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Frazionamento cellulare Le cellule possono essere rotte in vario modo: shock osmotico, ultrasuoni, frantumandole per omogeneizzazione.

Questi procedimenti rompono molte membrane ma lasciano intatti gli organuli che possono essere separati sulla base delle loro dimensioni e densit.

CENTRIFUGAZIONE Una centrifuga uno strumento progettato per produrre una forza centrifuga superiore alla forza di gravit terrestre. Le particelle in soluzione se lasciate in condizioni di quiete tenderanno a sedimentare per effetto della gravit. Per ogni particella la velocit alla quale essa sedimenta proporzionale alla forza applicata, conseguentemente macromolecole in soluzione sedimentano pi velocemente quando la forza applicata maggiore di quella di gravit esercitata dalla terra. Scopo delle tecniche di separazione per centrifugazione Esercitare una forza maggiore del campo gravitazionale terrestre aumentando la velocit di sedimentazione delle macromolecole, col fine di separare macromolecole che differiscono per densit, forma e dimensioni e quindi sedimentano con velocit diversa sotto linfluenza di un campo centrifugo applicato.

TIPI DI CENTRIFUGHE (refrigerate e non refrigerate) Centrifughe a bassa veloci (max3.000-6.000 g) si usano per raccogliere organelli di grandi dimensioni e precipitati grossolani. Microcentrifughe (10.000 g) sono capaci di accelerazioni rapide. Centrifughe a flusso continuo utili per raccogliere grandi volumi di cellule. Durante la centrifugazione le particelle sedimetano mentre il liquido scorre attraverso il rotore. Centrifughe ad alta velocit (max 60.000g) utili per frazionamento cellulare. Ultracentrifughe (MAX 600.000 g) possiedono sistemi di vuoto e refrigerazione sofisticati e vengono usate per isolare piccoli organelli come i ribosomi e le vescicole di membrana.

Tecniche centrifugative
Le tecniche di separazione per centrifugazione si basano sul comportamento delle particelle quando esse vengono sottoposte ad un campo centrifugo. Tecniche di centrifugazione preparativa: permettono di separare, isolare e purificare cellule intere, organuli subcellulari, membrane plasmatiche, polisomi, ribosomi, cromatina, acidi nucleici, complessi proteici e virus. Tecniche di centrifugazione analitica: servono a studiare macromolecole gi pure o praticamente pure.

Tipi di rotore

Rotore ad angolo fisso

Rotore basculante

Principi base della sedimentazione La velocit di sedimentazione dipende dal campo centrifugo G, diretto radicalmente verso lesterno. Il campo funzione del quadrato della velocit angolare del rotore (w espressa in rad s-1) e della distanza radiale (r ) espressa in centimetri della particella dallasse di rotazione. Campo centrifugo G= w2 r

La velocit del rotore pu essere espressa in termini di rivoluzioni al minuto (rev min 1).

Il campo centrifugo G espresso in termini di rivoluzioni al minuto espresso come multiplo della forza gravitazionale terrestre (g= 980 cm/s), cio come rapporto tra il peso della particella sottoposta al campo centrifugo e il peso della stessa sottoposta alla sola forza di gravit. Esso viene quindi riportato come campo centrifugo relativo o pi semplicemente come numero di g.

Quando si riportano le condizioni di separazione di particelle necessario specificare la velocit del rotore, le dimensioni del raggio e il tempo di centrifugazione. La velocit di sedimentazione dipende comunque anche 1) dalla massa della particella; 2) dalla densit del mezzo; 3) dalla forma della particella. Questi parametri pratici ovviamente modificano lequazione teorica. Coefficiente di sedimentazione La velocit di sedimentazione (v) di una particella pu essere anche espressa in termini di velocit di sedimentazione per unit di campo centrifugo applicato, pi comunemente chiamato coefficiente di sedimentazione, s.

Il valore sperimentale per il coefficiente di sedimentazione una funzione della


temperatura, viscosit e densit della soluzione.

Per convenzione il coefficiente di sedimentazione determinato viene corretto in quel valore che si otterrebbe in acqua a 20C e viene riportato come coefficiente di sedimentazione standard, s20,w.

Il coefficiente di sedimentazione di molte macromolecole, inclusi acidi nucleici e proteine, di norma diminuisce allaumentare della concentrazione del soluto. Per questo motivo si misura il coefficiente a diverse concentrazioni di soluto e si estrapola il valore a concentrazione nulla. Per la maggior parte delle particelle biologiche i coefficienti di sedimentazione sono valori molto piccoli e, per convenzione, il loro valore unitario di base espresso in secondi :
1 Svedberg (S) = 10-13 sec Ad esempio, una molecola di RNA ribosomale che ha un coefficiente di sedimentazione pari a 5x10-13 s ha un valore di 5 S In genere, pi grande la molecola o la particella e maggiore la sua unit Svedberg. Pertanto maggiore la sua velocit di sedimentazione.

Esempi: enzimi, ormoni Acidi nucleici Ribosomi e polisomi Virus

tra 2 a 25 S tra 3 a 100 S tra 20 a 200 S tra 40 a 1000 S

Centrifughe e loro utilizzo


Piccole centrifughe da banco. Generalmente la loro velocit massima tra 4.000 e 6.000 rev min 1 , per un campo centrifugo relativo variabile tra i 3.000 e i 7.000 g. Microcentrifughe. 8.000-13.000 rev min 1 pari a 10.000g

Centrifughe refrigerate a grande capacit 6.000 rev min 1 Centrifughe refrigerate ad alta velocit 25.000 rev min 1

Ultracentrifughe preparative Possiedono rotori in grado di raggiungere 80.000 rev min 1 e di generare un campo centrifugo relativo di 600.000 g. La camera del rotore refrigerata, sigillata e viene mantenuto il vuoto allinterno onde minimizzare gli attriti che si possono generare tra il rotore in movimento e laria e che causerebbero un aumento di temperatura. Il sistema di controllo della temperatura utilizza un sensore a infrarossi che registra di continuo la temperatura. Ultracentrifughe analitiche La velocit raggiunge i 70.000 rev min 1 (500.000 g). Sono costituite da un rotore alloggiato in una camera in cui sia stato fatto il vuoto e di un sistema ottico di rivelazione del materiale che va sedimentandosi durante la centrifugazione. Importante! Sempre equilibrare le provette!!!

Frazionamento cellulare e purificazione delle varie frazioni


Distruzione delle cellule e solubilizzazione delle proteine in un opportuno tampone. SCELTA DEL METODO DI ROTTURA DELLE CELLULE:
Metodi non meccanici:

a) Shock osmotico. b) Congelamento e scongelamento. c) Utilizzo di detergenti per dissolvere la membrana cellulare.
Metodi meccanici:

a) Omogenizzazione b) Sonicazione . Onde sonore ad alta frequenza.

Vari modelli di omogeneizzatore.

Metodi di separazione Sedimentazione differenziale: la centrifugazione di una sospensione di particelle per un tempo determinato provoca la formazione di un sedimento e di un sovranatante

Centrifugazione in gradiente di densit Si utilizza una soluzione la cui densit aumenta in gradiente Continuo(a) Discontinuo (b) Una barriera di densit a gradino singolo per sedimentare selettivamente una particella (c)

Gradienti

Centrifugazione Zonale Si crea un gradiente poco ripido e le macromolecole si separeranno in funzione della massa ( quelle pi grandi si muoveranno pi velocemente). Si stratifica il campione su un gradiente di densit, si centrifuga fino ad identificare delle bande di sedimentazione. La centrifugazione deve terminare prima che le bande si stratificano sul fondo.

Centrifugazione Isopicnica (di uguale densit)

Si basa sulla formazione di un gradiente ripido (molte sostanze come il saccarosio o il ficoll creano dei gradienti durante la centrifugazione).
Si mescola il campione da separare con la sostanza appropriata e si centrifuga per il tempo necessario per la formazione dei gradienti. Le particelle sedimentano in funzione della loro densit (si posizionano dove la loro densit uguale a quella del mezzo)

Classificazione CENTRIFUGHE per velocit

VELOCITA' Velocit (rpm) Gravit (xg) Capacit Raffreddamento Vuoto

BASSA 7.000 7.200 9 litri no no

MEDIA 14.000 18.000 1 litro alcune no

ALTA 26.000 75.000 1 litro tutte alcune

ULTRA 100/150.000* 800/901.000* 1.500/40 ml tutte tutte

Equipaggiamento

angolo fisso oscillante micropiastre cyto

angolo fisso oscillante micropiastre tamburo

angolo fisso oscillante verticale zonale flusso continuo tamburo

angolo fisso oscillante verticale neo-verticale zonale flusso continuo

Materiale (equipaggiamento)

mat. plastico alluminio

mat. plastico alluminio

alluminio composito

alluminio composito titanio pavimento/banco

Posizionamento

banco/pavimento

banco/pavimento

banco/pavimento

Tipo di separazione

tipo equipagg. angolo fisso oscillante

Pelleting eccellente inefficiente

Isopicnica variabile* buono

Rate-zonal no buono

verticale
zonale

no
no

eccellente
buono

buono
eccellente

* buono: macromolecole inefficiente: cellule, nuclei, mitocondri

Selezione delle bottiglie e/o provette La scelta del tipo di provetta o bottiglia pi adatta alla centrifugazione dovr tener conto dei seguenti fattori: adattabilit agli alloggiamenti dell'equipaggiamento rotante resistenza meccanica (rottura delle provette) resistenza chimica resistenza alla temperatura trasparenza autoclavabilit facilit di pulizia sterilizzazione economicit La resistenza meccanica delle provette in plastica influenzata da diversi fattori: limiti fisici dei materiali costruttivi, interazione di tali limiti con agenti chimici, presenza o meno di tappi di chiusura, lavaggi, processi di sterilizzazione, tempo e durata della centrifugazione. I prodotti chimici influenzano le caratteristiche meccaniche, la flessibilit e le propriet fisiche delle provette.

I materiali per provette pi utilizzati sono:


Polipropilene copolimero (PA) Copolimero lineare con aggiunta di etilene e propilene; disponibile con parete sottile e spessa, normalmente elencato come PA (Poliallomero). Ha buone propriet chimiche e di media trasparenza; adatto per pelletting e separazione in gradiente di densit. Eccellente per essere tagliato (sliceable) o perforato (pierceable) e ideale per centrifugazioni a bassa temperatura. Sia a temperatura ambiente che a bassa temperatura di centrifugazione, ha buona resistenza meccanica a basse e medie velocit. Policarbonato (PC) Trasparente e rigido, buona resistenza agli acidi con ottima compatibilit verso le soluzioni di acido diluito. Disponibile con parete spessa e sottile, in tubi o bottiglie. Autoclavabile e riutilizzabile. Sia a temperatura ambiente che a basse temperature di centrifugazione, mantiene la propria rigidit e resistenza meccanica anche ad alte velocit. Polipropilene (PP) Traslucido. Buone propriet chimiche. Richiesto quando necessario ottenere una netta interfaccia tra separazioni di particelle con diverso coefficiente di densit (layer). A temperatura ambiente mantiene la propria forma originale e la propria resistenza meccanica anche ad alte velocit. A basse temperature di centrifugazione non consigliabile, dato che aumenta la propria fragilit.

Polietilene (CPE) Polimero opaco, ideale per acido acetico o idrofluorico. Adatto per taglio e foratura, nelle centrifugazioni in gradiente. Utilizzato quando necessitano basse temperature di centrifugazione. Polistirene (PS) Rigido e non tossico; trasparente e compatibile con la maggior parte delle soluzioni acquose. Normalmente utilizzato per pelletting. Polisulfone (Phenylene-Isopropylidene) (PSF) Di colore giallo trasparente. Resistente agli acidi, basi, alcool e idrocarburi. Ottima resistenza alla temperatura. Teflon (FEP) Traslucido, flessibile e ad alta densit. Resiste a temperature di esercizio molto basse. Eccellente con Acetone e altri solventi. Autoclavabile e sterilizzabile. Riduce le proprie qualit quando utilizzato ad alta forza di gravit con temperature >20 C. Vetro (VJ) Duran 50 Vetro (VS) Vetro soffiato Corex (C) Per centrifugazioni a basse e medie velocit. Cinque volte pi resistente del vetro convenzionale. Buono per alte temperature. La vita media delle provette in vetro in funzione della frequenza d'uso, della accelerazione centrifuga relativa, dei lavaggi, abrasioni, cura del trattamento. Gli sforzi sviluppati in questi processi si accumulano nei vetri VJ e VS, i quali peraltro hanno un'eccellente resistenza chimica e possono sopportare velocit moderate se usati con gli opportuni riduttori/adattatori. Con gli appositi riduttori/adattatori le provette in Corex possono essere usate a velocit medio-alte.