastriniche (in passato indicati come fattore tromboplastnico piastrinico o PF3), e principalmente la fosfatidilcolina, vanno a costituire, assieme al FV, al FX e agli ioni calcio, la protrombinasi che trasforma il FII (protrombina) in FIIa (trombina).

3. Propagation

Complessi tenasi intrinseca e protrombinasi sono assemblati sulla superficie piastrinica Si forma una grande quantit di generazione di trombina
IIa IIa IIa IIa

Esposizione PL a carica negativa

XIa

X IXa
VIIIa

II
Xa
Va

IIa

Endothelial cell
TF TF

Activated Platelet

IIa

Endothelial cell
IIa IIa
TF
TF

IIa IIa IIa

IIa IIa IIa IIa IIa

Retrazione del coagulo

il trombo che si formato tende a ridursi di volume per effetto di un processo che dipende dall'apparato contrattile delle piastrine e che coinvolge i filamenti di actina e la miosina. La polimerizzazione dell'actina configura in questa fase una particolare struttura "a punte di freccia" ove i filamenti di actina sono costellati dall'inserimento delle molecole di miosina. Poich i filamenti di actina sono ancorati, nelle sedi di lesione, alle glicoproteine di membrana IIb/IIIa, che a loro volta, sono collegate con i filamenti di fibrina all'estemo delle cellule, si realizza un meccanismo di trasmissione della forza contrattile ai tralci di fibrina, cui consegue la retrazione del coagulo.

Stabilizzazione del coagulo

Le piastrine, contenendo nei loro alfa-granuli la frazione a del FXIII e possedendo recettori specifici per il FXIII plasmatico, partecipano alla stabilizzazione del coagulo: l'attivit transamidasica del FXIII attivato in presenza di ioni calcio induce la formazione di legami covalenti tra i monomeri di fibrina con formazione di fibrina insolubile, aumentando la consistenza e la resistenza alla fibrinolisi del coagulo neoformato.

La coagulazione avviene per mezzo di proteine (fattori plasmatici della coagulazione) presenti nel plasma come proenzimi inattivi, in modo concatenato, cos che la forma attivata di ciascuno di essi catalizza l'attivazione del fattore successivo: si realizza cos la cascata coagulativa che porta alla formazione del coagulo fibrinico.

25% (by weight) of nonalbumin proteins in human plasma are coagulation/ fibrinolytic proteins.

 Alcuni dei fattori plasmatici della coagulazione hanno emivita breve, per questo solo il plasma fresco o congelato fresco ne contiene in quantit sufficiente in forma attiva Quasi tutti i fattori plasmatici della coagulazione sono sintetizzati nel fegato Lunico che non sintetizzato nel fegato il fattore tissutale (fattore III) Per la sintesi di alcuni di questi necessaria la vitamina k (II, VII, IX, X)

Il fattore IV il Ca++
Il fattore VI la forma attivata del fattore V

Schematicamente, il processo procede attraverso due vie (intrinseca ed estrinseca) che covergono in una via comune Nella via intrinseca, il FXII attivato durante la fase di contatto e a seguire vengono attivati i fattori XI, IX, X

Nella via estrinseca, il complesso FVII-fattore tissutale (FIII) seguito dalla attivazione dei fattori VII, X

Fattore tissutale (FIII)

E lunica proteina della cascata coagulativa per la quale non sono mai state descritte carenze congenite un normale componente delle superfici delle cellule non vasali. presente praticamente in tutti i tessuti ma il polmone, la placenta e il cervello ne sono particolarmente ricchi. a differenza di altri cofattori della coagulazione, che circolano come precursori inattivi, completamente attivo quando espresso dalle superfici cellulari Ma, normalmente, non viene a contatto col sangue

Fattore tissutale (FIII)

viene per a contatto col sangue quando la superficie endoteliale si interrompe

Il suo ruolo quello di iniziatore fisiologico della cascata coagulativa

funziona come un recettore ad alta affinit per il fattore VII, risultando in un complesso con attivit procoagulante che in presenza di Ca2+ attiva il fattore X e il fattore IX

Il complesso FVIIa-fattore tissutale ha la capacit di attivare non solo il FX (via comune), ma anche il FIX (via intrinseca).

Risulta chiaro che il complesso FVIIa-fattore tissutale svolga un ruolo chiave nei processi di coagulazione in vivo.

Il FVIII presente in circolo legato non covalentemente al fattore von Willebrand che lo protegge dalla degradazione da parte della APC (proteina C attivata) e lo localizza dove pu essere pi facilmente attivato, per promuovere la coagulazione (per es., in prossimit delle membrane piastriniche).

La sua attivazione, da parte della trombina

Il FVIIIa svolge una attivit cofattoriale non enzimatica sul FIXa che in presenza di fosfolipidi e ioni Ca++

RIASSUMENDO:
La via estrinseca ha un ruolo fisiologico pi importante di quello sostenuto dalla via intrinseca nell'innesco della coagulazione. La coagulazione avviata dal fattore tissutale, che non espresso dalle cellule endoteliali in vivo, ma espresso da elementi subendoteliali della parete vasale (cellule muscolari e fibroblasti). Il sangue circolante non viene a contatto col fattore tissutale se non ci sono lesioni endoteliali

Carenze dei fattori della fase di contatto (FXII, precallicreina o HMWK) producono in vitro un marcato allungamento del tempo di tromboplastina parziale attivo ma non sono associate a fenomeni emorragici. Difetti del FXI portano alla cosidetta sindrome di Rosenthal, con manifestazioni emorragiche in genere modeste

Sia la via intrinseca sia la via estrinseca portano all'attivazione del FX

Dal FXa parte la via comune che vede la formazione di un complesso detto protrombinasi, costituito da FXa, FVa, fosfolipidi e ioni calcio, che converte la protrombina in trombina.

Alla trombinogenesi segue la trasformazione del fibrinogeno in fibrina, la formazione del coagulo fibrinico e la sua stabilizzazione a opera del FXIIIa.
protrombinase

La risposta del processo coagulativo in genere limitata al sito del danno vasale ed direttamente proporzionale al grado e all'estensione del danno. La localizzazione dei processi coagulativi ottenibile grazie alla capacit dei fattori della coagulazione di legarsi in maniera reversibile alle cellule endoteliali danneggiate, al sottoendotelio leso, e alle piastrine

Oltre ai fattori della coagulazione, sono presenti nel plasma altre proteine come

proteine deputate alla dissoluzione del coagulo di fibrina (fibrinolisi) inibitori naturali, ad azione antagonista e modulatrice delle reazioni procoagulanti.

La fibrina che si forma in un vaso leso ha il compito di arrestare la perdita di sangue Successivamente viene rimodellata e infine completamente rimossa per ristabilire il normale flusso ematico.

Il processo di degradazione della fibrina prende il nome di fibrinolisi, e consiste nella degradazione enzimatica del coagulo nella sede di formazione.

La fibrinolisi pu essere innescata da attivatori fisiologici, quali l'attivatore tissutale del plasminogeno (t-PA)
L attivatore tissutale del plasminogeno una proteasi rilasciata dalle cellule endoteliali stimolate con trombina, o in seguito a intenso esercizio fisico, o a stasi venosa.
Ha un'emivita di alcuni minuti

L attivatore tissutale del plasminogeno

determina la trasformazione del PLASMINOGENO (una glicoproteina prodotta nel fegato, nel rene e negli eosinofili) in PLASMINA

 La plasmina degrada il fibrinogeno, la fibrina solubile, e la fibrina stabilizzata formando prodotti di degradazione caratteristici (FDP)

Il pi piccolo prodotto di degradazione della fibrina stabilizzata il frammento D-D (D-dimero) Anticorpi monoclonali diretti contro questo "neoantigene" vengono utilizzati nella routine di laboratorio per monitorare il processo fibrinolitico in vivo.

Per la limitazione e la localizzazione del processo emocoagulatorio sono indispensabili sistemi di controregolazione che fisiologicamente lo modulino e lo inibiscano.

Tale ruolo inibitore svolto da alcune proteine plasmatiche. Particolarmente importanti sono cofattori eparinici
sistema delle proteine C e S.

L'eparina viene sintetizzata principalmente a opera delle mastcellule, viene secreta come complesso di aminoglicani solforati. Quindi un complesso macromolecolare (eparina proteoglicano). Per l'espletamento della sua azione anticoagulante necessita dell'intervento dei cofattori eparinici, principalmente il cofattore I (antitrombina III) e il cofattore II

ANTITROMBINA III
sintetizzata nel fegato

(cofattore eparinico)

forma di complessi irreversibili con la molecola da inibire. Principali bersagli: trombina e FXa, altri fattori quali il FIXa, il FXIa e il FXIIa L'AT di per s agisce lentamente nel processo di inattivazione di questi fattori ma la presenza di eparina ne aumenta notevolmente la velocit (1000 volte).

La proteina C (PC) una glicoproteina a doppia catena, a sintesi epatica e vitamina K-dipendente, di p.m. di 62 kD.
L'attivazione della PC richiede la presenza di trombina e di una proteina di membrana delle cellule endoteliali, la trombomodulina.

Dapprima la trombina si lega alla trombomodulina, andando incontro a grossi cambiamenti conformazionali che le fanno perdere la capacit di attivare il fibrinogeno; la trasformano cio da un potente enzima procoagulante a un enzima che genera un potente anticoagulante, la PC attivata (APC). L'APC oltre a inattivare specificatamente il FVa e il FVIIIa, stimola la fibrinolisi agendo sugli inibitori della fibrinolisi. In particolare l'APC protegge l'attivatore tissutale del plasminogeno (t-PA) dall'inibizione da parte del suo inibitore, il PAI.

La proteina S (PS), una glicoproteina a catena singola di p.m. di 69 kD, anch'essa vitamina K-dipendente, sintetizzata dal fegato, dall'endotelio e dai megacariociti midollari funziona da cofattore dell'APC Il complesso APC-proteina S degrada specificamente i fattori Va e VIIIa legati ai fosfolipidi in presenza di ioni calcio sulle membrane cellulari endoteliali e piastriniche La deficienza di proteina C o di proteina S, per mancata inattivazione dei fattori V e VIII attivati, rappresenta un importante fattore di rischio per la trombosi venosa.

Test di primo filtro della coagulazione

Sono le prove minime e sufficienti per consentire un bilancio preoperatorio o un approccio diagnostico alla normalit: Tempo di emorragia Conteggio delle piastrine Tempo di tromboplastina parziale attivato (APTT) Tempo di protrombina (PT)

Test di primo filtro TEMPO DI EMORRAGIA

test globale di esplorazione della fase vasculopiastrinica alterato nelle PIASTRINOPENIE e nelle PIASTRINOPATIE

definito come tempo (minuti) necessario allarresto del sanguinamento provocato da punture o incisioni superficiali eseguite, in condizioni standardizzate, sullavambraccio del paziente.

Test di primo filtro TEMPO DI EMORRAGIA

nellinterpretazione tenere sempre presente linfluenza dei farmaci che interferiscono con la fase vasculopiastrinica dellemostasi (per es. aspirina e farmaci antifiammatori non steoridei)

tempo normale < o = a 8 minuti

Test di primo filtro CONTEGGIO DELLE PIASTRINE

indica se il numero delle plts sufficiente per unemostasi efficace la PIASTRINOPENIA una delle cause pi comuni di sanguinamento fornito dai contaglobuli automatici insieme allemocromo esplora lemostasi primaria (fase vasculopiastrinica) intervallo di riferimento normale per il conteggio: 150-450 plts/mm3 importante escludere una pseudopiastrinopenia da EDTA utile verificare i risultati su striscio di sangue periferico colorato con May Grunwald-Giemsa per avere informazioni su morfologia e distribuzione delle plts

Test di primo filtro TEMPO DI PROTROMBINA (PT)

tempo in (secondi) necessario affinch unaliquota di plasma povero di piastrine coaguli in seguito allaggiunta di un estratto tissutale (tromboplastina) e ioni calcio a 37C.

Esplora la via ESTRINSECA

PT prolungato: carenza dei fattori VII, X, V, II e fibrinogeno carenza di vit. K in presenza eparina in presenza di anticoagulanti orali ed epatopatie

PT Procedimento analitico
Tempo di coagulazione del plasma citratato povero di piastrine dopo aggiunta di quantit ottimali di estratto tissutale (tromboplastina) e ioni calcio.

PT Reagenti
Tromboplastina Costituita da fosfolipidi (fosfatidilcolina e fosafatidiletanolamina) estratti da cervello, placenta o polmoni (umani, di coniglio, bue o scimmia) o di derivazione ricombinante (umana). Le tromboplastine pi vicine alla specie umana sono le pi sensibili. Alla tromboplastina vengono aggiunti ioni calcio.

PT Espressione dei risultati

tempo coagulazione (secondi) attivit %(estrapolata da una curva dose risposta, allestita con opportune diluizioni scalari NP riportando su un sistema di assi i tempi e le rispettive %) PT ratio (rapporto tempo di coagulazione del plasma da testare e quello di un pool di plasmi normali)

INR (International Normalized Ratio) (PT paziente/PT normal pool) ISI

PT Espressione dei risultati

INR dovrebbe permettere di superare il problema della variabilit dei sistemi di misura e consentire la comparabilt dei risultati ottenuti in laboratori diversi Esprimere PT in ratio (o secondi e ratio) non in INR in situazioni cliniche al di fuori della TAO in quanto per determinare lISI si utilizzano plasmi di pazienti in TAO e quindi il valore dellISI che ne risulta pu non essere valido per altri difetti.

PT Espressione dei risultati in %

Questo significa che a livelli alti e a livelli bassi di attivit bastano pochi decimi di secondo di differenza nei tempi di coagulazione per leggere percentuali di attivit fra loro diverse.

Questo comportamento dannoso. Ad esempio, un valore di 100% pu benissimo diventare del 150% solo cambiando il tempo di coagulazione di una frazione di secondo. Quando ci accade il medico ed il paziente si preoccupano perch nellimmaginario collettivo avere un PT corto (percentuale alta) viene interpretato come una tendenza allipercoagulabilit per la quale non ci sono fondamenti.

Test di primo filtro

TEMPO TROMBOPLASTINA PARZIALE ATTIVATO (APTT) tempo (in secondi) necessario affinch unaliquota di plasma povero di piastrine coaguli in seguito allaggiunta di un attivatore della fase di contatto (caolino, ac. ellagico, silice micronizzata), di fosfolipidi in funzione di un sostituto piastrinico e ioni calcio a 37C. Esplora la via INTRINSECA.

Test di primo filtro TEMPO TROMBOPLASTINA PARZIALE ATTIVATO (APTT) APTT prolungato:

*carenza dei fattori precallicreina, chininogeno ad alto peso molecolare, XII, XI, IX, VIII, X, V, II e fibrinogeno *in presenza di anticoagulanti circolanti (LA, anticorpi anti fattore) *in presenza di eparina *in presenza di anticoagulanti orali
I valori sono espressi in secondi e in Ratio (per migliorare la comparabilit dei risultati fra i vari laboratori perch tutti i valori vengono corretti contro il plasma di riferimento e linfluenza delle variabili, dipendenti dal tipo di reattivo e dalle condizioni di lavoro, viene attenuata). Ratio = rapporto tra laPTT del plasma campione e quello del plasma di riferimento (NP).

aPTT Procedimento analitico

Il plasma citrato, un attivatore di contatto, e dei fosfolipidi (PL) procoagulanti vengono mescolati e incubati a 37C. Lattivatore di contatto attiva i Fattori XI e XII. I PL forniscono la superficie per linterazione dei fattori della coagulazione. Dopo lincubazione viene aggiunta una concentrazione appropriata di Ioni Calcio (gli ioni calcio promuovono lattivazione della via intrinseca della cascata coagulativa) e misurato il tempo di formazione del coagulo.

aPTT Reagenti
Tromboplastina parziale Reagente costituito da fosfolipidi (PL) che simulano quelli piastrinici e da un attivatore della fase di contatto (celite, caolino, ac. ellagico, silice micronizzata) associati in forma liofila o liquida in ununica confezione.

Fosfolipidi I fosfolipidi ottenuti per estrazione da organi umani o animali, sono costituiti in opportune concentrazioni da: fosfatidilserina fosfatidilcolina fosfatidil- etanolamina trigliceridi

aPTT Fonti di errore

Le fonti di errore pi comune sono: I reagenti contaminati o ricostituiti in maniera errata sia per quanto riguarda il volume sia per quanto riguarda il tipo di diluente. Gli errori nelle condizioni operative (mancato rispetto nei tempi di incubazione, delle variazioni nella temperatura, del pH, della dispensazione dei volumi dei reagenti.

aPTT Espressione dei risultati

I valori sono espressi in secondi e in Ratio (per migliorare la comparabilit dei risultati fra i vari laboratori e nello stesso laboratorio in giorni differenti, perch tutti i valori vengono corretti contro il plasma di riferimento e linfluenza delle variabili, dipendenti dal tipo di reattivo e dalle condizioni di lavoro, viene attenuata).

Ratio = rapporto tra laPTT del plasma campione e quello del plasma di riferimento.

Test di secondo filtro

Se test di primo filtro alterati per giungere allidentificazione del difetto: Aggregazione piastrinica Dosaggio Fattori della Coagulazione Studio M. von Willebrand Se test di primo filtro nella norma ma in presenza di una chiara storia clinica positiva per sindrome emorragica: fattore XIII alfa 2 -antiplasmina attivatore tissutale del plasminogeno (t-PA) inibitore dellattivatore tissutale del plasminogeno (PAI-1) tempo di trombina e tempo di reptilase fattore piastrinico 3 (PF3)

Cause carenza fattori coagulazione

Ridotta sintesi (anomalie quantitative) Sintesi di una molecola anormale (anomalie qualititative) Formazione di anticorpi diretti specificamente contro alcuni fattori (autoanticorpi)

Fibrinogeno
Glicoproteina che trasformandosi in fibrina per attivazione da parte della trombina permette la formazione del coagulo. Di origine epatica Proteina fase acuta Utile nelle seguenti condizioni: afibrinogenemie o disfibrinogenemie congenite o acquisite (epatoma o mieloma) cirrosi epatica, malattie infiammatorie, autoimmuni, CID, valutazione rischio trombotico

Disfibrinogenemia
Anomalia molecolare del fibrinogeno autosomica dominante (le mutazioni conducono allalterazione di singoli aminoacidi in una delle tre catene del fibrinogeno). Caratterizzata da una discrepanza fra i livelli funzionali di fibrinogeno (ridotti) e i livelli antigenici (normali o aumentati).

Metodi dosaggio fibrinogeno

Metodo immunologico: immunodffusione radiale in piastre agar. Da usare SOLO nello studio delle disfibrinogenemie, dove in presenza di ridotto fibrinogeno funzionale presente una normale concentrazione di fibrinogeno. Metodo derivazione PT in molti strumenti il fibrinogeno calcolato utilizzando la curva del PT. Infatti il valore ricavato misurando il delta fra linizio e la fine della formazione del coagulo

Metodo secondo Clauss consente di quantificare il fibrinogeno realmente funzionante. in largo eccesso di trombina la velocit della reazione di coagulazione dipende solo dalla concentrazione del fibrinogeno.

Dosaggio fattori coagulazione

Principio del metodo: valutazione del grado di correzione del tempo di coagulazione operato dal plasma in esame su un plasma carente del corrispondente fattore. PT per i fattori: VII, V, II, X APTT per i fattori: VIII, IX, XI, XII il grado di correzione si esprime in % curva di riferimento (scala bilog)