Sei sulla pagina 1di 7

Il laboratorio clinico nella diagnostica e nel controllo delle anemie

Le anemie emolitiche (Rassegna)


Manuela Miolo Laboratorio di Patologia Clinica, Ospedale S. Antonio, Padova

INTRODUZIONE
L'emolisi rappresenta la distruzione o la rimozione dei globuli rossi dal torrente circolatorio prima che si completi il loro ciclo vitale; si pu presentare in maniera del tutto asintomatica ma, pi spesso, quando il midollo non riesce a compensare la distruzione eritrocitaria, si manifesta un quadro di anemia. L'emolisi si pu verificare con meccanismo intravascolare, quando la distruzione dei globuli rossi avviene in circolo e si accompagna al concomitante rilascio nel plasma del loro contenuto; cause dirette di danno e di distruzione della membrana cellulare sono i traumi meccanici, dovuti ad un danno dell'endotelio vascolare, la fissazione ed attivazione del complemento sulla superficie cellulare e gli agenti infettivi; o extravascolare, che il pi comune, e in questo caso la rimozione e la distruzione dei globuli rossi, che presentano un'alterazione della membrana, avviene ad opera dei macrofagi della milza e del fegato. Normalmente un globulo rosso, che presenta un diametro di 8 , pu deformarsi e passare attraverso i cordoni splenici aventi un diametro di 3 ; questo per non avviene nel caso di globuli rossi con membrana alterata, che vengono cos distrutti e fagocitati dai macrofagi. L'anemia viene spesso individuata attraverso gli esami di laboratorio ed un segno caratteristico di emolisi rappresentato dall'aumento del numero dei reticolociti, che rivela la normale risposta del midollo ad una diminuzione periferica dei globuli rossi; il conteggio dei reticolociti, nel caso di severa anemia emolitica, pu risultare aumentato fino al 20%. L'anemia dell'emolisi solitamente normocitica, sebbene una marcata reticolocitosi possa portare ad un aumento del volume corpuscolare medio (MCV), in quanto i reticolociti possiedono un MCV superiore di circa il 20% rispetto ai globuli rossi maturi. I conteggi leucocitario e piastrinico si rivelano necessari nell'individuare un eventuale disordine ematologico o neoplastico coesistente. Indispensabile risulta l'indagine microscopica dello striscio periferico, che consente sia di visualizzare la reticolocitosi, attraverso la presenza di emazie pi grandi e lievemente policromatiche (policromasia), sia di evidenziare alterazioni della morfologia eritrocitaria (presenza di sferociti o schistociti). I primi sono eritrociti pi piccoli delle cellule normali e possono ritrovarsi nella sferocitosi ereditaria e nell'anemia emolitica immune. Gli schistociti sono invece globuli rossi frammentati, la cui identificazione essenziale per la diagnosi di anemia emolitica microangiopatica1,2. La distruzione dei globuli rossi comporta un incremento della bilirubina indiretta (non coniugata), un aumento della lattato-deidrogenasi (LDH, EC 1.1.1.27) e un decremento dei livelli di aptoglobina. L'LDH e l'emoglobina sono rilasciati in circolo quando i globuli rossi vengono distrutti e l'emoglobina liberata viene convertita in bilirubina non coniugata nella milza oppure pu essere legata nel plasma dal278

l'aptoglobina. Il complesso emoglobina-aptoglobina viene rapidamente rimosso dal circolo ad opera degli epatociti e, poich i metodi di dosaggio valutano l'aptoglobina libera, in caso di emolisi intravascolare la concentrazione di aptoglobina risulta ridotta od assente. In uno studio recente3 stato prospettato l'uso dell'Hb glicata come test sensibile nella diagnosi di emolisi. L'emoglobina glicata si forma per glicosilazione dell'HbA ed il grado di glicosilazione dipende direttamente dalla concentrazione di glucosio nel sangue e dal tempo di esposizione degli eritrociti al glucosio. Nei pazienti con anemia emolitica, gli eritrociti periferici sono relativamente giovani, a causa dell'emolisi recente, e l'Hb non ha abbastanza tempo per reagire con il glucosio del sangue, pertanto la quantit di Hb glicata, misurata come HbA1c bassa se confrontata con controlli di pazienti sani. Nel caso di severa emolisi intravascolare, essendo saturata la capacit di legame dell'aptoglobina, le molecole di emoglobina passano il filtro renale e vengono assorbite dalle cellule del tubulo renale prossimale, all'interno del quale vengono catabolizzate; il ferro viene dissociato ed immagazzinato in molecole di ferritina ed emosiderina. Le cellule senescenti dell'epitelio tubulare passano nell'urina e la presenza di emosiderina nel loro interno pu essere rivelata mediante la colorazione di Pearls del sedimento urinario (emosiderinuria). Nell'emolisi intravascolare grave viene saturata anche la capacit di riassorbimento tubulare e l'emoglobina compare in soluzione nell'urina del paziente (emoglobinuria), conferendo alle urine il caratteristico colore rosso-bruno. L'emolisi acuta intravascolare massiva pu comportare la comparsa di insufficienza renale acuta, per cui importante, in questi casi, anche il controllo della diuresi, del peso specifico delle urine, della creatininemia e dell'azotemia.

CLASSIFICAZIONE
La classificazione risulta piuttosto complessa tenendo conto che vi sono due gruppi principali di anemie emolitiche: - da causa extraglobulare - da causa intraglobulare All'interno di questi due gruppi pu essere effettuata una ulteriore classificazione (Tab. 1). In questa rassegna verranno trattate alcune di queste anemie, in particolare le forme da causa extraglobulare, per le quali maggiore l'apporto diagnostico del laboratorio generale, con esclusione di quelle da alloanticorpi.

Anemia emolitica da cause meccaniche e fisiche


L'anemia emolitica microangiopatica un'emolisi da frammentazione delle emazie, causata da un danno in circolo della membrana eritrocitaria, con conseguente emolisi intravascolare e comparsa di schistociti nello striscio periferico. I globuli rossi subiscono un danno meccanico al
LigandAssay 12 (4) 2007

Il laboratorio clinico nella diagnostica e nel controllo delle anemie

Tabella 1 Classificazione delle anemie emolitiche Anemie emolitiche da cause extraglobulari Meccaniche: anemia microangiopatica - porpora trombotica trombocitopenica (TTP) - sindrome uremico emolitica (HUS ) - coagulazione intravascolare disseminata (CID) - pre-eclampsia, eclampsia - ipertensione maligna anemia da protesi valvolari cardiache emoglobinuria da marcia Fisiche: ustioni Chimiche: piombo, rame, arsenico, veleni di serpenti Infettive: protozoi - plasmodium,babesia, tripanosoma, leishmania batteri - clostridium, streptococco, stafilococco, pneumococco, escherichia coli O157 virus - haemophilus influenzae Immuno-mediate: da autoanticorpi caldi da autoanticorpi freddi - sindrome da crioagglutinine - emoglobinuria parossistica a frigore da autoanticorpi bitermici da farmaci da alloanticorpi - malattia emolitica del neonato - reazione emolitica trasfusionale Anemie emolitiche da cause intraglobulari: Difetti di membrana: sferocitosi ereditaria elissocitosi ereditaria Da carenza enzimatica: G-6-PH PK Emoglobinuria parossistica notturna

Nel caso di ustioni estese della superficie corporea il danno termico a comportare una distruzione delle emazie nei sinusoidi splenici e, nello striscio di sangue periferico, si pu rilevare la presenza di svariate alterazioni morfologiche quali: echinociti, schistociti, microsferociti.

Anemia emolitica da agenti chimici


E' frutto di un'azione diretta dose-dipendente sulla superficie degli eritrociti da parte di agenti chimici (solventi, cloruro di metile, piombo, idrogeno arsenicale) o del veleno di alcuni serpenti. All'azione emolitica pu essere associato un quadro di ipoplasia midollare o di anemia aplastica, legata all'azione di tali sostanze. L'anemia di tipo normocromico, con la caratteristica presenza nello striscio periferico dei corpi di Heinz, evidenziabili con il blu brillante di cresile, oppure di "bite cells", eritrociti che presentano una "morsicatura" semicircolare da un lato della cellula, o di eccentrociti, che presentano l'emoglobina addossata ad una estremit della cellula, lasciando l'altra libera.

Anemie emolitiche da agenti infettivi


L'azione litica sulle emazie mediata da meccanismi diversi: di tipo anticorpale, come nel caso del Mycoplasma Pneumoniae, del Cytomegalovirus, dell'Herpes Virus; o di tipo tossico, come nel caso della sepsi da Clostridium Welchii, che si manifesta in corso di infezioni intraddominali o in corso di aborto settico. In quest'ultimo caso l'emolisi determinata dalla produzione di un'alfa tossina, una fosfolipasi che attacca i lipidi della membrana eritrocitaria per formare una lisolecitina altamente litica. Utile per la diagnosi si rivela, nel primo caso, la ricerca sierologica di anticorpi specifici e, nel secondo, l'esame colturale per l'identificazione dell'agente responsabile con la ricerca delle eventuali tossine. La malaria invece il classico esempio di danno diretto per parassitismo dei globuli rossi; la capacit dei vari Plasmodi di infettare i globuli rossi legata alla loro adesione a specifici recettori di membrana e, di tutte le specie che infettano l'uomo, Plasmodium vivax ed ovale invadono solo i reticolociti, Plasmodium malariae invade i globuli rossi maturi e Plasmodium falciparum eritrociti di tutte le et. L'anemia nella malaria dovuta alla combinazione di pi fattori che includono la distruzione dei globuli rossi mediata dal parassita e la rimozione splenica degli eritrociti infetti, accompagnata da un decremento della loro produzione. Il ruolo della milza nella distruzione globuli rossi collegato alla diminuita deformabilit degli eritrociti parassitati, al loro sequestro nella polpa rossa, alla prolungata esposizione ai macrofagi splenici ed alla rimozione delle cellule parassitate. Anche i globuli rossi non parassitati presentano una sopravvivenza minore, presumibilmente come conseguenza dell'ipersplenismo e della iperattivit macrofagica. La diagnosi consiste nella osservazione di forme intracellulari asessuate del parassita su striscio sottile del sangue periferico, colorato secondo May Grumwald-Giemsa, o a goccia spessa, colorata con soluzione di Giemsa. Le due tecniche sono complementari, infatti la goccia spessa concentrando di circa 10 volte il numero dei parassiti per campo microscopico, permette una diagnosi rapida, mentre lo striscio sottile consente di differenziare i caratteri
279

loro passaggio forzato attraverso l'endotelio vascolare del microcircolo (capillari ed arteriole terminali) parzialmente ostruito dalla formazione di trombi piastrinici. Questo fenomeno di frammentazione eritrocitaria si accompagna a vari disordini, come la porpora trombotica trombocitopenica, la sindrome uremico emolitica, la coagulazione intravascolare disseminata, la pre-eclampsia, l'eclampsia, l'ipertensione maligna, e si manifesta anche nel passaggio turbolento del flusso ematico attraverso valvole cardiache sintetiche. I globuli rossi possono anche subire un insulto diretto in situazioni di sforzo fisico prolungato, come ad esempio dopo una marcia o una corsa, e la spia d'allarme rappresentata dalla comparsa di un'emoglobinuria (emoglobinuria da marcia) subito dopo l'evento traumatico. Sebbene in quest'ultimo caso la frammentazione delle emazie non sia microscopicamente evidenziabile, la condizione porta alla comparsa di tutti gli altri segni dell'emolisi acuta intravascolare.
LigandAssay 12 (4) 2007

Il laboratorio clinico nella diagnostica e nel controllo delle anemie

morfologici delle varie specie di Plasmodium. L'accertamento indiretto prevede invece la ricerca di anticorpi specifici ma risulta utile solo per le indagini epidemiologiche o per il controllo dei donatori. Non trova applicazione per la diagnosi nel singolo caso, in quanto gli anticorpi cominciano a comparire soltanto 10-15 gg dopo l'esordio dei sintomi. Recentemente, sfruttando metodiche immuno-istochimiche, sono stati introdotti nuovi test rapidi per la diagnosi di infezione: uno si basa sulla ricerca nel siero del paziente di un antigene del Plasmodium (histidine rich protein-2 o HRP-2), specialmente di Plasmodium falciparum4, altri sulla ricerca della lattato-deidrogenasi5 e della aldolasi specifica di Plasmodium spp. Metodi biomolecolari infine consentono la ricerca del DNA del parassita e la sua identificazione, in caso di positivit, con probes specifici per le quattro specie6. La PCR probabilmente un metodo pi sensibile dell'esame microscopico per la diagnosi di tutte e quattro le specie di parassita malarico e, consentendo di rilevare meno di 5 parassiti/ L, sicuramente superiore per sensibilit ed anche per specificit agli altri metodi non microscopici7.

Anemia emolitica immune


E' mediata da anticorpi diretti contro antigeni di superficie dei globuli rossi con conseguente accorciamento della vita media delle emazie. Caratteristici sono la presenza nello striscio periferico di microsferociti e la positivit del test diretto dell'antiglobulina (DAT) o test di Coombs diretto. Viene classificata, in base al meccanismo patogenetico che determina la distruzione dei globuli rossi, mediata da anticorpi o dal complemento, in: anemia emolitica autoimmune, anemia emolitica alloimmune, anemia emolitica da farmaci.

Anemie emolitiche autoimmuni


Sono ulteriormente suddivise sulla base della temperatura ottimale di legame degli anticorpi ai globuli rossi. Esistono anticorpi caldi, IgG che presentano la massima capacit di legame alla temperatura corporea di 37C; la maggior parte di questi anticorpi si lega ai globuli rossi del paziente e solo una piccola quota circola liberamente nel plasma. Tali anticorpi non sono in grado di attivare il complemento ed inducono un'emolisi di tipo extravascolare, mediata soprattutto dal sistema monocitico-macrofagico del circolo splenico, anche se pu verificarsi un sequestro epatico, in presenza di grandi quantit di IgG legate ai globuli rossi. I complessi anticorpi-globuli rossi vengono parzialmente digeriti dai macrofagi dei cordoni del Billroth della milza con liberazione in circolo di microsferociti che, avendo una deformabilit inferiore se confrontata con quella dei globuli rossi normali, vengono successivamente intrappolati nei sinusoidi splenici e rimossi dal circolo ematico. Sebbene molti anticorpi caldi fissino il complemento sono inusuali l'emolisi intravascolare, complemento-mediata, e l'emoglobinuria, per la presenza nel plasma e sui globuli rossi di proteine che impediscono la fissazione della parte terminale della cascata del complemento (C5-C9)8. L'anemia emolitica da anticorpi caldi rappresenta l'8090% dei casi totali, nei restanti casi l'emolisi mediata da anticorpi freddi; gran parte di questi sono crioagglutinine,
280

mentre le crioemolisine sono molto meno comuni. Gli anticorpi freddi sono IgM (crioagglutinine) con una temperatura ottimale di legame da 0 a 4C; questi si legano temporaneamente alla membrana cellulare dei globuli rossi, attivano il complemento e fissano il fattore C3 sulla superficie cellulare. Questi complessi C3-globuli rossi vengono distrutti dai macrofagi del fegato (con emolisi extravascolare). Meno frequentemente, viene attivata la cascata completa del complemento sulla superficie cellulare, con conseguente emolisi intravascolare9. Esistono poi, con frequenza minore, anticorpi bitermici, cio immunoglobuline della classe IgG che si legano agli eritrociti ad una temperatura compresa fra 0 e 20C; la cascata del complemento si attiva a 37 C e determina un'emolisi prevalentemente di tipo intravascolare e, in questi casi, la distruzione dei globuli rossi risulta generalmente molto pi severa. Un'importanza fondamentale nella diagnosi di anemia emolitica autoimmune riveste il test diretto dell'antiglobulina (DAT), il quale in grado di dimostrare la presenza di anticorpi o complemento sulla superficie del globulo rosso; i globuli rossi del paziente vengono mescolati con anticorpi di coniglio o di topo, diretti contro le IgG o il C3 umano: l'agglutinazione di globuli rossi del paziente che legano l'anticorpo o il complemento indice della positivit del test. Nell'anemia da anticorpi caldi si verifica l'agglutinazione dei globuli rossi con un siero anti-IgG, in quella da anticorpi freddi risulta positivo il DAT anti-C3. Sebbene circa il 50% delle anemie emolitiche autoimmuni siano idiopatiche, alcune di esse possono essere classificate come secondarie ad altre patologie (Tab. 2)10 e questo vale quando l'associazione dell'anemia emolitica con la patologia concomitante si verifica con una frequenza maggiore di quella trovata senza tale associazione. Tutti gli autori ad esempio concordano sull'associazione tra l'anemia da anticorpi freddi e la leucemia linfatica cronica (LLC) o il lupus eritematoso sistemico (LES). Un altro criterio per considerare l'anemia emolitica secondaria la sua risoluzione dopo la correzione della patologia associata, un esempio il tumore dell'ovaio.
Tabella 2 Classificazione autoanticorpi*

delle

anemie

emolitiche

secondarie

da

Da anticorpi caldi - malattie linfoproliferative, es. leucemia linfatica cronica, linfomi di Hodgkin, linfomi - malattie reumatiche/autoimmuni, es. artrite reumatoide, LES, colite ulcerosa - alcune neoplasie non linfoidi, es. tumori ovarici, teratoma - assunzione di alcuni farmaci, es. -metildopa Da anticorpi freddi Mediata da crioagglutinine: - infezioni (es. Mycoplasma pneumoniae, mononucleosi, altre infezioni virali) - malattie linfoproliferative a cellule B, clinicamente evidenti Mediate da crioemolisine: - associata con una sindrome acuta virale nel bambino - associata con sifilide congenita o terziaria nell'adulto Da anticorpi misti: - Associata con disordini reumatici, specialmente LES Anemia emolitica immune da farmaci *Modificata da Rif 10 LigandAssay 12 (4) 2007

Il laboratorio clinico nella diagnostica e nel controllo delle anemie

Anemia emolitica da anticorpi caldi


I pazienti presentano i sintomi caratteristici dell'anemia ma, a volte, l'ittero il segno pi evidente. L'inizio spesso lento ed insidioso, anche di alcuni mesi, nonostante alcuni pazienti possano sviluppare tali sintomi in pochi giorni. La presenza di urine scure un evento raro, poich l'aumento della bilirubina prevalentemente di tipo indiretto e l'emolisi non cos rapida da provocare emoglobinuria. Nei pazienti con anemia pi severa anche frequente una modesta splenomegalia. I pazienti si presentano di regola anemici, per alcuni tuttavia l'unico segno diagnostico costituito dalla reticolocitosi sebbene un terzo dei pazienti possa presentare una reticolocitopenia transitoria. Una reticolocitopenia persistente si vista solo in pazienti con funzionalit midollare compromessa da una patologia sottostante, come nel caso di infezioni da Parvovirus, agenti chimici tossici, deficit nutrizionali. Occasionalmente si possono riscontrare leucopenia, neutropenia o trombocitopenia. L'esame dello striscio periferico contiene importanti indizi per la diagnosi: la policromasia morfologicamente correlata alla reticolocitosi e la presenza di sferociti costante nei pazienti con anemia moderata o severa. Nei casi severi pu essere osservata la presenza di globuli rossi frammentati (schistociti), di eritroblasti ed occasionalmente eritrofagocitosi da monociti. Quando presente, l'iperbilirubinemia non coniugata (indiretta) altamente suggestiva di anemia emolitica, la bilirubina totale raramente aumentata sopra 5 mg/dL (85,5 mol/L) e la frazione coniugata (diretta) costituisce meno del 15% del totale, i livelli di aptoglobina sierica sono diminuiti, quelli di LDH aumentati10. La letteratura ha enfatizzato che pazienti con emolisi intravascolare possono essere distinti da quelli con emolisi extravascolare attraverso i livelli sierici di aptoglobina11, tuttavia uno studio recente ha dimostrato che tutti i pazienti presentano un marcato decremento dei livelli di aptoglobina nel plasma, e nessuna differenza stata rilevata tra i pazienti con emolisi intravascolare e quelli con emolisi extravascolare12. L'urobilinogeno urinario aumentato, ma la bilirubina non determinabile nelle urine, a meno che non sia aumentata la bilirubina coniugata del siero. L'emoglobinuria si riscontra solo raramente nella anemia da anticorpi caldi e la sua presenza dovrebbe invece far pensare ad altre forme di anemia emolitica come quella da anticorpi freddi, l'emoglobinuria parossistica a frigore, l'emoglobinuria parossistica notturna o l'anemia emolitica da farmaci. La diagnosi della anemia emolitica da anticorpi caldi dipende dalla dimostrazione di immunoglobuline e/o proteine del complemento, legate ai globuli rossi del paziente, attraverso il test diretto dell'antiglobulina che, tranne rare eccezioni, indicativo della presenza di autoanticorpi13. La maggior parte degli anticorpi legata ai globuli rossi del paziente, ma anticorpi non legati possono essere presenti nel plasma di questi pazienti e determinati attraverso il test indiretto dell'antiglobulina (IAT o test di Coombs indiretto). La loro concentrazione dipende dalla quantit di anticorpi presenti e dalla loro affinit per i globuli rossi. Pazienti con uno IAT positivo, dovuto ad anticorpi caldi, solitamente devono avere anche un DAT positivo, ma
LigandAssay 12 (4) 2007

pazienti con la presenza di anticorpi nel plasma (IAT positivo) ma non sui globuli rossi (DAT negativo) verosimilmente non hanno un processo autoimmune ma pi probabilmente alloimmune, dovuto ad una trasfusione precedente o al passaggio, durante la gravidanza, di globuli rossi dal feto alla madre. La intensit del DAT positivo ben correlata con il numero di molecole IgG legate ai globuli rossi, come testimoniato da tecniche quantitative. Una piccola percentuale (<5%) di anemie emolitiche da anticorpi caldi pu tuttavia presentare un DAT falsamente negativo, ci perch la quantit di autoanticorpi IgG al di sotto della soglia di sensibilit per la positivit del DAT (determinata in circa 300-400 molecole per cellula)14,15; per limitare quindi questi inconvenienti stata introdotta una tecnica al gel su colonna16. In uno studio condotto da Sachs nel 200617 su 1388 pazienti, nei quali era stata esclusa una anemia emolitica immuno-mediata, vennero eseguiti sia il test diretto sia il test indiretto dell'antiglobulina; 504 furono i pazienti con IAT e DAT (pur usando la tecnica al gel) negativi; su questi venne poi eseguita un'eluizione acida e si vide che 23 pazienti contenevano anticorpi specifici, di cui 15 autoanticorpi, confermati da DAT positivi in indagini successive. L'eluizione degli anticorpi dai globuli rossi si rivelata una procedura valida per individuare la presenza di falsi negativi e la sua utilit si basa sul fatto che, nell'eluizione di alcuni millilitri di globuli rossi, la concentrazione di autoanticorpi raggiunge un valore critico, sufficiente per indurre l'agglutinazione dei globuli rossi. Si possono dunque trarre due importanti conclusioni: che il DAT deve essere sempre interpretato in associazione con il quadro clinico e gli altri esami di laboratorio e che ci si pu attendere una percentuale di falsi negativi nei pazienti con anemia emolitica autoimmune.

Anemia emolitica da anticorpi freddi


Comprende la sindrome da crioagglutinine e l'emoglobinuria parossistica a frigore. Questi disordini sono diagnosticati sulla base di reazioni sierologiche caratteristiche: la sindrome da crioagglutinine generalmente causata da anticorpi IgM che esprimono la loro maggiore reattivit a 4C, gli anticorpi della emoglobinuria parossistica a frigore sono invece immunoglobuline IgG, con una specificit diversa da quella trovata nella sindrome da crioagglutinine. Gli anticorpi vengono determinati in vitro sfruttando la loro capacit di indurre l'emolisi dei globuli rossi normali in una procedura a due tappe che richiede una prima incubazione a freddo, seguita da una incubazione a 37C in presenza di complemento. La sindrome da crioagglutinine ha una frequenza minore, se confrontata con l'anemia emolitica da anticorpi caldi18, ma sicuramente pi frequente dell'emoglobinuria parossistica a frigore e colpisce con maggior frequenza pazienti di mezza et od anziani e, pi raramente, bambini. I sintomi sono frequentemente quelli di un'anemia cronica che progredisce gradualmente. Nei casi idiopatici, a differenza di quelli secondari, il disturbo resta spesso stabile o presenta una progressione molto lenta. I reperti clinici sono pi seri per i pazienti le cui crioagglutinine sono attive a temperature pi alte e, per i risvolti clinici, l'intervallo di temperatura degli anticorpi pi importante del loro titolo. I pazienti possono presentare degli episodi di emo281

Il laboratorio clinico nella diagnostica e nel controllo delle anemie

globinuria, particolarmente a basse temperature. Altri sintomi osservati sono l'acrocianosi delle orecchie, della punta del naso, delle dita delle mani e dei piedi, che occasionalmente pu portare a gangrena delle stesse (causata da agglutinazione degli eritrociti nei capillari cutanei con stasi ematica locale), pallore ed ittero (che dipendono dal grado di emolisi e dalla capacit del fegato di eliminare la bilirubina), talvolta accompagnati da epatosplenomegalia e linfoadenopatia. Caratteristica l'autoagglutinazione del sangue anticoagulato, che si verifica rapidamente quando il sangue si raffredda a temperatura ambiente, ed frequentemente la prima osservazione che porta al sospetto diagnostico. L'autoagglutinazione viene incrementata raffreddando il sangue a 4C e regredisce scaldandolo a 37C; questa caratteristica consente di distinguere l'effetto delle crioagglutinine dalla formazione di rouleaux e dalla agglutinazione che si manifesta in alcuni pazienti con anemia emolitica immune da anticorpi caldi, nelle quali l'agglutinazione non si risolve a 37C. Questo fenomeno pu creare difficolt nell'esecuzione degli strisci di sangue periferico e nella determinazione dei parametri eritrocitari con gli analizzatori automatici. La morfologia delle emazie meno alterata che nelle anemie emolitiche da anticorpi caldi e minore pure il grado di anisocitosi e poichilocitosi, anche la sferocitosi meno intensa. Le conte leucocitaria e piastrinica sono solitamente normali, il grado di anemia modesto, la reticolocitosi in rapporto alla severit dell'emolisi mentre il midollo presenta un grado variabile di iperplasia eritroide. Fondamentale per la diagnosi la positivit del test diretto dell'antiglobulina usando anti-C3 e la sua negativit usando anti-IgG. Un'utile procedura iniziale di screening consiste nel testare la capacit del siero del paziente di agglutinare globuli rossi, di gruppo O, sospesi in una soluzione salina alla temperatura di 20C o a temperatura ambiente, dopo un'incubazione di 30-60 minuti: i sieri dei pazienti che presentano un sindrome da crioagglutinine inducono un'agglutinazione dei globuli rossi. Se il test di screening risulta negativo inutile procedere oltre, in caso contrario, sono necessari ulteriori indagini per determinare l'ampiezza termica degli anticorpi, considerato anche che il titolo delle agglutinine a freddo nella sindrome da crioagglutinine invariabilmente pi alto a 4C e decresce progressivamente a temperature pi alte. Una volta ottenuto un test di screening positivo, devono essere soddisfatti, di regola, i seguenti criteri: 1) evidenza clinica di anemia emolitica, 2) DAT positivo determinato dalla sensibilizzazione con C3 e negativo utilizzando antiIgG, 3) presenza di agglutinine a freddo con una reattivit almeno fino a 30C in soluzione salina o albumina, 4) un titolo di agglutinine a freddo a 4C >25618. Per pazienti che non soddisfino tutti questi criteri deve essere ipotizzata una diagnosi alternativa. L'emoglobinuria parossistica a frigore, un tempo considerata poco comune, stata recentemente riconosciuta causa relativamente frequente di anemia emolitica immune transitoria nei bambini. Infatti circa il 40% di ragazzi di et inferiore ai 16 anni e con un quadro di anemia emolitica autoimmune presenta anticorpi tipo DonathLandsteiner19; questo probabilmente per un uso pi frequente del test omonimo, specialmente in ragazzi con ane282

mia emolitica autoimmune accompagnata da emoglobinuria. La forma cronica rara e quasi tutti i casi sono di tipo acuto e transitorio, particolarmente comune nei giovani anche se pu colpire pazienti di ogni et. Un paio di settimane prima preceduta da un'infezione alle vie respiratorie e l'inizio dell'emolisi contrassegnato da una febbre ricorrente con successiva comparsa di urine dal colore rosso-bruno. Segni clinici comuni, oltre all'emoglobinuria, sono l'ittero ed il pallore, frequenti anche la febbre ed il dolore addominale, mentre pi rara l'epato-splenomegalia. L'anemia pu essere severa e rapidamente progressiva ed i livelli di emoglobina possono raggiungere 5 g/dL o anche valori inferiori, con presenza di reticolocitosi o reticolocitopenia in alcuni pazienti, quest'ultima dovuta ad una inibizione dell'eritropoiesi indotta da virus 20. Nello striscio periferico si possono riscontrare sferocitosi, anisocitosi, poichilocitosi, policromatofilia, schistocitosi, autoagglutinazione, eritrofagocitosi e la presenza di eritroblasti. La sferocitosi particolarmente comune nel sangue periferico e la fragilit osmotica aumentata in rapporto alla presenza di sferociti. A livello midollare pu essere presente un'iperplasia eritroide, la conta leucocitaria solitamente normale ma una leucocitosi si pu riscontrare durante l'attacco acuto. Anche la conta piastrinica solitamente normale, sebbene un incremento di numero sia stato rilevato in alcuni pazienti. L'anticorpo associato alla emoglobinuria parossistica a frigore chiamato emolisina bifasica, poich sensibilizza i globuli rossi a freddo ma li emolizza a 37C. Il test diagnostico il Donath-Landsteiner, nel quale globuli rossi normali, di gruppo O, vengono prima incubati con il siero del paziente, in presenza di complemento, a 0C e poi portati fino a 37C per un'ulteriore incubazione: a 0C non si ha lisi e neppure se l'incubazione viene effettuata solo a 37C. Poich l'ampiezza termica di questo anticorpo, intesa come la temperatura pi alta a cui avviene ancora agglutinazione, di solito inferiore a 20C, il test risulter positivo solo se l'incubazione iniziale sar ad una temperatura inferiore a 20C, e risultati ancora pi evidenti si avranno quando la temperatura di incubazione iniziale sar pi bassa. In caso di positivit del test indicato eseguire la determinazione della specificit anticorpale, che solitamente anti-P, anche se sono stati riportati casi di altre specificit. L'adesione dei globuli rossi e l'eritrofagocitosi da parte dei neutrofili piuttosto che dei monociti, un reperto importante nella forma acuta transitoria. Questo fenomeno presente nel 20% di tutti i casi e nell'80% delle forme giovanili acute transitorie21.

Anemia emolitica da anticorpi misti


Vi possono essere pazienti che presentano rilievi sierologici caratteristici degli anticorpi caldi, pur presentando anche agglutinine a freddo ad alto titolo e ad elevata ampiezza termica, soddisfacendo cos sia i criteri dell'anemia emolitica da anticorpi caldi sia quelli della sindrome da crioagglutinine22; i casi misti rappresentano circa il 7% dei casi totali. I pazienti tendono ad avere un'emolisi severa che, sebbene risponda bene al trattamento terapeutico iniziale, pu avere un decorso cronico con esacerbazioni intermittenti. La diagnosi talvolta viene formulata sulla base di studi sierologici inadeguati23, si devono pertanto individuare le
LigandAssay 12 (4) 2007

Il laboratorio clinico nella diagnostica e nel controllo delle anemie

caratteristiche degli anticorpi sierici presenti, prima di definire il tipo di anemia emolitica autoimmune presente. Esistono infatti dati che indicano che il 35% dei pazienti con anemia emolitica da anticorpi caldi presenta crioagglutinine reattive a 20C, ma una grande maggioranza di queste sono clinicamente insignificanti e solo il 5% reagisce a 37C. Quindi se non viene documentata la presenza di un anticorpo freddo con un'ampiezza termica >30C, in associazione con un anticorpo caldo, non pu essere avanzata una diagnosi di anemia emolitica da anticorpi misti18.

Terapia delle anemie emolitiche autoimmuni


La terapia nelle anemie emolitiche acute ha come fine principale quello di riportare i valori di emoglobina a livelli accettabili, di arrestare l'emolisi e di ridurre la produzione degli autoanticorpi, nelle forme secondarie invece fondamentale trattare la patologia di base. La trasfusione va limitata ai pazienti gravi con livelli di anemizzazione pericolosi; la terapia steroidea riveste maggior importanza nelle anemie emolitiche autoimmuni, soprattutto nelle forme da anticorpi caldi, mentre sicuramente pi resistenti sono quelle da anticorpi freddi. In caso di scarsa risposta agli steroidi utile la terapia immunosoppressiva con azatioprina e ciclofosfamide, che va protratta per alcuni mesi. La splenectomia va riservata ai pazienti con emolisi persistente nonostante le precedenti terapie, e l'esito positivo in circa la met dei casi trattati. Lo stesso percorso terapeutico indicato nelle anemie emolitiche a decorso cronico, legate alla presenza di anticorpi caldi, con una buona risposta alla terapia steroidea; in quelle invece da anticorpi freddi l'uso di corticosteroidi e di farmaci immunosoppressori non d risposte soddisfacenti24.

Anemia emolitica da farmaci


Questo tipo di anemia ha un'incidenza stimata intorno all'1 per mille della popolazione, e in circa il 88% dei casi dovuta a cefalosporine di seconda e terza generazione. Viene classificata sulla base di 3 diversi meccanismi di azione: 1) da adsorbimento del farmaco (aptene indotto),

2) da immunocomplesso, 3) da autoanticorpi. I farmaci responsabili di anemia emolitica sono riportati nella Tabella 39,25 e sono suddivisi sulla base del diverso meccanismo di azione. Questi disordini sono mediati da IgG ed IgM, sono clinicamente e sierologicamente indistinguibili dalle anemie emolitiche autoimmuni, e presentano il test diretto all'antiglobulina (DAT) positivo. Un esempio del meccanismo da adsorbimento del farmaco l'emolisi che si verifica in corso di terapia a base di penicillina ad alte dosi, nella quale il farmaco si attacca alla membrana dei globuli rossi e stimola la produzione di anticorpi IgG. Quando una grande quantit di farmaco si lega alla superficie cellulare l'anticorpo si lega alla membrana cellulare e determina un'emolisi extravascolare. La chinidina il prototipo di meccanismo da immunocomplesso, in cui il farmaco induce la produzione di anticorpi IgM. Il complesso farmaco-anticorpo si lega alla membrana del globulo rosso ed attiva il complemento, determinando un'emolisi intravascolare. Recentemente risulta avere credito maggiore una teoria che identifica nella formazione di un complesso ternario formato dal farmaco, da un antigene della membrana eritrocitaria e dall'anticorpo, il meccanismo patogenetico responsabile dell'emolisi25. Poich questi farmaci si legano debolmente alle proteine della membrana eritrocitaria indurrebbero la formazione di un anticorpo in grado di riconoscere un aptene formato in parte dal farmaco o da un suo metabolica adeso alla superficie eritrocitaria ed in parte da una struttura proteica della membrana. L'anticorpo rinsalderebbe il legame farmaco-membrana con attivazione del complemento ed emolisi intravasale. L' -metildopa invece un classico esempio di induzione di anticorpo antieritrocita e, sebbene il meccanismo sia sconosciuto (forse altera una proteina di membrana del globulo rosso rendendola perci antigenica), induce la produzione di anticorpi IgG antieritrociti e provoca un'emolisi extravascolare.

Tabella 3 Farmaci responsabili di emolisi immune e modalit d'azione ** Adsorbimento del farmaco (aptene) DAT anti- IgG Emolisi extravascolare Penicillina Ampicillina Meticillina Piperacillina Carbenicillina Cefalosporine - Cefuroxima - Cefotaxime - Cefazolina Immunocomplesso DAT anti-C3 Emolisi intravascolare Chinidina Idroclorotiazide Rifampicina (Rifadin ) Sulfonamidi Isoniazide Insulina Tetracicline Melfalan(Alkeran ) Probenecid Clorpromazina Streptomicina Fluorouracile Sulindac (Clinoril) Autoanticorpo DAT anti- IgG Emolisi extravascolare -metildopa Acido mefenamico L-dopa Procainamide Ibuprofene Diclofenac (Voltaren) Interferone alfa

DAT = test diretto dell'antiglobulina **Modificata da Rif. 9 e 25 LigandAssay 12 (4) 2007 283

Il laboratorio clinico nella diagnostica e nel controllo delle anemie

BIBLIOGRAFIA
1. George JN. How I treat patients with thrombotic thrombocytopenic purpura-hemolytic uremic syndrome. Blood. 2000;96:1223-29 Rock GA. Management of thrombotic thrombocytopenic purpura. Br J Haemat. 2000;109:496-507 Ho CH, You JY, Chau WK et al. Diagnostic value of serum transferrin receptor and glycosylated hemoglobin on hemolytic anemia. Ann Hematol. 2003;82(4):228-30 Rock EP, Marsh K, Saul SJ et al. Comparative analysis of the Plasmodium falciparum histidine-rich proteins HRP1, HRP2 and HPR3 in malaria diagnosis of diverse origin. Parasitology 1987;95:207-27 Piper R, Lebras J, Wentwoth L et al. A capture diagnostic assay for malaria using Plasmodium lactate dehydrogenase (pLDH). Am J Trop Med Hyg. 1999;60:109-18 Snounou G, Viriyakosol S, Jarra W et al. Identification of the four human malarial species in field samples by the polymerase chain reaction and detection of a high prevalence of mixed infections. Mol Biochem Parasitol. 1993;58:283-92 Moody A. Rapid Diagnostic Tests for Malaria Parasites. Clin Microbiol Rev. 2002;15(1):66-78 Leddy JP, Rosenfeld SI. Role of complement in haemolytic anemia and thrombocytopenia Ross GD, editor. Immunobiology of the Complement System. Orlando: Academic Press;1986; p213 Dhaliwal G, Cornett PA,Tierney LM Jr. Hemolytic anemia. Amer Fam Phisician. 2004June;11:2599-06

13.

Gehrs BC, Friedberg RC. Autoimmune hemolytic anemia. Am J Hematol. 2002;69:258-71 Gilliland BC, Leddy JP, Vaughan JH. The detection of cell-bound antibody on complement-coated human red cells. J Clin Invest 1970;49:898-906 Gilliland BC, Baxter E, Evans RS. Red cell antibodies in acquired hemolytic anemia with negative antiglobulin serum tests. N Engl J Med 1971;285:252-6 Jaiprakash M, Gupta PK, Kumar H. Role of gel based technique for Coomb's test. Indian J Pathol Microbiol. 2006 Jul; 49(3):370-2 Sachs UJH, Roder L, Santoso S et al. Does a negative direct antiglobulin test exclude warm autoimmune haemolytic anaemia? A prospective study of 504 cases. Brit J Hematol. 2006;132 651-61 Petz LD. Cold antibody autoimmune hemolytic anemias. Blood Rev. 2008;22:1-15 Sokol RJ, Hewitt S, Stamps BK, et al. Autoimmune haemolysis in childhood and adolescence. Acta Haematol. 1984;72:245-57 Wynn RF, Stevens RF, Bolton PHB et al. Paroxysmal cold haemoglobinuria of childhood: a review of the management and unusual presenting features of six cases Clin Lab Haem 1998;20:373-5 HeddleNM. Acute paroxysmal cold hemoglobinuria. Transfus Med Rev 1989;3:219-29 Nusbaum NJ, Khosla S. Autoimmune hemolytic anemia with cold and warm autoantibobies. JAMA 1985;254: 1175-6 Petz LD, Garratty G. Acquired Immune Hemolytic Anemias. first ed. New Jork: Churchill;1980 Castoldi G, Liso V. Malattie del sangue e degli organi emopoietici. 2004:129-33 Informatore farmaceutico 2007. Medicinali 67A ed. Elsevier Masson

14.

2.

15.

3.

16.

4.

17.

5.

18.

6.

19.

20. 7.

8.

21.

22. 9.

23. 10. Packman CH. Hemolytic anemia due to warm autoantibodies.Blood Rev. 2008;22:17-31 24. 11. Tabbara IA, Hemolytic anemias. Diagnosis and management. Med Clin North Am. 1992 May; 76(3): 649-68 25. 12. Kormoczi GF, Saemann MD, Buchta C et al. Influence of clinical factors on the haemolysis marker haptoglobin. Eur J Clin Invest. 2006 Mar;36(3):202-9

Per corrispondenza: Dott.ssa Manuela Miolo Laboratorio di Patologia Clinica, Ospedale S. Antonio Via Facciolati 71 - 35100 Padova Tel +39 049-8216611 e-mail: manuela.miolo@sanita.padova.it
284 LigandAssay 12 (4) 2007