Fisiopatologia 04/03/13 Carlomagno

FISIOPATOLOGIA DEL SANGUE

Costituenti del sangue

Il sangue è un tessuto liquido e costituisce circa l’8% del peso corporeo (circa 5 litri).
È costituito da una parte corpuscolata costituito da cellule di vario tipo, e una parte fluida che è il plasma.
La parte corpuscolata a sua volta è divisa in vari tipi cellulari:
la stragrande maggioranza dei tipi cellulari è rappresentata dai globuli rossi o eritrociti, che sono
presenti in numero normale compreso tra 4 e 6 milioni/µl ;
un altro tipo cellulare molto importante è costituito dai globuli bianchi o leucociti, che sono in una
concentrazione che va da 4.000 a 10.000/µl gli eritrociti sono superiori ai leucociti di un fattore
pari a mille, quindi gli eritrociti costituiscono più del 99% di tutte le cellule del sangue;
infine abbiamo delle cellule molto piccole, che sono le piastrine o trombociti, che invece si trovano
nel sangue in una concentrazione di circa 150.000-400.000/µl.
Il plasma è costituito principalmente da acqua in cui sono immerse proteine, glicoproteine e in
concentrazioni minori ioni, nutrienti e gas.

Se prendiamo del sangue, lo mettiamo in presenza di fattori anticoagulanti in una provetta (altrimenti esso
coagula nella provetta) e lo sottoponiamo a centrifugazione, vedremo che si stratificheranno 3 livelli:
1) il livello più pesante, che si trova sul fondo della provetta, è costituito da eritrociti;
2) un interfaccia biancastra costituita da leucociti e piastrine detta buffy coat: questa separa il plasma
dalle cellule rosse, ed è la porzione che viene presa nel caso si debba analizzare la qualità e la
quantità dei globuli bianchi di un paziente;
3) la parte superiore è rappresentata dalla porzione liquida, cioè il plasma.
Un altro modo per analizzare il sangue è quello di farne uno striscio: questo serve per analizzare la
componente cellulare, mentre quando centrifughiamo possiamo analizzare anche la componente plasmatica
facendo vari esami biochimici (come la concentrazione di glucosio, che è una delle indagini che viene più
frequentemente effettuata per la diagnosi di diabete).
Nello striscio di sangue noi andiamo a visualizzare la morfologia e il numero della parte corpuscolata, e
possiamo subito distinguere i 3 tipi cellulari fondamentali:
i globuli rossi, che hanno forma a disco biconcavo, e sono rossi perché veicolano l’emoglobina
(pigmento di colore rosso contenente ferro);
le cellule bianche, dette bianche perché si differenziano dalle cellule rosse, e sono di vario genere:
possono essere polimorfonucleate, con nucleo suddiviso in lobi da 2 a 5, oppure non
polimorfonucleate;
infine le piastrine, cellule di dimensione ridotta non dotate di nucleo, che sono molto più piccole
rispetto alle altre cellule ematiche.

Cellule del sangue

Eritrociti
Gli eritrociti:
- costituiscono più del 99% di tutte le cellule ematiche;
- hanno come compito il trasporto dell’ossigeno legato all’emoglobina ogni eritrocita contiene circa
300 milioni di molecole di emoglobina, e poiché ogni molecola di emoglobina può legare 4 molecole
di ossigeno, ogni eritrocita veicola circa un miliardo di molecole di ossigeno;
- hanno una forma a disco biconcavo, dovuta a questioni funzionali in questo modo il globulo rosso
ottimizza il rapporto superficie/volume, rendendo la superficie massima rispetto al volume occupato
e permettendo quindi facilmente gli scambi gassosi tra O2 e CO2;
- normalmente il globulo rosso è un pacchetto di emoglobina non contiene infatti nessun organulo,
mitocondri né nucleo;
- circa l’1% dei globuli rossi circolanti però contiene ancora qualche residuo degli organelli
citoplasmatici (soprattutto ribosomi e mitocondri, ma mai il nucleo), e questi globuli rossi ancora
immaturi vengono detti reticolociti.

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 Normalmente ne troviamo circa l’1% in circolo, ma nel caso in cui si ha un’aumentata emopoiesi
(per esempio per perdita di globuli rossi, sanguinamento o per anemie emolitiche) la percentuale di
reticolociti aumenta quindi la percentuale di reticolociti circolanti è un segno patognomonico di
anemia da perdita o da emolisi;
- i globuli rossi hanno un’emivita molto lunga, considerando che sono delle cellule anucleate: infatti
sopravvivono circa 120 giorni. In questi 120 giorni il globulo rosso non può più fare sintesi proteica,
quindi le proteine che sono presenti nella cellula devono essere in grado di funzionare per 120 giorni.
Nel globulo rosso è molto importante mantenere l’omeostasi del potenziale redox, e quindi
l’eritrocita è dotato di sistemi specifici per tamponare i radicali liberi; alterazioni di questo sistema
causano infatti anemia emolitica, perché riducono l’emivita del globulo rosso.

Leucociti
La funzione dei leucociti è quella di proteggere dagli agenti patogeni, e quindi di sovraintendere a due
fenomeni fondamentali, che sono l’infiammazione e l’immunità.
Distinguiamo i leucociti in due grosse categorie:
1. leucociti polimorfonucleati o granulari, che sono i granulociti, i quali a loro volta si distinguono in 3
tipi diversi in base all’affinità dei granuli per i coloranti: neutrofili, eosinofili e basofili.
La maggior parte dei granulociti sono neutrofili, e la loro funzione è quella di fagocitare agenti
patogeni soprattutto di natura batterica;
2. leucociti agranulari: sono rappresentati dai linfociti, che hanno una funzione nell’organizzazione
delle risposte immunitarie, e dai monociti, che si differenziano in macrofagi nei tessuti, i quali hanno
una funzione fagocitaria.
I leucociti in genere hanno una emivita molto bassa; in particolare i neutrofili hanno un’emivita
estremamente bassa; da ciò consegue che nel caso in cui si hanno danni al midollo, le prime cellule che
diventano carenti in circolo sono appunto i leucociti, e in particolare i neutrofili. Fanno eccezione invece i
linfociti della memoria, che hanno un’emivita lunghissima dell’ordine di decenni.

Piastrine
La funzione delle piastrine è quella di sovraintendere al processo di coagulazione; infatti le piastrine sono in
grado di mediare la vasocostrizione, formare un primo trombo (il cosiddetto trombo bianco) per tamponare la
fuoriuscita di sangue se ci sono lesioni della parete vascolare, e attivare la cascata della coagulazione; la loro
emivita è intermedia tra quella dei globuli rossi e dei globuli bianchi, ed è cioè di una decina di giorni.
Quando l’endotelio dei vasi sanguigni subisce una lesione, solitamente a seguito di un trauma, le piastrine
aderiscono fra di loro sul punto di rottura, formando il cosiddetto ‘trombo bianco’, e cominciano a produrre
sostanze vasocostrittrici come la serotonina, che induce la contrazione del vaso sanguigno danneggiato,
spremendo al di fuori il siero (cioè il plasma senza fattori della coagulazione) e rallentando il flusso
sanguigno. Viene prodotta anche la tromboplastina, che attiva a cascata i fattori della coagulazione; in questo
modo si innesca una cascata di reazioni che permetteranno di attivare la protrombina in trombina. Questa, a
sua volta, attiverà il fibrinogeno (proteina lunga e lineare) in fibrina (proteina filamentosa e insolubile);
l’intreccio dei filamenti di fibrina trattiene le piastrine, i globuli rossi e i leucociti, formando il trombo
definitivo (detto anche ‘trombo rosso’).
Successivamente interverrà nella lisi del coagulo la plasmina, attivata a sua volta dal plasminogeno; una
deficienza di plasmina può provocare una tendenza alle trombosi e aumentare il rischio di infarto.

Emocromo
L’emocromo ci dà una serie di informazioni che sono cruciali per la pratica medica.
Consiste non solo nel contare il numero delle cellule che compongono il sangue di un paziente, ma ci dà
anche informazioni circa lo stato funzionale dei globuli rossi; infatti nell’emocromo noi leggiamo anche la
concentrazione di emoglobina nel sangue, l’ematocrito (cioè il volume corpuscolato del sangue) e una serie
di altri parametri dei globuli rossi, come il volume cellulare medio, la quantità di emoglobina media per
globulo rosso e la concentrazione dell’emoglobina per globulo rosso.
Consideriamo l’emocromo di questo paziente, che è sano perché tutti i parametri sono normali:
- i globuli bianchi sono presenti in una concentrazione compresa tra 4.500-13.500/mm3 o µl questo
paziente ha una quantità di globuli bianchi (8,41X103) nella norma;
- i globuli rossi sono compresi tra 4-5 milioni/mm3 anche in questo caso il paziente ha un numero
di globuli rossi congruo;

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 - le piastrine sono comprese tra 130.000-400.000/ mm3 il paziente ne ha 223.000, e anche in questo
caso rientra norma.
I valori di riferimento possono essere leggermente diversi da laboratorio a laboratorio, perché sono i valori
che vengono considerati standard per la macchina con cui vengono contate le cellule del sangue; pertanto
non esiste un valore normale in assoluto, ma si deve sempre far riferimento ai valori indicati su ogni
specifico emocromo.

Gli altri parametri, molto importanti anch’essi, sono:

- quantità di emoglobina è cruciale per poter far diagnosi di anemia, perché l’anemia è appunto
definita come la carenza di emoglobina più che una carenza di globuli rossi, in quanto a volte la
quantità di globuli rossi è normale, ma questi sono piccoli (cioè microcitici), e quindi l’emoglobina
diminuisce e l’apporto di ossigeno ai tessuti è inferiore;
- ematocrito ci dà indicazioni sul volume dei globuli rossi; infatti nel caso in cui abbiamo un
numero di globuli rossi normale ma un ematocrito diminuito, significherà che il volume cellulare dei
globuli rossi è diminuito, e quindi nel complesso l’ematocrito si abbassa. Quest’informazione
permette di derivare il volume cellulare medio dei globuli rossi; ci sono molte patologie che sono
diagnosticate proprio in base alle dimensioni dei globuli rossi, tra cui alcune anemie da mancata
produzione (come l’anemia sideropenia, di cui sono affette una donna su 3-4) o da aumentata
distruzione dei globuli rossi, come le talassemie; esistono inoltre anche anemie in cui il volume
cellulare medio è aumentato, come nelle anemie megaloblastiche da carenza di acido folico e
vitamina B12.
- quantità assoluta di emoglobina per globulo rosso;
- concentrazione di emoglobina per globulo rosso.

Formula leucocitaria
I leucociti delle diverse classi non sono presenti nel sangue nelle stesse proporzioni; la percentuale di ciascun
gruppo rispetto al totale dei globuli bianchi definisce la cosiddetta formula leucocitaria del sangue, parametro
di notevole interesse clinico. La formula leucocitaria normalmente accompagna l’esame
emocromocitometrico; la sua funzione è l’individuazione dei leucociti nella conta generale.
La formula può essere indicata in 2 forme differenti:
come percentuale di cellule bianche di un determinato tipo sul totale dei leucociti;
come numero assoluto in un dato volume di sangue.

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Entrambe le forme sono molto importanti: ad esempio,
esempio, nel caso di aumentato numero dei globuli bianchi, noi
vogliamo sapere quale di questi tipi di globuli bianchi sono aumentati (quindi in percentuale), perché questo
ci può dare indicazioni sulla natura della causa della leucocitosi; nel caso invece di danno midollare e di
riduzione della quantità di globuli bianchi, il numero assoluto di globuli bianchi è molto importante, infatti i
pazienti che presentano una quantità di neutrofili (che sono la principale barriera alle infezioni batteriche)
inferiore a circa 1.000/mm3, sono soggetti ad elevato rischio di infezione, e quindi dobbiamo sapere il
numero assoluto delle cellule circolanti.

Leggendo un emocromo, possiamo orientarci sulla diagnosi di una patologia:

Nell’esame qui riportato, il parametro alterato

alterato è quello dei globuli bianchi, quindi verosimilmente nel
paziente è in corso un’infezione. A questo punto si vede la formula leucocitaria: in questo caso c’è un
aumento dei neutrofili molto probabilmente il paziente ha un’infezione batterica.
Chiaramente non esiste una regola fissa, e la lettura dell’emocromo va corredata da altre analisi per dare una
diagnosi definitiva; esistono infatti delle forme di infezione, come la salmonellosi,, che creano addirittura una
leucopenia piuttosto che una leucocitosi;
cocitosi; poi ci sono delle infezioni virali che possono creare uno scarso
aumento dei linfociti, mentre a volte il numero dei neutrofili si alza anche in corso di infezioni virali.
In questo paziente è alterato anche il numero dei globuli rossi; in particolare,
particolare, si rileva una diminuzione degli
eritrociti. Questi 2 parametri (numero di globuli rossi e formula leucocitaria) vanno spesso di pari passo,
perché nel caso di infezione batteriche (in particolar modo quelle prolungate, come in questo paziente
soggetto
tto a infezione urinaria ricorrente) il midollo impegna la maggior parte della sua attività a produrre
globuli bianchi, riducendo pertanto la produzione degli eritrociti. Pertanto spesso infezioni batteriche (ma
anche virali) si accompagnano a anemia, e si parla di anemie in corso di infezioni.

Emopoiesi

L’emopoiesi è il processo attraverso il quale si genera il tessuto ematico.

Ha come principale scopo quello di mantenere un numero adeguato di cellule nel sangue, in maniera tale da
garantire il trasporto
to di ossigeno, garantire una risposta immunitaria e infiammatoria per contrastare l’azione
degli agenti patogeni, e garantire una protezione anti-emorragica
anti emorragica attraverso le piastrine.

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L’emopoiesi, proprio in quanto deve mantenere l’omeostasi del numero di cellule, è differente a seconda
dell’emivita della cellula che deve rimpiazzare. Infatti sebbene gli eritrociti siano la maggior parte delle
cellule del sangue, il midollo non sarà impegnato a produrre eritrociti in uguale proporzione alla loro
concentrazione ematica, poiché l’emivita degli eritrociti è molto maggiore rispetto a quella degli eritrociti;
pertanto le cellule midollari saranno principalmente cellule che si differenziano in leucociti.
Il midollo produce piastrine a partire da precursori detti magacariociti, cellule di grandi dimensioni da cui si
distaccano questi piccoli elementi corpuscolari.
Durante l’emopoiesi il midollo non consente l’immissione in circolo di cellule immature, quindi le cellule
che ritroviamo in circolo saranno tutte cellule che hanno raggiunto uno stato di differenziazione terminale, ad
eccezione dell’1% di eritrociti che sono presenti come reticolociti. Quando troveremo in circolo cellule che
non sono mature, i cosiddetti blasti, questo è un segno di proliferazione anomala del midollo, e quindi di
trasformazione neoplastica; infatti la presenza di blasti nel sangue è tipico delle leucemie.

Fasi dell’emopoiesi
L’emopoiesi avviene fin dai primissimi stadi della vita: inizialmente, durante la fase embrionale avviene nel
sacco vitellino. Nella fase fetale si sposta a fegato e milza; sempre durante la fase fatale incomincia a
comprendere lo scheletro in toto.
Nella fase neonatale si localizza soprattutto a livello dello scheletro in toto, per poi concentrarsi nell’adulto a
livello dello scheletro assiale, vale a dire nello sterno, nelle vertebre, nelle coste e nel cranio. Lo scheletro
appendicolare è escluso dall’emopoiesi, a meno che non vi sia una condizione patologica particolare (come
ad esempio le anemie emolitiche) in cui dobbiamo aumentare l’emopoiesi per mantenere costante il numero
di globuli rossi; in tal caso l’emopoiesi può avvenire anche in sede extra-midollare, cioè si può riattivare
l’emopoiesi a livello del fegato e della milza.
Riassumendo dunque, nella fase embrionale l’emopoiesi avviene nel sacco vitellino; durante la vita fetale
iniziale avviene nel fegato e nella milza; prima della nascita inizia ad attivarsi l’emopoesi a livello del
midollo osseo nello scheletro in toto; dopo la nascita lo scheletro appendicolare smette di compiere
l’emopoiesi, mentre questo processo permane a livello dello scheletro assiale; infatti il prelievo di midollo si
effettua nell’anca.

Composizione del midollo

Sebbene i granulociti e i linfociti siano la
porzione minore degli elementi corpuscolati
del sangue, in quanto sono presenti in
numero minore rispetto alle piastrine e ai
globuli rossi, il midollo è occupato
principalmente dalla loro produzione perché
sono le cellule che hanno l’emivita più
bassa. Una piccolissima parte del midollo si
occupa della produzione di piastrine, e una
certa parte si occupa della produzione dei
globuli rossi.
Il midollo è infarcito di adipociti perché ha
bisogno di energia per produrre un così
grande numero di cellule. Ci sono i
precursori delle serie trombopoietica
(megacariocita); ci sono precursori della
linea rossa, globuli rossi maturi
riconoscibili per l’assenza del nucleo,
normoblasti (che sono precursori degli
eritrociti e sono dotati di nucleo); tutte le
altre cellule sono fondamentalmente
precursori dei granulociti, e lo si vede dalle
forme strane del nucleo; c’è poi qualche
precursore dei monociti.
Il midollo è costituito da una parte cellulare e da una parte cava, che sono i seni midollari, all’interno dei
quali vengono inserite le cellule mature. Questi seni sono distinti dalle arteriole, che invece veicolano

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l’ossigeno, perché questi seni sono fatti in modo che in essi le cellule ematiche possano proliferare e
differenziarsi.
Abbiamo quindi una piccola parte che è costituita da cellule precursori della linea eritroide, qualche
megacariocita, e poi il grosso è costituito da precursori della linea bianca sia di tipo linfoide che di tipo
mieloide.

Schema dell’emopoiesi
L’emopoiesi avviene a partire da una cellula multipotente staminale, che è una cellula staminale adulta, la
quale è in grado di compiere:
divisioni simmetriche per ampliare il pool staminale quando opportuno e rigenerarsi;
divisioni asimmetriche per dare vita al progenitore comune.
Il progenitore comune si divide in:
progenitore mieloide comune;
progenitore linfoide comune.
Dal progenitore linfoide originano i linfociti, che possono differenziare o in linfociti B e plasmacellule,
oppure in linfociti T; dai precursori linfoidi non originano soltanto questi 2 tipi cellulari, ma anche le cellule
NK, che sono coinvolte nella risposta immunitaria innata.
Dalla linea mieloide si differenziano un numero di cellule molto vasto. Si differenzia infatti un precursore
comune per la linea megacariocitica ed eritroide, che poi si differenzia appunto in progenitore delle piastrine
o megacariocita, e progenitore dei globuli rossi o normoblasto. Sempre dal progenitore mieloide origina il
precursore dei mastociti, e infine il precursori dei globuli bianchi granulari e dei monociti, cioè il
mieloblasto; dal mieloblasto si differenziano sia i granulociti che i monociti, che vanno nei tessuti e si
differenziano a macrofagi.
In effetti di tutte queste cellule alcune non le troveremo nel sangue perché andranno a colonizzare i tessuti, e
sono essenzialmente i macrofagi e le mast cells.

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Cellule staminali ematopoietiche
Le cellule staminali ematopoietiche (HCS) sono state le prime cellule staminali ad essere studiate, tanto che
per molti anni si pensava che nell’adulto solo il midollo avesse cellule staminali, e che gli altri tessuti non le
avessero; invece si è visto che le cellule staminali sono presenti anche in tessuti perenni, come ad esempio il
SNC.
La differenza tra le cellule staminali adulte e quelle embrionali è che mentre quelle embrionali possono dare
vita a qualsiasi tipo cellulare, le cellule staminali adulte invece sono multipotenti ma non totipotenti.
La funzione delle HSC è quella di mantenere costante il compartimento staminale attraverso l’esecuzione di
divisioni di tipo simmetrico, e anche di fornire progenitori per l’emopoiesi attraverso le divisioni
asimmetriche.
La cellula che si genera da una divisione asimmetrica di una cellula staminale adulta ematopoietica viene
detta TAC (transit amplifying cell), in quanto questa cellula comincia a proliferare in modo più marcato,
mentre le cellule staminali in genere proliferano molto poco.
La caratteristica molecolare delle HCS è che sono presenti sulla superficie i recettori per due importanti
fattori di crescita: SCF (stem cell factor) e FLT3-ligando, che sono 2 fattori di crescita specifici per le cellule
staminali la presenza di questi 2 recettori su una cellula ne indica la staminalità.

Markers di superficie attraverso i markers di superficie, gli ematologi sono in grado di comprendere a che
stadio maturativo si trova una determinata cellula. Questi markers sono differenti tra i topi e gli uomini;
conosciamo molto bene quelli dei topi, in quanto costituiscono un modello sperimentale molto importante
per studiare l’ematopoiesi.
Le cellule staminali ematopoietiche presentano l’espressione di c-KIT, FLK2 e CD34. CD34 è un marker di
superficie tipico delle cellule staminali, non solamente di quelle ematopoietiche ma anche di quelle di quasi
tutti i tessuti.

L’origine delle cellule dendritiche non è ancora ben conosciuta; esse potrebbero originare sia dalla linea
linfoide sia dalla linea mieloide, assomigliando molto ai macrofagi.
Il precursore mieloide dà vita a 2 progenitori differenti: uno che dà vita sia al precursore megacariocitico, e
quindi alle piastrine, che al precursore eritroide, da cui originano agli eritrociti; e poi un precursore della
linea bianca, che a sua volta si divide in un precursore dei granulociti e un precursore dei
monociti/macrofagi.

Teoria di Bizzozzero secondo Bizzozzero i tessuti sono divisi in 3 diversi tipi:

I. tessuti labili, come quello ematopoietico e quello epiteliale, in cui c’è un continuo rinnovamento
delle cellule;
II. tessuti stabili, in cui normalmente non c’è proliferazione cellulare a meno che non venga richiesta,
come ad esempio avviene nel caso del tessuto epatico;
III. tessuti perenni, in cui le cellule devono essere considerate come terminalmente differenziate e
incapaci di proliferare, come per esempio il tessuto nervoso e il tessuto muscolare.
In realtà questo tipo di classificazione è ormai superata, in quanto si è scoperto che anche i tessuti stabili e
perenni presentano cellule staminali, e che questi ultime, se opportunamente stimolate, sono in grado di
compiere divisioni asimmetriche e generare cellule progenitrici che possono poi sostituire ad esempio delle
porzioni del tessuto che sono danneggiate. Quindi non esistono tessuti che non sono più in grado di
proliferare, ma di fatto tutti i tessuti contengono cellule staminali dalle quali si possono generare cellule
progenitrici.

Cellule staminali adulte le cellule staminali adulte vanno a localizzarsi in nicchie staminali, che servono a
supportare la loro crescita, proliferazione ma soprattutto a proteggere queste cellule dall’ambiente esterno. In
particolare la nicchia del midollo osseo è costituita essenzialmente da osteoblasti, cellule stromali e cellule
endoteliali.
Le cellule staminali sono caratterizzate dall’espressione di particolari fattori trascrizionali, come le proteine
HOX e GATA, e soprattutto in esse sono attivi dei pathway molecolari importantissimi che sono condivisi
non solo dalle cellule staminali ematopoietiche ma anche dalle cellule staminali adulte di molti altri tessute,
come il pathway di WNT e il pathway di NOTCH.

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Il pathway di WNT è molto importante per la staminalità della mucosa intestinale, e alterazioni molecolari di
questo pathway portano alla trasformazione neoplastica delle cellule epiteliali intestinali, come la formazione
di polipi al colon.

Dimostrazione dell’esistenza delle HCS la dimostrazione formale dell’esistenza delle HSC deriva da un
esperimento che viene spesso ripetuto anche oggigiorno in laboratorio per studiare la capacità di determinate
cellule di rimpiazzare le cellule morte.
L’esperimento consiste nel prendere 2 topolini singenici, cioè con lo stesso patrimonio genetico. Da un topo,
che viene sacrificato, si estrae il tessuto ematopoietico dalla milza, dal sangue e dal midollo; questo tessuto
viene disgregato, dopodiché viene iniettato in un topolino che ha ricevuto una dose letale di radiazioni tale da
determinare la morte di tutte le cellule del tessuto ematopoietico. Possiamo infatti dare diverse dosi di
radiazioni, e poiché il tessuto ematopoietico è il più sensibile di tutti, alla dose più bassa noi possiamo
limitare il danno al solo tessuto ematopoietico, e preservare tutti gli altri tessuti; quindi possiamo generare un
topo che ha tutti i tessuti sani tranne il midollo, che è stato di fatto eliminato; del resto questo è anche quello
che viene fatto oggi prima di effettuare un trapianto di midollo.
Se a questo topo irradiato iniettiamo la sospensione cellulare prelevata dall’altro topo, le cellule contenute
nella sospensione cellulare dal sangue saranno in grado di ricolonizzare i tessuti ematopoietici e dare vita ad
un nuovo midollo. Infatti se sacrifichiamo anche questo topo, dopo circa un paio di settimane vediamo che la
sua milza è infarcita di colonie che contengono tessuto ematopoietico in grado di generare eritrociti, leucociti
e piastrine. Questo tessuto deriva dalla proliferazione di questa sospensione cellulare, e questo ci indica che
quindi in questa sospensione cellulare sono presenti delle cellule staminali.

Queste cellule staminali hanno delle caratteristiche molto particolari: innanzitutto se prendiamo la
sospensione di cellule (in cui avremo cellule progenitrici e cellule staminali) e la incubiamo con un agente
genotossico come la timidina triziata (cioè la timidina con il trizio che danneggia il DNA, in quanto è un α-
emittente e quindi rompe la doppia elica), quello che succede è che le cellule progenitrici moriranno mentre
le cellule staminali saranno invece stabili. Ciò perché le cellule staminali proliferano poco, quindi
sintetizzano poco DNA e quindi incorporano poco timidina radioattiva, e sono dunque resistenti all’azione
genotossica della timidina triziata.
Inoltre se iniettiamo le cellule staminale nel topolino da sole, esse andranno a formare colonie che
contengono tessuto ematopoietico, ma se le teniamo in coltura e diamo loro opportuni fattori di crescita,
come ad esempio il fattore di crescita per stimolare la produzione di globuli rossi (EPO), queste
differenzieranno in coltura e daranno vita a globuli rossi.
A seconda della concentrazione di eritropoietina (EPO) che noi diamo, possiamo avere diversi risultati: se
somministriamo dosi elevate di EPO, abbiamo delle colonie molto grosse in quanto stimoliamo la
proliferazione di cellule progenitrici ad alta capacità proliferativa, mentre con basse dosi di EPO otteniamo
delle colonie più piccole, poiché stimoliamo la proliferazione dei progenitori con una più bassa capacità
proliferativa.
Ciò significa che lungo la via ematopoietica che porta alla formazione di globuli rossi abbiamo la formazione
di 2 diversi tipi cellulari:
1. cellule che hanno bisogno di più alti livelli di EPO per proliferare, che però quando vengono
stimolate effettuano un sacco di divisioni cellulari BFU-E (Burst Forming Unit-Erythroid);
2. cellule che hanno bisogno di bassi livelli di EPO, ma che quando vengono stimolate fanno solo un
numero limitato di divisioni cellulari CFU-E (Colony Forming Unit-Erythroid).
Si tratta di un meccanismo molto intelligente, in quanto l’EPO viene secreta dalle cellule renali in base alla
pressione parziale dell’ossigeno, le quali producono EPO in rapporto alla carenza di ossigeno, quindi:
bassa pressione parziale di O2 c’è bisogno di più globuli rossi viene prodotta più EPO si
stimolano cellule che hanno una capacità ematopoietica molto potente;
piccole variazioni di pressione parziale di O2 viene prodotta poca EPO si stimola la
proliferazione di cellule che hanno più bassa capacità ematopoietica.

Riassumendo l’ematopoiesi: abbiamo una cellula staminale pluripotente che diventa multipotente, perché
genera delle TACs e quindi genera progenitori della linea linfoide e mieloide. Dalla linea linfoide si
generano dei progenitori che danno origine a linfociti T, linfociti B, cellule NK e forse anche alle cellule
dendritiche. La linea mieloide genera un precursore comune, che è il precursore della linea eritroide e delle

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piastrine, e a questo punto si generano i 2 precursori della linea eritroide e di quella piastrinica; dalla linea
mielodie origina anche un altro precursore, dal quale derivano sia i granulociti che i monociti.

Fattori di crescita una cellula staminale riesce a capire in quale cellula deve differenziarsi a seconda del
comando fornito dalla presenza di diversi fattori di crescita. I fattori
fattori di crescita ematopoietici possono essere
sia generali, cioè servono a tutte le fasi dell’emopoiesi, oppure specifici per alcune linee in particolare.
In genere si tratta di glicoproteine che agiscono a concentrazioni molto basse, perché sono in grado di d essere
riconosciute con alta affinità dai recettori espressi sulle cellule bersaglio; sono prodotti sia da cellule
midollari sia da cellule non midollari (ad esempio l’EPO, che è prodotta principalmente dal rene ma anche
dal fegato, o la trombopoietina chehe è prodotta dal fegato ed è il fattore di crescita per i megacariociti).
I fattori di crescita agiscono su cellule diverse a vario livello, e la loro azione è gerarchica, sinergica e
additiva; essi non promuovono solo la proliferazione cellulare, ma anche anche la maturazione, la differenziazione
e l’attivazione funzionale e anche la sopravvivenza dall’apoptosi.
Un esempio è il G-CSF,, che è il fattore di crescita per i granulociti, il
quale induce sul precursore del granulocita non solo la proliferazione ma
anche
che il blocco del differenziamento a monocita e l’induzione del
differenziamento a neutrofilo. Inoltre in presenza di G-CSF
G queste cellule
diventano più resistenti all’apoptosi; esso poi stimola la maturazione del
granulocita e anche l’attivazione delle sue
su funzioni, come per esempio la
fagocitosi e la capacità di secernere sostanze tossiche per i batteri.
Quindi i fattori di crescita, anche se si chiamano in questo modo, non
servono solo alla crescita, ma anche a stimolare l’acquisizione di un
fenotipo completo,
mpleto, cioè maturo, che sia resistente all’apoptosi, e
soprattutto bloccano le vie differenziative alternative.
Esistono diversi fattori di crescita che hanno cellule bersaglio differenti:
alcuni sono importanti per le cellule staminali, altri sono importanti
import per le
cellule progenitrici e altri per le cellule che hanno già iniziato il loro
percorso di differenziamento.

I fattori di crescita agiscono in maniera gerarchia, sinergica e additiva.

Agiscono in maniera gerarchica in quanto ad esempio non possiamo stimolare le cellule staminali
ematopoietiche con un fattore di crescita che agisce nella fase terminale, ma dobbiamo iniziare a stimolare la
proliferazione di queste cellule con il principale fattore di crescita delle HCS,
HCS, vale a dire l’SCF, e non
possiamo invertire l’ordine in cui questi fattori vanno a stimolare le cellule.
Agiscono in maniera additiva perché spesso l’azione di un singolo fattore di crescita non è sufficiente per
stimolare la proliferazione e il differenziamento
differenziamento delle cellule staminali: ad esempio, l’SCF deve agire
insieme al ligando di FLT3 e alla IL-3.
IL
Agiscono in maniera sinergica perché non solo noi abbiamo bisogno di fattori di crescita che agiscono su
tutti i precursori, ma abbiamo bisogno anche di una combinazione di fattori di crescita che agiscono in
maniera selettiva, in modo tale da stimolare la produzione di specifiche cellule del sangue; se per esempio
noi aggiungiamo a una coltura cellulare SCF, IL-3, IL GM-CSF CSF e EPO genereremo cellule rosse, mentre se
invece aggiungiamo SCF, IL-3, 3, GM-CSF
GM e trombopoietina genereremo piastrine.

Ruolo dei fattori di crescita I fattori di crescita agiscono in maniera differente.

Per esempio KIT agisce su un recettore di membrana che ha attività tirosino-chinasica;
chinasica; altri fattori di crescita
invece agiscono su dei recettori di membrana che non sono dotati di un’attività chinasica intrinseca, ma
interagiscono con delle chinasi citoplasmatiche appartenenti alla famiglia JAK e attivano una cascata del
segnale simile a quella attivata dai recettori con attività tirosino-chinasica:
tirosino chinasica: per esempio attivano la via di
RAS-MAPK,
MAPK, ma anche particolari proteine, le proteine STAT, che sono dei fattori trascrizionali la cui
fosforilazione è in grado di mediare la formazione
formazione di dimeri e quindi l’attivazione trascrizionale di vari geni,
che sono spesso i geni che servono per il differenziamento e la proliferazione dei precursori.

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Fisiopatologia 08/03/13 Carlomagno

FISIOPATOLOGIA DEGLI ERITROCITI

ERITRO

Eritropoiesi

Per eritropoiesi si intende l’insieme degli eventi cellulari e biochimici che porta alla formazione degli
eritrociti. I precursori degli eritrociti vengono distinti in BFU-E e CFU-E:: entrambi sono esposti al fattore di
crescita eritropoietina,
oietina, ma per indurre la proliferazione delle BFU-E
BFU E c’è bisogno di alte concentrazioni di
eritropoietina, e le colonie che si formano sono particolarmente grosse (le cosiddette ‘colonie a scoppio’),
mentre per indurre la proliferazione delle CFU-E
CFU c’è bisognosogno di meno eritropoietina, però le colonie che si
vengono a formare sono più piccole.
Dal precursore BFU-E, E, affinché si formi l’eritrocita maturo ci vogliono circa 6-7
6 7 giorni: infatti BFU-E
BFU dopo
5 giorni si trasforma all’interno del midollo in reticolocita,
reticolocita, ultimo precursore dei globuli rossi; i reticolociti
sono così chiamati in quanto in essi permangono residui di organelli citoplasmatici. I reticolociti rimangono
circa 24 ore nel midollo, dopodiché vengono rilasciati in circolo dove maturano in 24 ore, or per cui è
fisiologico trovare una certa quota reticolociti in circolo.
In caso di anemia emolitica o per perdita, la quota di reticolociti nel sangue periferico aumenta, per cui
possiamo distinguere, in base al coefficiente di reticolociti nel sangue, un tipo di anemia da alterata
produzione di globuli rossi (dove i reticolociti non aumentano), da altri tipi di anemie dovute invece a
emolisi o perdita.

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Gli eritrociti nel loro processo di maturazione passano attraverso vari stadi: finché rimangono nucleatinucle
vengono detti normoblasti,, mentre una volta che hanno perso il nucleo abbiamo i reticolociti e poi gli
eritrociti maturi.. Questi ultimi hanno una caratteristica colorazione non omogenea, dovuta alla loro forma a
disco biconcavo che determina una intensa
intensa colorazione in periferia, al contorno, rispetto al centro. Questo
non è un mero dettaglio: infatti in alcuni tipi di anemie gli eritrociti risultano tondi, e più scuri al centro
rispetto alla periferia.

Esperimento di Reissmann quest’esperimento ha fatto comprendere che il fattore di crescita che favorisce
l’eritropoiesi è un fattore diffusibile; in questo esperimento abbiamo due ratti parabiotici (cioè che hanno una
circolazione in comune): uno di questi viene messo in condizione di ipossia e l’altro
l’altro in normossia. Il segnale
che vediamo nell’animale ipossico è la produzione di eritropoietina a livello renale; nel ratto ipossico si
attiva l’eritropoiesi, e dopo poco questo succede anche nel ratto che si trova in condizione normossiche.
Questo ci fa capire che l’eritropoietina è un fattore diffusibile, e che la sua produzione è determinata dalla
capacità del nostro organismo di sentire qual è la pressione parziale di ossigeno.

L’eritropoietina (EPO) funziona come omodimero, ha un peso molecolare di 33 kDa e un’emivita molto
ridotta, di circa 5 ore; è prodotta principalmente dai fibroblasti peritubulari del rene: infatti una delle
conseguenze più gravi dell’insufficienza renale è appunto l’incapacità di produrre quantità adeguate di EPO,
e ciò causa anemia
nemia da diminuita produzione di globuli rossi.
L’EPO stimola la maturazione di BFU-E BFU e CFU-E, E, e stimola varie funzioni eritrocitarie, come la sintesi di
emoglobina, ma anche la sintesi di proteine non emoglobiniche che sono comunque importanti per il globulo glo
rosso; infine stimola la proliferazione.
L’EPO è prodotta dalle cellule della corticale del rene, le quali hanno la capacità di avvertire la riduzione
della pressione parziale di ossigeno, e lo fanno attraverso un sistema che poi è anche quello che sovraintende
s
alla angiogenesi (come l’angiogenesi tumorale); questo sistema si basa sul fattore di trascrizione HIF-1 HIF
(Fattore Inducibile da Ipossia-1),1), che in condizioni di normale ossigenazione viene idrossilato dall’enzima
prolil-idrossilasi, il quale usaa l’ossigeno per idrossilare HIF-1;
HIF HIF-11 idrossilato viene poi riconosciuto da
una E3 ubiquitina-ligasi
ligasi (proteina di Von Hippel Lindau, VHL)) ed è degradato dal proteasoma. Se però la
concentrazione di ossigeno diminuisce, non è possibile idrossilare HIF-1,HIF , che dunque si stabilizza e nelle
cellule della corticale del rene attiva la produzione di eritropoietina.

L’eritropoietina ha un’azione tessuto-specifica:

tessuto specifica: il suo recettore è infatti presente sui precursori degli
eritrociti, e la sua stimolazione da parte dell’EPO cambia il rapporto fra i precursori mieloidi ed eritroidi nel
midollo da 3:1 (midollo costituito perer la maggior parte da precursori dei granulociti e monociti, poiché questi
ultimi hanno una bassa emivita e vanno prodotti continuamente) a 1:1.
Il recettore della eritropoietina è un recettore per citochine, cioè un recettore che non ha di per sé attività
attivi
tirosino-chinasica,
chinasica, ma è associato alla tirosino-chinasi
tirosino chinasi JAK, e attiva la via di JAK/STAT; oltre a questo
pathway, esso stimola anche l’attivazione della cascata di NFkB, ed entrambe queste vie proteggono
dall’apoptosi, stimolano la proliferazione e la sintesi di proteine globulo rosso-specifiche.
specifiche.

HIF è un eterodimero costituito da una subunità α e una β; la subunità β è

Controllo della sintesi di EPO HIF-1
espressa costitutivamente, mentre la subunità α è soggetta a regolazione tramite idrossilazione e
degradazione proteasomale. In presenza di concentrazioni sufficiente di ossigeno, la prolil-idrossilasi
prolil è in
grado di idrossilare HIF-1α, α, che cambia conformazione ed è riconosciuta dall’ubiquitina-ligasi
dall’ubiquitina di Von

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Hippel-Lindau, una E3 ligasi. Se la pressione parziale di ossigeno diminuisce, la prolil-idrossilasi idrossila
con molta minore efficienza la subunità α di HIF-1, e riducendosi la sua degradazione, la concentrazione di
questo fattore viene stabilizzata: esso può quindi legarsi ai suoi recettori e determinare la trascrizione del
gene che codifica per l’eritropoietina.
L’eitropoietina prodotta dalla corticale del rene, le cui cellule presentano un sensore per l’ossigeno (dato
appunto dal sistema HIF-1/VHL), agisce sui precursori eritroidi BFU-E, CFU-E e anche sui normoblasti, e
determina un aumento di cellule rosse circolanti, che raggiungono un valore sufficiente a determinare
un’adeguata pressione parziale di ossigeno nei tessuti; inoltre con l’aumento degli eritrociti anche a livello
renale si ristabilisce una corretta pressione parziale di ossigeno, e dunque il sistema che porta alla formazione
di EPO si interrompe, e in poco tempo siamo in grado di spegnere la produzione dei globuli rossi, anche
perché l’eritropoietina ha un’emivita molto breve (di circa 5 ore).

L’eritropoietina è una delle sostanze più frequentemente usate dagli sportivi per aumentare le prestazioni,
perché aumentando la produzione di eritrociti si fornisce più ossigeno ai muscoli, e quindi questi ultimi
funzionano meglio. L’EPO sintetica è prodotta come eritropoietina ricombinante dai batteri; la forma
sintetica, rispetto alla forma endogena dell’eritropoietina, possiede un diverso pattern di glicosilazione, e
quindi possiamo distinguere le due forme.

Fattori richiesti per l’eritropoiesi

La produzione di globuli rossi necessita l’utilizzo di specifici componenti:
• Fe i globuli rossi presentano notevoli quantità di emoglobina, costituita da quattro catene
globiniche complessate ognuna ad un gruppo eme che contiene Fe e lega l’ossigeno;
• vitamina B12 questa vitamina non è richiesta solo per l’eritropoiesi, ma anche per altri processi;
un suo deficit comporta danni importanti all’eritropoiesi. La vitamina B12 ha il ruolo di mantenere
l’omeostasi dei folati;
• acido folico donatore di gruppi CH3; serve per la produzione di purine e pirimidine, nonché di
amminoacidi;
• acido ascorbico (vitamina C) agente riducente che facilita l’assorbimento di Fe; perciò a chi ha
l’anemia è consigliato assumere dosi adeguate di vitamina C;
• vitamina B6 coenzima nella sintesi dell’eme;
• riboflavina;
• vitamina E;
• amminoacidi.

Ferro uno dei fattori più importanti per la eritropoiesi è il ferro. Un organismo di 70 kg contiene dai 4 ai 6
grammi di ferro, e questo è presente sia sotto forma di ferro eminico (emoglobina, mioglobina e citocromi)
nella maggior parte dei casi, che sotto forma di ferro non eminico, come quando è legato alla transferrina,
ferritina ed emosiderina (aggregato di ferritina).
Il ferro normalmente è introdotto con la dieta; dall’intestino passa poi nel plasma, dove è trasportato dalla
transferrina, che deposita il ferro al parenchima epatico, nel quale questo elemento si lega alla ferritina e
all’emosiderina, ma lo trasporta anche al midollo per la produzione di globuli rossi.
Quando l’eritrocita termina il suo ciclo vitale, il ferro in esso contenuto è recuperato dalla milza; in
quest’organo i globuli rossi senescenti sono degradati, e il ferro in esso contenuto è trasportato in circolo e
giunge nuovamente al fegato o al midollo; per cui il ferro rilasciato durante l’emolisi fisiologica è perlopiù
recuperato, e dunque ne dobbiamo assorbire soltanto piccole quantità giornalmente. Ogni giorni infatti
vengono generati circa 20 ml di sangue (che contengono 20 mg di ferro), e tanti ne vengono persi; questa
quota di 20 ml di sangue perso può aumentare sia in situazioni fisiologiche (ad esempio come accade nelle
donne durante ciclo mestruale), sia in situazioni patologiche (come le emorragie croniche, ad esempio nelle
ulcere gastriche). Dai 20 ml di sangue che perdiamo siamo però in grado di riassorbire ben 19 mg di ferro,
quindi la quota di ferro da assorbire con la dieta che ci serve per rigenerare questi 20 ml di sangue è di solo 1
mg di ferro al giorno.
Generalmente una dieta bilanciata contiene dai 10 ai 25 mg di ferro, ma una buona parte di esso non è
assorbito (soprattutto il ferro non eminico, che viene assorbito poco e viene in gran parte perso con le feci):
noi assorbiamo in genere solo il 10 % del ferro contenuto nel cibo ma, essendo il 10% di 10mg pari a 1mg,
siamo capaci di riformare i nostri 20 ml di sangue. Ovviamente se assumiamo quantità insufficienti di ferro,

12
pian piano andiamo incontro a un processo di anemizzazione, in quanto vengono deplete le riserve di questo
elemento e non siamo capaci di rimpiazzare i 20 mg di ferro persi quotidianamente.
Fra le due forme di ferro (eminico e non eminico), il ferro eminico è quello più altamente assorbibile; per
questo che se abbiamo anemia è consigliare mangiare la carne rispetto agli spinaci, nonostante entrambi gli
alimenti contengano quantità elevate di ferro, in quanto gli spinaci contengono ferro poco assorbibile. Di
fatto l’eme protegge l’atomo di ferro dall’assalto dei succhi gastrici, e il ferro eminico è riassorbito
dall’enterocita come tale, cioè complessato al gruppo eme.
Il ferro assorbito dagli enterociti è solo una piccola quota di quello introdotto con gli alimenti, ma nonostante
ciò questo ferro che noi assorbiamo è riciclato quasi del tutto; bisogna però assumere comunque una quantità
di ferro adeguata, altrimenti si può avere carenza di ferro.

Assorbimento del ferro il ferro eminico è assorbito in quanto tale

dall’enterocita, tramite il trasportatore HCP1; nel citoplasma
dell’enterocita poi esso è degradato da una eme-ossigenasi liberando
il ferro, che entra nella riserva cellulare legandosi alla ferritina.
Il ferro non eminico invece a livello dello stomaco deve essere
decomplessato dalle proteine con cui è legato, altrimenti non può
essere assorbito dal carrier del ferro non eminico (DMT1) presente a
livello della membrana apicale degli enterociti. Il basso pH e la
pepsina dei succhi gastrici liberano il ferro dalle proteine con cui è
complessato, però il pH basso tende anche a far precipitare il ferro, e
pertanto per grossa parte non può essere più assorbirlo. Per essere
assorbito dall’enterocita, il ferro libero deve passare dalla forma
ferrica (Fe+++) alla forma ferrosa (Fe++), in quanto il trasportatore del
ferro DMT1 è in grado di legare il ferro solo sotto forma ferrosa; il
ferro ferrico è ridotto a ferro ferroso da un enzima presente sulla
membrana microvillare stessa (DcytB), e una volta che è stato ridotto
a forma ferrosa esso entra nell’enterocita e si lega alla ferritina.
Il ferro ferroso è poi trasportato alla zona basale dell’enterocita, da
dove fuoriesce attraverso il trasportatore ferroportina complessato
all’efestina; ci sono poi alcune proteine plasmatiche, come la
cerulosplasmina, che convertono il ferro ferroso a ferro ferrico, il
quale può legarsi alla transferrina ed essere portato in circolo.
Il ferro attraverso il sangue è trasportato ai tessuti di deposito, quale il fegato, o ai tessuti esso viene usato
principalmente, come il muscolo o il midollo per generare i globuli rossi; una volta generati i globuli rossi, il
ferro del midollo è riciclato quasi interamente dal sistema reticolo-endoteliale della milza, così che la
quantità di ferro che dobbiamo introdurre con la dieta al giorno è di circa 1 mg.
L’assorbimento enterico del ferro è un fenomeno molto controllato grazie a proteine di produzione epatica
che stimolano o riducono l’attività del carrier per il ferro; la principale di queste proteine è l’epcidina, la cui
produzione sale nel caso di aumento dei depositi di ferro a livello epatico. L’epcidina infatti sembra essere il
principale regolatore dell'omeostasi del ferro, sia nell’uomo che in altri mammiferi; questo ormone peptidico
inibisce direttamente la ferroportina, una proteina transmembrana che trasporta il ferro fuori dalla cellula. La
ferroportina è presente nei macrofagi e nella membrana basale degli enterociti duodenali; inibendo la
ferroportina, enterocitaria l’epcidina inibisce il rilascio di ferro nel sangue da parte degli enterociti,
riducendo quindi l’assorbimento del ferro; inoltre inibendo anche la ferroportina macrofagica essa riduce
pure il rilascio in circolo del ferro già presente nell’organismo.

13
Vitamina B12 la vitamina B12 e i folati sono oligoelementi molto importanti per generare i globuli rossi;
in caso di deficit di queste sostanze abbiamo una forma di anemia detta megaloblastica. La vitamina B12 è
costituita da 4 anelli pirrolici
rrolici che vanno a formare un anello corrinico, e presenta vari radicali, fra i quali
abbiamo i radicali metilici.
La vitamina B12 è prodotta esclusivamente da alcuni microrganismi, e viene assunta tramite alimenti di
natura animale; per questo motivo le diete vegetariane, se non ben bilanciate, possono essere dannose perché
riducono l’introito di vitamina B12.
Essa è assorbita in modo peculiare: l’assorbimento della vitamina B12 richiede il fattore intrinseco (IF), che
viene secreto dalle cellule parietaliali della mucosa dello stomaco. A livello dello stomaco, la vitamina B12 è
liberata dalle proteine che la legano nei cibi attraverso l’azione della pepsina, e si lega a proteine salivari
chiamate cobalofiline salivari, o R-leganti;
leganti; nel duodeno, la vitamina B12 viene rilasciata tramite l’azione di
proteasi pancreatiche e si associa al fattore intrinseco. Questo complesso è trasportato nell’ileo, dove avviene
l’endocitosi da parte degli enterociti ileali, che esprimono sulla loro superficie recettori per il complesso
c
fattore intrinseco-vitamina
vitamina B12; esiste poi anche un assorbimento passivo, indipendente dal FI, che è però
scarsamente efficiente. All’interno delle cellule ileali, la vitamina B12 si associa con la transcobalamina II,
ed è secreta nel plasma; la transcobalamina II trasporta la vitamina B12 al fegato e ad altre cellule
dell’organismo, in particolare le cellule rapidamente proliferanti nel midollo osseo e nella mucosa che riveste
il tratto gastrointestinale.
Esistono dei casi in cui abbiamo gastrite cronica atrofica (in cui si ha la perdita delle cellule parietali della
mucosa gastica, che producono IF e HCl) e quindi diminuzione della produzione del fattore intrinseco, e ciò
riduce l’assorbimento di vitamina B12, e uno dei sintomi è proprio l’anemia.l’anemia. Esiste infatti una forma di
malattia autoimmune (gastrite autoimmune) caratterizzata proprio dalla riduzione della produzione del
fattore intrinseco da parte delle cellule gastriche, e che porta all’insorgenza dell’anemia
dell’anemia perniciosa;
perniciosa l’anemia
perniciosa è una forma specifica di anemia megaloblastica: infatti notiamo eritrociti di grandi dimensioni
(macrocitici) che però sono poco ricchi di emoglobina (ipocromici).
La vitamina B12 è trasportata nel plasma legata a una proteina trasportatrice, che è la transcobalamina II, la
quale la trasporta ai tessuti periferici e in particolare al midollo osseo.

La vitamina B12 è il rigeneratore del folato; quest’ultimo è un donatore di gruppi metilici necessario per la
sintesi di aminoacidi e soprattutto di nucleotidi.
nucleotidi. Una delle reazioni in cui sono coinvolti l’acido folico e la
vitamina B12 è quella che permette la formazione dell’amminoacido metionina, tramite la metilazione del

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gruppo SH dell’omocisteina; infatti uno dei sintomi di carenza di vitamina B12 è l’omocistinuria, in quanto
l’omocisteina, non più convertita in metionina, non è usata per essere utilizzata come metionina nella
formazione delle nostre proteine: ciò induce un aumento di omocisteina plasmatica, la quale poi è escreta a
livello renale. Un’altra reazione cruciale in cui interviene la vitamina B12 è la sintesi del succinil-CoA a
partire dal malonil-CoA, e l’assenza di vitamina B12 determina un aumento nel plasma di malonil-CoA e
una sua aumentata escrezione nelle urine, analogamente a quanto accade per l’omocisteina.

Acido folico esiste una classificazione degli acidi folici a

seconda di quanti acidi glutammici contengono; in genere
assumiamo con il cibo la forma monoglutammica. L’acido
folico è costituito da una pteridina complessata con acido
paramminobenzoico (PABA) a formare l’acido pteroico, che a
sua volta lega l’acido glutammico e forma l’acido folico.
Gli atomi di azoto N5 ed N10 sono i più importanti in quanto
sono coinvolti nel trasporto dei gruppi metilici; l’acido folico è
infatti un donatore di gruppi –CH3 nelle reazioni di generazione
di amminoacidi e di nucleotidi (in particolare pirimidine e
purine).
L’acido folico può essere idrossilato, e può essere ritrovato in
forma di idrofolato o tetraidrofolato; quest’ultima forma è
quella attraverso cui l’acido folico interviene nelle principali
reazioni biochimiche; l’idrossilazione avviene ad opera
dell’enzima idrofolato reduttasi (che consuma una molecola di
NADPH).
In seguito all’assorbimento, l’acido folico N5-metilato consente la trasformazione di omocisteina a
metionina attraverso la cessione di un gruppo metilico; si genera il tetraidrofolato, che viene ricaricato a 5-
10-metilenetetraidrofolato grazie alla conversione della serina in glicina; una reazione alternativa può essere
quella del tetraidrofolato con il formato a formare 10-formiltetraidrofolato.
Il 5-10-metilenetetraidrofolato può essere riconvertito a 5-metil-tetraidrofolato; il 5-10-
metilenetetraidrofolato è fondamentale perché entra nelle reazioni di sintesi dei nucleotidi, ad esempio
permette la conversione della desossiuridina monofosfato in desossitimidina monofosfato; l’importanza di
tale reazione spiega come un deficit di folati (dovuto a deficit di vitamina B9, cioè di folati stessi, o di
vitamina B12) corrisponda ad un deficit di sintesi di deossitimidina, e conseguente mancata o insufficiente
sintesi di DNA. Questo è il motivo per cui i pazienti con questo tipo di deficit presentano un eritropoiesi
inefficace: in questi soggetti infatti la proliferazione dei precursori eritroidi è ridotta e non riesce a generare
un numero adeguato di globuli rossi. I precursori quindi non riescono a dividersi un numero sufficiente di
volte, pertanto alla fine dello sviluppo e della maturazione il globulo rosso avrà compiuto meno divisioni
cellulari del normale e sarà più grosso, e conterrà una maggiore quantità di citoplasma.
Contemporaneamente il globulo rosso presenterà poca Hb, poiché la carenza di acido folico e di VitB12 non
consente la produzione di amminoacidi e quindi dell’Hb: i globuli rossi risultano dunque macrocitici e
ipocromici (in quanto il colore è dato dalla presenza del gruppo eme dell’Hb).

Un’altra patologia piuttosto grave che può provocare nelle donne incinta il deficit di acido folico, soprattutto
nelle prime fasi della gravidanza, è la spina bifida; con questo termine si intende l’incompleta chiusura della
notocorda, con il risultato che alcune zone del midollo spinale non risultano protette. L’assunzione di acido
folico e vitamina B12 durante i primi mesi di gravidanza ha comportato una drastica riduzione dell’incidenza
di spina bifida dal 1995 ad oggi; il motivo per cui ciò avviene è che nelle prime fasi dell’embriogenesi sono
necessarie quantità elevate di acido folico a livello dei tessuti in fase di proliferazione; l’assenza di tale
composto non permette lo sviluppo dei tessuti ed in particolare la chiusura della notocorda.

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Struttura e funzione degli eritrociti
Gli eritrociti sono cellule anucleate deputate al trasporto dell’ossigeno e della CO2; la forma a disco
biconcavo ha una spiegazione funzionale, perché aumenta la superficie a parità di volume, allo scopo di
incrementare gli scambi gassosi.
Una caratteristica molto importante degli eritrociti è il fatto che essi sono altamente deformabili, e pertanto
possono ‘piegarsi senza spezzarsi’, grazie alla presenza di una sistema citoscheletrico molto flessibile situato
al di sotto della membrana; in questo modo essi sono in grado di attraversare anche capillari con diametro
inferiore rispetto a quello dei globuli stessi.
L’emivita dei globuli rossi è piuttosto lunga (120 giorni), considerando che queste cellule non sono dotate di
nucleo, di reticolo e di ribosomi, e che per 120 giorni vivono con le scorte di proteine e nutrienti
precedentemente incamerati; essi percorrono all’interno del flusso ematico circa 300-400
300 km durante la loro
vita.
L’emivita di 120 giorni può essere spiegata con il fatto che con il passare del tempo la membrana e le
proteine invecchiano e inducono un cambiamento di forma: la forma alterata sferocitica viene riconosciuta
dai macrofagi splenici che fagocitano i globuli rossi; questo sistema permette il recupero di ferro e di
amminoacidi, e dunque consente di ottimizzare il catabolismo degli eritrociti.

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La membrana eritrocitaria è altamente specializzata e capace di resistere a forze tangenziali; essa è molto
flessibile ed è costituita da:
proteine (50%), prevalentemente integrali; l’alterazione di queste proteine può causare l’anemia
ereditaria di tipo emolitico. Esse sono fondamentalmente costituite da trasportatori ionici, ma anche
da proteine di ancoraggio al citoscheletro e proteine transmembrana;
lipidi (40%);
carboidrati (10%), legati a proteine e lipidi a formare glicoproteine e glicolipidi.
I carboidrati presenti sulla membrana eritrocitaria sono molto importanti dal punto di vista immunologico,
perché determinano i gruppi sanguigni (A,B,0) e di tipo Rh; ciascun individuo possiede antigeni differenti a
seconda del gruppo di appartenenza.
Per quanto riguarda il sistema Rh, esso è formato da un complesso gruppo di antigeni (C, D, E, etc.), la
maggior parte dei quali non è immunogenico; l’unico ad essere immunogenico è l’antigene D, che è il più
diffuso: infatti l’85% della popolazione è positiva per il gruppo Rh (Rh+), cioè è omozigote o eterozigote per
l’antigene D; coloro che mancano dell’antigene immunogeno D, pur se possiedono gli antigeni non
immunogeni C ed E, non sono tolleranti verso il fattore Rh, e se ricevono sangue Rh+ mettono in atto una
risposta immunologica.

Osservando l’assetto della membrana dei globuli rossi, si nota che essa è costituita per circa la metà da
proteine che appartengono a varie categorie:
le glicoforine (A, B, C, E) e la banda 3 sono proteine integrali di membrana; esse sono connesse a
catene carboidratiche che in alcuni casi hanno valore antigenico. Le glicoforine sono proteine
integrali monopasso, mentre la banda 3 è una proteina integrale multipasso che funge da
trasportatore anionico;
canali e trasportatori ionici (pompa sodio-potassio, etc.);
la spectrina, una proteina del citoscheletro formata da un eterodimero composto da una catena α e
una catena β; è localizzata al di sotto della membrana citoplasmatica, dove forma una rete legandosi
con la banda 3 tramite l’anchirina, e legando l’actina tramite la banda 4.1. Questo complesso di
proteine citoscheletriche, o comunque associate al citoscheletro, costituiscono un complicato sistema
reticolare molto flessibile e allo stesso tempo resistente che conferisce l’elasticità alla membrana
eritrocitaria; mutazioni a carico dei geni che codificano per queste proteine determinano la
formazione di eritrociti anomali, come sferociti e eritrociti ellissoidali, a dimostrazione di quanto tali
proteine siano importanti nell’assunzione della forma a disco biconcavo dei globuli rossi.

Emoglobina è la proteina protagonista della vita del globulo rosso; essa è costituita da 2 catene α-like e da
2 catene β-like, ciascuna delle quali presenta un gruppo eme costituito da una protoporfirina legato ad uno
ione Fe++ (ferroso); le 4 catene dell’Hb sono legate tra loro, e le interazioni più stabili si osservano tra le

17
catene α1-β1 e α2-β2, 2, mentre il legame tra α2-β1 e α1-β2 è più debole. Ogni catena dell’Hb si lega ad una
molecola di eme; l’eme si lega alle catene dell’Hb in maniera complessa: il Fe++, attraverso
attr una delle sue
valenze libere, si lega direttamente all’istidina prossimale, mentre con l’altra valenza libera si lega all’O2, il
quale a sua volta si lega all’istidina distale; inoltre vari gruppi laterali della molecola di eme intrattengono
legami con altre componenti della catena globinica, come l’acido proprionico.

L’Hb è in grado di legare l’ossigeno con una curva di saturazione a forma sigmoide: il legame Hb-O Hb 2 è
cooperativo, nel senso che l’affinità dell’Hb per l’O2 aumenta all’aumentare della saturazione; questo
fenomeno è definito allosterismo positivo.
positivo
Esistono altre condizioni che inducono un cambio dell’affinità dell’Hb per l’O2, facendo spostare la curva di
saturazione verso sinistra o verso destra:
il primo fattore è il pH:: l’abbassamento del pH diminuisce l’affinità
dell’Hb per l’O2, spostando la curva di saturazione verso destra
(effetto Bohr);); questo è un fenomeno cruciale perché consente a
livello dei tessuti (dove il pH è più basso a causa dell’elevata
dell’
pressione parziale di CO2 e della produzione di metaboliti acidi) il
rilascio di O2 e la captazione di CO2, mentre ha un ruolo inverso a
livello polmonare. Anche il metabolismo del glucosio può
influenza tale legame, attraverso la produzione di acido
aci lattico;
un altro fattore che influenza l’affinità dell’Hb per l’O2 è il legame
con la CO2: la carboaminoemoglobina presenta infatti una ridotta
affinità per l’O2;
anche la temperatura influisce sulla curva di saturazione dell’Hb:
l’aumento della temperatura
atura infatti diminuisce l’affinità dell’Hb per
l’O2.
Tutti questi fenomeni sono importanti in quanto l’Hb si deve comportare come una molecola elastica, cioè in
grado di legare O2 a livello polmonare e di cederlo a livello periferico, svolgendo al contempo
contem un’azione
opposta con la CO2, in relazione al variare dell’affinità per tali molecole.

Emoglobine patologiche esistono forme patologiche di Hb, tra cui quelle più interessanti sono la
metemoglobina e la carbossiemoglobina.
carbossiemoglobina
La metemoglobina è costituitaita da Hb che lega Fe+++ (ferro ferrico) anziché Fe++ (ferro ferroso); lo ione
ferroso può tendere spontaneamente a diventare ferrico, ma in condizioni fisiologiche esiste un enzima, la
dipendente), che converte Fe+++ in Fe++, consentendo il mantenimento di
metemoglobina reduttasi (NADH-dipendente),
++
Hb-Fe ; in caso di deficit genetico o di severo stress ossidativo, la metemoglobina reduttasi può non
funzionare, o funzionare in maniera insufficiente, e si forma la metemoglobina.

18
Un’altra forma patologica di Hb è quella complessata con il monossido di carbonio, a formare la
carbossiemoglobina;; normalmente infatti il CO si lega al gruppo eme con un’affinità circa 200 volte
superiore all’ossigeno, e fondamentalmente avvelena l’Hb, che non sarà più in grado di legare l’O2.

Emoglobine fisiologiche non esiste un solo tipo di globina α e di globina β, ma ne esistono numerosi, che
possono complessarsi in maniera diversa e che vengono espressi in maniera differente durante
l’embriogenesi, nella vita fetale e nell’adulto: durante
durante la vita embrionale vengono espresse globine esclusive
che non verranno mai espresse nella vita fetale e adulta (quali la catena ζ della classe α-like, e la catena ε
della classe β-like),
like), e anche globine che verranno poi espresse nella vita fetale (quali la globina α della classe
α-like, e quella γ della classe β-like).
like).
Queste globine possono complessarsi in vario modo; nella vita fetale, l’HbF è costituita dall’emoglobina
α2γ2. Dopo la nascita, la globina α--like rimane la stessa, mentre quelle β-like cambiano;
biano; in particolare, si ha
lo spegnimento dell’espressione della globina γ,, e la maggior parte dei precursori eritroidi inizieranno ad
esprimere la catena β-like β; infatti per circa il 96 97% l’Hb che verrà espressa nell’adulto è α2β2, detta
96-97%
(2 3%) invece non si attiverà il gene β, ma si attiverà il gene
anche HbA; in una piccola quota di globuli rossi (2-3%)
β-like δ, che insieme al gene α andrà
andrà a costituire l’HbA2; in una quota ancora più ridotta di globuli rossi si
osserva invece la persistenza dell’HbF.

Alterazioni della catena β dell’emoglobina sono alla base di emoglobinopatie, quali le β-talassemie,
β in cui si
riscontra un aumento in circolo dell’HbA2 e dell’HbF, che compensano la drastica riduzione della
produzione di HbA, o comunque della perdita di funzionalità
f dell’HbA.
Per quanto riguarda la struttura genica dei 2 loci, le varie catene α-like
like (cromosoma 16) e β-like (cromosoma
11) si trovano su due loci genici differenti, e sono disposte nell’ordine con cui vengono espresse dalla vita
embrionale a quella adulta: sul cromosoma 16 in sequenza sono presenti il gene della catena ζ e poi due i due
geni codificanti per le catene α (esistono infatti due analoghi della catene α, rispettivamente α1 e α2); sul
cromosoma 11 in sequenza sono presenti il locus dellad catena ε, γ, δ e β;; il motivo per il quale questi geni si
trovano in fila lungo i rispettivi cromosomi è che si è avuta un fenomeno di duplicazione genica, e
successivamente per esigenze genetiche i loci sono mutati differentemente così da generare catene ca
responsabili della formazione di Hb con differente affinità per l’O2, in modo tale da essere funzionale in
ambito embrionale, fetale ed adulto (in relazione alle diverse necessità).

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Nell’analisi dei globuli rossi, è possibile notare delle alterazioni andando ad analizzare, dall’ispezione dello
striscio di sangue, tre parametri cruciali: dimensioni, forma e colore dei globuli rossi; in realtà questo è un
metodo di indagine della vecchia medicina di laboratorio, e oggi si effettuano preferenzialmente analisi
molecolari.
I globuli di dimensioni normali sono detti normociti; esistono però delle forme di anemia che determinano un
aumento del volume dei globuli rossi (macrociti) e forme che determinano una diminuzione del volume
(microciti).
Esistono inoltre forme anemiche che alterano la forma a disco biconcavo (comportando la formazione di
sferociti, appunto globuli rossi che hanno perso la loro forma a disco biconcavo e appaiono sferici) e anemie
che fanno assumere ai globuli rossi un aspetto alterato, come ad esempio il tipico aspetto a falce
patognomonico dell’anemia falciforme.
La poichilocitosi è una condizione, generalmente patologica, nella quale si osservano variazioni nella forma
degli eritrociti del sangue. I globuli rossi hanno forma e dimensioni costanti e tipiche per ogni specie;
nell’uomo per esempio hanno un diametro medio di circa 7 µm e forma di lente circolare biconcava; in
presenza di alcune patologie però questi parametri possono variare ed i globuli rossi assumono diverse forme
e dimensioni: si parla ad esempio di sferociti se appaiono di forma sferica senza le classiche depressioni
centrali, di globuli a lacrima se hanno forma a goccia, a bersaglio se lo schiacciamento centrale presenta
irregolarità, schistociti (globuli rossi frammentati), drepanociti (cellule a falce, dal greco drepanon, falce) e
così via.
La poichilocitosi è il quadro tipico di un paziente talassemico in cui i globuli rossi sono completamente
alterati, e presentano eterogeneità di forma. La presenza di globuli rossi con un cerchio scuro al centro nello
striscio di sangue è tipica di alcune anemie, in cui si ha la precipitazione dell’Hb e la formazione di cellule
dette ‘bersaglio’. La sferocitosi porta alla formazione di cellule colorate diversamente da quelle normali:
infatti i globuli rossi normali sono più chiari al centro e più scuri in periferia, ma questa differenza si perde
nella sferocitosi.
Anche il colore dei globuli da informazioni circa il meccanismo patogenetico; in alcune forme anemiche i
globuli rossi risultano essere ipocromici a causa di una diminuita produzione di Hb, e quindi di eme
(pigmento responsabile del colore rosso); le anemie emolitiche non portano alla formazione di globuli rossi
ipocromici, in quanto il difetto è relativo alla quota di globuli rossi già formati e non al meccanismo di
produzione.

ANEMIE

Le anemie riguardano una condizione patologica in cui non vi è sufficiente trasporto di ossigeno ai tessuti e
quindi conseguente ipossia tissutale; questa è una definizione funzionale di anemia, ma dall’osservazione del
paziente non è facile capire attraverso questa definizione se esso presenti anemia, cioè una diminuzione della
pressione parziale di O2 tissutale, che peraltro non è facilmente misurabile.
Una definizione più semplice ed universale considera l’anemia come una condizione di diminuzione della
concentrazione di Hb, con riduzione dell’ematocrito (parametro che esprime il volume occupato dai globuli
rossi in un dato volume di sangue); non necessariamente però si tratta di anemia quando si riscontra un
numero di globuli rossi diminuito.

Classificazione per molti anni le anemie sono state distinte tra loro sulla base della morfologia dei globuli
rossi; oggi questo tipo di classificazione non è più valida, e le anemie vengono classificate in relazione ad un
criterio funzionale, cioè in base al meccanismo responsabile dell’anemizzazione.
Si distinguono 3 tipi diversi di anemie, a seconda del meccanismo di anemizzazione:
da aumentata perdita di globuli rossi;
da aumentata distruzione degli eritrociti;
da diminuita produzione.
In alcuni casi la classificazione non è cosi rigida, in quanto alcune anemie presentano un doppio meccanismo
patogenetico, come le talassemie (che sono sia emolitiche che da alterata produzione): in questo caso
abbiamo la distruzione precoce degli eritrociti in quanto la globina che non è affetta da mutazione
talassemica precipita, danneggia il globulo rosso e ne accelera la distruzione; inoltre l’alterata produzione di
una catena globinica (α o β a seconda del tipo di talassemia), non consente una produzione adeguata di HbA,
con conseguente formazione di eritrociti poco emoglobinizzati, ipocromici, microcitici e con una minore
capacità di trasporto dell’ossigeno.

20
Sintomi i parametri più importanti dell’emocromo per rilevare una situazione di anemia sono la
concentrazione dell’Hb, l’ematocrito, il numero di globuli rossi, la conta dei reticolociti (in genere l’1% delle
cellule rosse circolanti, ma questa percentuale aumenta in caso di anemia emolitica), il volume medio
cellulare (in caso di carenza di VitB12 e acido folico, tale parametro aumenta; in caso di anemia da alterata
produzione il parametro invece diminuisce), la concentrazione di Hb (che aumenta nella sferocitosi, in
quanto il globulo rosso tende a disidratarsi per alterazione dei canali di membrana) e la quantità di Hb
assoluta.
Un paziente anemico presenta una serie di sintomi, alcuni gravi, altri meno, e non tutti sono presenti in ogni
paziente: affaticamento, giramento di testa e svenimento (se la condizione è grave); diminuzione della
pressione sanguigna con aumento del battito e palpitazioni, e in casi gravi dolore al petto, angina e infarto
(sia perché aumenta il bisogno di O2 da parte del muscolo cardiaco, che perché il sangue non è ben
ossigenato ischemia); in alcuni casi si ha splenomegalia (evento che suggerisce la presenza di anemie
emolitiche caratterizzate da emolisi extravasale, che avviene appunto a livello della milza); cambio nel
colore delle feci (che diventa più scuro nelle anemie emolitiche in seguito all’aumento della produzione di
bilirubina, la quale invece diminuisce invece in patologie da alterata produzione del gruppo eme); respiro
corto, cute pallida, fredda e in alcuni casi gialla (l’anemia emolitica causa un aumento della bilirubinemia
con ittero), e anche le sclere possono ingiallire.

Anemie da perdita ematica

Le anemie da perdita ematica possono essere acute o croniche.

Nel caso di perdita ematica acuta, i sintomi e la gravità dipendono dalla quantità di sangue perso, e da se il
sanguinamento è interno o esterno; nel primo caso, si ha il riassorbimento del sangue, mentre nell’ultimo
caso ad una anemia iniziale da perdita ematica si può sommare un’anemia successiva da alterata produzione
dovuta a deficit di ferro.
Se il paziente sopravvive, nei giorni successivi alla perdita ematica si osserva un aumento del riassorbimento
di liquidi, che paradossalmente peggiora l’anemia perché diluisce la concentrazione di emazie; notiamo poi
un aumento della produzione di globuli rossi, ma anche di leucociti e trombociti (causati dall’aumento della
sintesi dei fattori di crescita, come l’eritropoietina e la trombopoietina).
L’anemia da perdita ematica cronica è più subdola e meno facilmente diagnosticabile, ed è spesso dovuta a
sanguinamento cronico, come accade nel caso di ulcere peptidiche complicate; si presenta come anemia di
tipo sideropenico, e può essere scambiata per anemia da alterata produzione, quale in effetti diventa
successivamente in quanto vengono a mancare le scorte di ferro, ma il meccanismo principale è la perdita
ematica.

Fisiopatologia 13/03/13 Carlomagno

Anemia per anemia si intende una riduzione dell’ematocrito con deficit nel trasporto di ossigeno;
l’anemia comporta la riduzione della massa circolante di cellule della linea rossa, che determina una
diminuzione del trasporto dell’ossigeno e ipossia tissutale. È quindi in genere diagnosticata come
diminuzione dell’ematocrito e dell’emoglobina.
Una riduzione del numero di globuli rossi non è tuttavia sempre associata ad anemia; ciò può avvenire in
seguito ad un aumento del quantitativo medio di emoglobina presente in ciascun eritrocito (MCH); una
riduzione della concentrazione ematica di emoglobina comporta invece sempre anemia.
Il criterio classificativo è in base al meccanismo patogenetico che causa anemia: abbiamo anemie da
aumentata distruzione di globuli rossi (emolitiche), da perdita ematica o da diminuita produzione di eritrociti;
ci sono però alcune malattie anemiche che possono avere un meccanismo patogenetico doppio, come le
talassemie, in cui abbiamo sia deficit di produzione degli eritrociti che emolisi. In passato invece le anemie si
classificavano in base alla morfologia e al colore dei globuli rossi.

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Parametri ematici di riferimento per gli eritrociti (rilevabile tramite emocromo)
Parametro (misura) Uomini Donne
- Emoglobina (gm/dL) 13.6–17.2 12.0–15.0
- Ematocrito (%) 39–49 33–43
- Conta eritrocitaria (× 106/µL) 4.3–5.9 3.5–5.0
- Conta dei reticolociti (%) 0.5–1.5
- Volume cellular medio (fL) 82–96
- Quantità media di Hb per cellula (pg) 27–33
- Concentrazione media di Hb per globulo rosso (gm/dL) 33–37
- Distribuzione della popolazione eritrocitaria (%) 11.5–14.5

Anemie emolitiche

Questo genere di anemie include una numerosa classe di malattie; la maggior parte di esse sono di origine
genetica, e inoltre alcune forme di anemia emolitica sono molto diffuse, in quanto in condizione di
eterozigosi proteggono da altri tipi di condizioni morbose, come la malaria.
Le anemie emolitiche sono anemie caratterizzate dalla distruzione prematura del globulo rosso: quindi
l’emivita della cellula si riduce, risultando inferiore ai 120 giorni fisiologici; in base alla tipologia di anemia
emolitica, l’emivita può variare da pochi a qualche decina di giorni.
In un certo senso possiamo considerare il globulo rosso una cellula ‘fragile’, in quanto non è più in grado di
produrre proteine mancando di reticolo, ribosomi, DNA e RNA, e quindi le proteine con cui inizialmente
viene messo in circolo devono durare per 120 giorni; di conseguenza, se intervengono processi che tendono a
modificare l’omeostasi degli eritrociti, questi ultimi avranno più difficoltà a ostacolare tali variazioni per essi
dannose rispetto a cellule che posseggono un programma trascrizionale che consente di fronteggiare
efficacemente queste situazioni, ad esempio tramite la sintesi di proteine deputate alla regolazione
dell’equilibrio acido-base o dei processi ossidativi.
In genere, le anemie emolitiche sono caratterizzate da un aumento dei livelli di EPO (eritropoietina), non
associata però ad aumento dei globuli rossi, e da un accumulo dei prodotti di degradazione dell’emoglobina:
queste due condizioni sono critiche per effettuare la diagnosi; infatti a volte lo striscio di sangue non è molto
identificativo, in quanto lo striscio in alcune anemie emolitiche somiglia molto a quello di un’anemia da
diminuita produzione. Ad esempio, nel caso dell’anemia sideropenica si verificherà microcitemia e
ipocromia, condizioni caratteristiche anche del tratto talassemico. Quindi la presenza di prodotti di degrado
della emoglobina, come la birilubina, ci permette di discriminare, al momento di effettuare la diagnosi, tra
un’anemia di tipo emolitico e un anemia da alterata produzione di globuli rossi.
Inoltre, se le crisi emolitiche sono lievi e il midollo giovane è in grado di reagire in maniera compensatoria,
anche se l’emivita delle emazie è patologicamente ridotta per fenomeni emolitici, possiamo avere sintomi
diversi da quelli dell’anemia (ad esempio ittero in assenza di anemia), poiché i globuli rossi e l’Hb risultano
sufficienti a non determinare ipossia tissutale.

Molto importante per comprendere la patogenesi e orientarsi in una diagnosi differenziale è l’analisi della
sede in cui gli eritrociti vengono distrutti; la sede fisiologica è la milza, in cui sono presenti macrofagi
specializzati che fagocitano gli eritrociti vecchi e riciclano il ferro in essi contenuto. Quest’ultimo processo è
molto importante, in quanto noi non siamo in grado di assorbire i circa 10 g di ferro di cui avremmo bisogno
quotidianamente per rimpiazzare alla distruzione di 10 mL di sangue al giorno; poiché il ferro degli eritrociti
viene in gran riciclato, l’introito di ferro da assumere è pertanto contenuto (circa 1g/die); altre sedi
fisiologiche in cui avviene l’emolisi dei globuli rossi sono il fegato e il midollo.
L’emolisi del globulo rosso, a seconda della sede in cui avviene, è definita:
• emolisi extravasale;
• emolisi intravasale i globuli rossi si lisano all’interno dei vasi.
Nel caso di anemia emolitica extravasale, un segno tipico è pertanto la splenomegalia; inoltre la
splenectomia, in genere, migliora le condizioni dei pazienti con emolisi extravasale, mentre questo
miglioramento è assente in caso di anemia emolitica intravasale. Togliere la milza non allunga la vita
degli eritrociti normali, ma può invece allungare la vita di eritrociti anormali; l’importanza della
splenectomia in questi soggetti risiede nel fatto che in molte delle anemie emolitiche il globulo rosso viene
distrutto nella milza, in quanto ha una morfologia alterata (ad esempio diviene falciforme, sferico), diviene
meno deformabile e non passa nei sinusoidi splenici, dove viene sequestrato e fagocitato dai macrofagi; se

22
rimuoviamo la milza, l’emivita dell’eritrocita anomalo aumenta, e quest’ultimo va in circolo e può
continuare a svolgere il suo ruolo abbastanza bene. Inoltre la stasi ematica nei sinusoidi splenici comporta la
precipitazione dell’emoglobina (in particolare della forma deossigenata), che riduce ulteriormente la
deformabilità degli eritrociti, aumentandone quindi il sequestro splenico e generando in tal modo un circolo
vizioso.
I sintomi dell’emolisi extravasale sono:
anemia;
splenomegalia;
ittero è dovuto al fatto che la degradazione dell’emoglobina determina un aumento dei livelli
ematici di bilirubina, che se supera una certa quantità si deposita nei tessuti (in particolare nelle
sclere e nella cute) determinandone una colorazione giallastra.
A volte l’anemia emolitica può presentare tra i sintomi iniziali la colestasi, in quanto la bilirubina, che viene
escreta attraverso le vie biliari, può determinare la formazione di calcoli se espulsa in eccesso, e ciò dà una
sintomatologia da stasi delle vie biliari ed eventualmente epatite, a volte prima ancora che si manifesti
l’anemia stessa; ciò si verifica soprattutto nei soggetti giovani, in cui le HSC sono vigorose e riescono a
compensare la perdita di globuli rossi.
In alcune forme più gravi avremmo sovraccarico di ferro, perché la sintesi di epcidina diminuisce dal
momento in cui il fegato percepirà una diminuzione della pressione parziale di ossigeno, e quindi stimolerà il
riassorbimento di ferro; però in questo caso l’emolisi avverrà nei sinusoidi splenici e quindi il ferro che
deriva da questa emolisi viene riciclato. Quindi da una parte non avremmo una perdita di ferro e su un altro
versante ci sarà un aumento del riassorbimento di ferro; nei pazienti affetti da talassemia questo è un
problema particolarmente importante, tant’è vero che i pazienti devono essere sottoposti a terapia chelante
del ferro fino a che non diminuisce la sideremia.
L’anemia emolitica intravasale è causata da meccanismi molto diversi: può essere dovuta a problemi
meccanici (ad esempio valvole cardiache artificiali), di natura infettiva o provocati da agenti tossici (sepsi da
clostridi), oppure a malattie genetiche, all’azione impropria del complemento o a parassiti intracellulari
(malaria).
La sintomatologia è solo in parte sovrapponibile con quella dell’emolisi extravasale, in quanto riscontriamo
anche qui l’ittero; ci sono però dei sintomi differenti. Nell’emolisi intravascolare rileviamo infatti:
anemia;
emoglobinemia;
emoglobinuria facilmente diagnosticabile poiché, in particolare se sostenuta, determina
iperpigmentazione urinaria;
ittero.
Nell’emolisi intravasale inoltre abbiamo perdita di ferro, contrariamente al caso delle anemie con emolisi
extravasale. L’emoglobinuria avviene perché il legame con l’aptoglobina viene saturato; l’aptoglobina è
proteina plasmatica che si combina con l’emoglobina extraglobulare per formare un complesso aptoglobina-
emoglobina, il quale è rapidamente captato ed eliminato dalle cellule del sistema reticolo-endoteliale, che in
questo modo recuperano il ferro; nel momento in cui l’emoglobina è molto concentrata nel sangue, la
concentrazione di aptoglobina non è sufficiente a legare tutta l’emoglobina e non può più impedire la
filtrazione renale dell’emoglobina in eccesso.
In un midollo da anemia emolitica (sia extra- che intravasale) osserviamo un’espansione della linea eritroide,
poiché i normoblasti sono molto di più che in condizioni fisiologiche, essendo in rapporto 1:1 con i
precursori della linea bianca rispetto al normale rapporto 1:3-4.
Un altro segno dell’anemia emolitica è l’aumento dei reticolociti in circolo (fino al 10%-15% della
popolazione eritrocitaria totale).

Sferocitosi ereditaria
La sferocitosi ereditaria è una patologia piuttosto frequente nel Nord-Europa (dove 1 individuo su 5.000 è
affetto), ed è trasmessa come tratto autosomico dominante, nonostante sia caratterizzata da una perdita di
funzione (loss of function); si tratta di una malattia piuttosto benigna nella sua forma classica.
In realtà non si tratta di una singola malattia, ma di un gruppo di malattie, poiché essa può essere scatenata
da alterazioni di più geni differenti, che sono quelli che codificano per le proteine del citoscheletro dei
globuli rossi, il quale è strutturato in modo tale da consentire all’eritrocita di assumere la forma a disco
biconcavo, la quale ottimizza il rapporto superficie/volume, importante per gli scambi gassosi.

23
Il globulo rosso presenta un reticolo citoscheletrico al di sotto della membrana formato da varie proteine
(anchirina, α/β-spectrina,
spectrina, banda 3 e banda 4.2, banda 4.3) che rappresentano il 40%-50%
40% 50% dei costituenti della
membrana; se queste proteine mutano, daranno una patologia che rientrarient nella sferocitosi ereditaria.
ereditaria
A volte l’accoppiamento di due individui affetti che, ad esempio, presentano la mutazione di due proteine
differenti, daranno origine a una progenie colpita da sferocitosi ereditaria grave: si parla in questo caso di
compound heterozygosity o di eterozigosità composta (doppi eterozigoti, ossia eterozigoti per due proteine
differenti, coinvolte però nella stessa patologia).
L’emolisi è di tipo extravasale: l’alterazione del citoscheletro fa sì che la membrana non sia più elastica,
elas
quindi nel momento in cui i globuli rossi passano attraverso i capillari si danneggia la membrana e se ne
disperdono dei frammenti, e dunque l’eritrocita perde la sua forma a disco biconcavo e diviene tondo,
riducendo il rapporto superficie/volume (poiché
(poiché la forma sferica è quella che consente la minima superficie a
parità di volume). Questa morfologia tonda viene riconosciuta dai macrofagi splenici, che fagocitano gli
eritrociti di forma tonda (sferociti), ), determinando emolisi; questo meccanismo è in realtà anche quello
fisiologicamente utilizzato per degradare i globuli rossi senescenti: infatti dopo un centinaio di giorni dal
rilascio in circolo dell’eritrocita normale, quest’ultimo tende ad acquisire una forma tonda. Gli sferociti sono
fagocitati preferenzialmente
referenzialmente rispetto ai normali eritrociti in quanto essi permangono nella milza per più
tempo rispetto ai globuli rossi che hanno una forma a disco biconcavo.
La durata media della vita degli eritrociti è ridotta a 10-20
10 20 giorni; spesso le mutazioni sono
s frameshift,
oppure comportano la formazione di codoni prematuri di stop: sono dunque alterazioni genetiche che
provocano una perdita di funzione.
Essendo l’emolisi extravasale, la splenectomia migliora notevolmente le condizioni del paziente, in quanto
ciò aumenta la vita media dei globuli rossi, che non vengono lisati al livello della milza.

Patogenesi tutto comincia dal difetto della flessibilità di membrana (data dall’alterazione del
citoscheletro) che porta alla perdita della deformabilità dell’eritrocita; a questo punto si ha un precoce danno
alla membrana del globulo rosso e l’assunzione della forma sferocitica;; lo sferocita viene riconosciuto dai
macrofagi splenici.
Inoltre contribuisce a diminuire l’emivita dei globuli rossi anche l’eritrostasi
l’ trostasi vasale,
vasale data dal fatto che
l’eritrocita resta incastrato nei capillari, e questa stasi accentua il sequestro splenico degli sferociti;
l’emostasi inoltre causa scarsa ossigenazione, un abbassamento del pH ed una deplezione delle riserve di
glucosio,
o, che contribuiscono all’ulteriore danneggiamento e perdita di membrana del globulo rosso, che
quindi assume la forma sferica.

Da un punto di vista morfologico, si evidenziano negli strisci di sangue eritrociti senza pallore centrale
(presente invece in quelli con la caratteristica forma normale a disco biconcavo) e di minori dimensioni,
caratteristiche che sono patognomoniche di questa patologia. Inoltre la concentrazione media di emoglobina
per globulo rosso tende ad aumentare; questo in quanto la perdita
perdita di membrana porta alla disidratazione del
globulo rosso, e questo fa sì che la quantità di emoglobina sia la stessa ma che la concentrazione aumenti; si
può rilevare inoltre nei pazienti un’iperplasia del midollo, un ittero lieve, emosiderosi e colestasi.
coles L’aumento
della concentrazione media di Hb per globulo rosso in seguito a disidratazione veniva sfruttata in passato per
diagnosticare la sferocitosi, data l’assenza di tecniche genetiche più sensibili.
Raramente c’è bisogno di trasfusioni nei soggetti
sogget affetti, tranne in caso di crisi aplastica,
aplastica scatenata da
infezioni da parvovirus che uccidono i progenitori eritrocitari, aggravando ulteriormente l’anemia.
Per diagnosticare la sferocitosi è possibile effettuare un test di sensibilità alla lisi osmotica
osmoti degli eritrociti,
ponendoli in una soluzione che ha una concentrazione di NaCl inferiore a quella fisiologica; ad ogni

24
concentrazione del liquido la sensibilità risulta aumentata (cioè si lisano più facilmente) rispetto ai globuli
rossi normali.

Deficit di G6PD (Favismo)

Il globulo rosso non è più in grado di sintetizzare proteine, quindi
deve avere un sistema di reazione allo stress ossidativo molto
solido in grado di durare circa 120 giorni; questo sistema è legato
all’enzima glucosio-6-fosfato deidrogenasi
drogenasi, importante nello shunt
dei pentosi poiché non solo attiva la via di formazione di zuccheri
pentosi, ma permette di rigenerare il NADPH dal NADP+ a partire
dal glucosio, che viene trasformato in 6-fosfo-gluconato.
6 Il
NADPH permette la riduzione del glutatione ossidato; il glutatione
ridotto tampona i radicali dell’ossigeno e l’acqua ossigenata.
Quindi la deplezione di G6PD fa sì che il glutatione resti
r ossidato,
il che non permette la riduzione dell’H2O2 e di altri radicali in H2O,
così si viene a creare una condizione deleteria per l’eritrocita, che
non riesce a sopportare lo stress ossidativo.
Ci si potrebbe chiedere per quale motivo, essendo la G6PD
ubiquitaria in tutte le cellule dell’organismo, la sua assenza provoca
solo un’anemia emolitica; la risposta consiste nel fatto che mentre
nelle altre cellule ci sono anche altri modi per evitare le
conseguenze distruttive dello stress ossidativo, ciò non accade
nell’eritrocita, che non possedendo il nucleo, non può sintetizzare
proteine per attivare altre vie di difesa dai ROS.

Questa malattia è molto diffusa soprattutto nell’Africa subsahariana e nel medio-oriente;

medio infatti le due
mutazioni più frequenti
enti sono rispettivamente quella africana (V68M) e quella medio-orientale
medio (S188F);
queste due mutazioni determinano una patologia piuttosto grave. La motivazione per cui questa malattia è
molto presente in queste zone dipende dal fatto che è vantaggiosa in quanto protegge dal Plasmodium, cioè
l’agente etiologico della malaria. Anche altre malattie degli eritrociti sono molto diffuse nel bacino del
Mediterraneo, proprio perché la condizione di eterozigosi permette di essere protetti dall’infezione malarica,
determinando una sorta vantaggio genetico.
Il deficit di G6PD però è una patologia recessiva X-linked,
X linked, pertanto generalmente i maschi sono o affetti o
sani, mentre le donne posso essere anche soltanto portatrici; la condizione di portatore dunque non si verifica
ve
nell’uomo, essendo una malattia X-linked.
linked.
Il gene è altamente polimorfico: infatti esistono dei poliformismi che inficiano leggermente la funzione di
questo enzima nella cellula, pur risultando protettivi verso l’infezione da plasmodio; inoltre questo
ques suo
carattere polimorfico è anche sfruttato per individuare quale cromosoma X viene inattivato nelle cellule dei
soggetti femminili per formare il corpo di Barr.

25
Si tratta di una malattia piuttosto conosciuta, in quanto ne sono stati affetti numerosi personaggi
p importanti,
come Pitagora, che proprio in quanto presentava questa patologia, vietava ai suoi discepoli di mangiare le
fave; probabilmente egli aveva notato che assumere fave provocava crisi emolitiche. Il favismo è una
malattia in cui i pazienti stanno abbastanza bene, a meno che non assumano sostanze che inducono stress
ossidativo, come alcuni farmaci (clorochina) o nel caso di alcune infezioni (poiché i leucociti producono
radicali liberi), oppure anche se si consumano alcuni alimenti contenenti
contenenti sostanze ossidanti (come le fave,
che contengono vicina e covicina) che pertanto provocano crisi emolitiche; questo è il motivo
dell’idiosincrasia di Pitagora per le fave; un’ulteriore prova che supporta la teoria che Pitagora fosse affetto
da favismo è che lui viveva nell’area di Crotone, dove l’incidenza di questa malattia era molto alta.

I globuli rossi colpiti da deficit di G6PD vanno incontro ad emolisi

extravasale perché, in casi di stress ossidativo, i gruppi sulfidrilici (-SH)
( delle
cisteine presenti nell’emoglobina vengono ossidate, quindi si formano ponti
disolfuro intracatena nell’emoglobina:
emoglobina: ciò determina la precipitazione delle
globine e la formazione di agglomerati, definiti corpi di Heinz; questi corpi
danneggiano la membrana, il che permette il riconoscimento, da parte dei
macrofagi splenici, e la fagocitazione.
In uno striscio ematico, possiamo notare l’azione dei macrofagi sugli
eritrociti, che in alcuni casi appaiono come ‘morsi’ dal macrofago; la
presenza di questi eritrociti è utile per identificare i pazienti affetti da questa
patologia.
Il deficit di G6PD è una malattia composita
omposita poiché l’emolisi, oltre ad avvenire a livello splenico (provocando
splenomegalia), si verifica anche nei vasi, soprattutto quando il paziente è esposto a sostanze ad alto potere
ossidante; in questo caso si parla di crisi emolitica acuta, che comporta
comporta emoglobinemia e emoglobinuria; un
altro segno in generale del deficit di G6PD è poi l’ittero. Le crisi emolitiche indotte da stress ossidativi
quindi sono prevalentemente intravascolari, ma sono tollerabili ed autolimitanti perché avvengono
soprattuttoo a carico dei globuli rossi più vecchi, mentre quelli più giovani vengono fagocitati nella milza.

Anemia falciforme
Questa malattia è molto diffusa in Italia, soprattutto in
Campania, in cui generalmente si effettua fare lo screening
prenatale per individuare
iduare i portatori, ed è anch’essa una malattia
genetica, a carattere autosomico recessivo. Altri luoghi in cui la
patologia è particolarmente presente sono il bacino del
Mediterraneo; la diffusione di questa malattia è localizzata in
queste zone in quanto anche in questo caso viene garantita la
protezione nei confronti del Plasmodium Falciparum (vantaggio
dell’eterozigote).
Si tratta di una malattia che possiede una specifica causa
genetica molto precisa, in quanto è provocata da un’unica
done 6 della catena β dell’emoglobina, in cui
mutazione del codone
l’acido glutammico viene sostituito con la valina (E6V);
( si tratta
di un cambio sostanziale, in quanto il primo è un amminoacido
acido e carico negativamente, mentre il secondo è apolare. L’emoglobina che porta questa mutazione è detta
HbS;; per HbS si intende pertanto l’Hb formata dal tetramero α2β2 in cui la catena β presenta la mutazione
E6V.

26
La patogenesi nei pazienti che presentano la mutazione
E6V nella β-globina
globina è data dal fatto che l’HbS (da Hb
delle sickle cells,, o cellule a forma di falce) è solubile
quando si trova in una conformazione ossigenata, però
se cede l’ossigeno questa emoglobina patogena tende a
formare degli aggregati; questi polimeri, chiamati corpi
tattoidi,, provocano uno stiramento delle pareti della
membrana e fanno sì che la cellula assuma la
caratteristica forma a falce.
Il fenomeno è reversibile, quindi quando la molecola si
riossigena il globulo rosso riassume la sua
conformazione iniziale; questo ciclo però funziona per
un numero limitato
imitato di volte, poiché durante il processo
di assunzione della forma a falce e poi ritorno alla
conformazione normale si ha perdita di membrana,
quindi a un certo punto il globulo rosso non è più
capace di ritornare alla sua conformazione fisiologica.
Di fatto l’emoglobina funziona anche nei drepanociti,
ma questi ultimi hanno una conformazione a falce:
questa è la meno opportuna per poter attraversare il
letto capillare, quindi tenderanno a occludere i vasi
provocando microinfarti tissutali.
Quindi, riassumendo,
ssumendo, la patogenesi dell’anemia
falciforme dipende dalla tendenza della emoglobina
alterata a polimerizzare, generando globuli rossi a
forma di falce che hanno una emivita limitata in quanto
vengono riconosciuti e fagocitati dai macrofagi splenici; inoltre
inoltre non permettono più il passaggio di sangue al
livello del letto capillare provocando ischemia tissutale. Il fenomeno è ulteriormente aggravato da una sorta
di circolo vizioso, in quanto gli eritrociti bloccati al livello dei capillari provocano stasi ematica,
e e questo
aumenta la concentrazione di HbS deossigenata (in seguito all’abbassamento della pressione parziale di
ossigeno), che comporta la formazione dei corpi tattoidi e determina un vero e proprio blocco ematico a
livello capillare.
In uno striscio di sangue di soggetti affetti, si rilevano i caratteristici
globuli rossi che presentano una forma a falce; si tratta di un segno
patognomonico di questa malattia. Queste cellule che hanno questa
particolare forma vengono dette sickle cells, o drepanociti.
drepanociti
La disidratazione dei drepanociti provoca un aumento della
concentrazione media di emoglobina per globulo rosso, che favorisce
l’aggregazione dell’HbS; inoltre anche un abbassamento del pH accentua
la formazione di aggregati emoglobinici, in quanto riduce la quantità di
emoglobina ossigenata (ossiemoglobina).

Epidemiologia la
distribuzione della
patologia è
totalmente
sovrapponibile con i territori in cui è endemica la
malaria; infatti l’anemia falciforme è molto diffusa nelle
popolazioni
oni dell’Africa tropicale e nel bacino del
Mediterraneo, dove in alcune zone il gene HbS è
presente con una frequenza di circa il 40%.
Il gene HbS è diffuso anche fra gli afroamericani: infatti
1 su 12 è eterozigote per questo gene, mentre è affetto
da anemia
emia falciforme 1 afroamericano su 500; questi
pazienti spesso hanno bisogno di trasfusioni, e poiché il
gruppo sanguigno degli afroamericani è leggermente

27
diverso dalle altre popolazioni, a causa della presenza di alcuni antigeni particolari, i donatori devono essere
anch’essi afroamericani.
Nei soggetti eterozigoti circa l’1% degli eritrociti presenta la conformazione a falce; gli eterozigoti però
risultano generalmente asintomatici, poiché l’HbA impedisce la polimerizzazione dell’HbS.

La diagnosi di anemia falciforme, o semplicemente l’individuazione dei portatori, si fa analizzando le

sequenze del DNA, ma un po’ di tempo fa si effettuava analizzando l’elettroforesi dell’emoglobina, che
poteva presentare uno di questi diversi quadri:

→ malato omozigote adulto

→ sano adulto
→ sano adulto
→ portatore eterozigote adulto
→ portatore eterozigote bambino o adulto
→ sano bambino o adulto
→ portatore eterozigote bambino o adulto.

(A HbA ; F HbF, emoglobina fetale ; S HbS, emoglobina

Sickle-cells ; C controllo di P.M. noto).
Se prelevando un campione di sangue separiamo l’Hb e effettuiamo
una corsa elettroforetica in un campo elettroforetico a un pH pari a 8.4, l’emoglobina si sposterà in virtù del
suo peso molecolare e della sua carica; chiaramente se cambiamo un glutammato in una valina, il punto
isoelettrico della proteina cambierà, e quindi anche la carica a questa concentrazione di pH cambierà,
pertanto l’HbS migrerà in modo differente rispetto all’HbA.
In alcuni pazienti vi è inoltre una permanenza di HbF, in quanto in alcune cellule non è stato effettuato lo
switch γ-β; queste emazie in cui persiste l’HbF sono molto più stabili di quelle che presentano l’HbS, infatti
non vengono lisate, e vengono iper-rappresentate rispetto agli eritrociti con le catene β.

Nell’anemia falciforme, l’emolisi intravasale generalmente è molto scarsa; pertanto in genere non si ha
emoglobinuria, poiché solo una piccola percentuale di globuli rossi vanno incontro ad emolisi intravasale;
generalmente si tratta di eritrociti vecchi, anche se pure i globuli rossi giovani possono andare incontro ad
emolisi intravasale in seguito alla formazione dei corpi tattoidi, però l’emolisi intravasale è limitata mentre
prevale quella extravasale a livello splenico.

Talassemie
Le talassemie sono associate sia a una diminuita emivita dei globuli rossi (anemia di tipo emolitico) che a un
difetto della produzione dei globuli rossi (anemia da deficit di produzione).
La talassemia è conosciuta anche con il nome di anemia mediterranea; in realtà per anemia mediterranea ci
si riferisce essenzialmente alla β-talassemia, la quale è presente soprattutto nel bacino mediterraneo, mentre
le α-talassemie, che sono le più frequenti, si trovano soprattutto nel Sud-Est asiatico.
Le talassemie sono patologie sono dovute alla diminuzione o alla mancanza della produzione
dell’emoglobina:
α-talassemie deficit della produzione delle catene α;
β-talassemie deficit della produzione delle catene β.

β-talassemie
Più del 5% della popolazione del bacino del Mediterraneo è portatrice del tratto β-talassemico; questa
patologia è associata a mutazioni a carico della catena β dell’Hb. Dal punto di vista funzionale, queste
mutazioni possono essere distinte in due grosse categorie; questa distinzione non è semplicemente una
distinzione teorica, ma è importante perché ha delle ripercussioni sulla clinica del paziente; le due categorie
sono dette:
β0 mutazioni in cui si ha una completa assenza della sintesi di catena β;
β+ mutazioni in cui c’è una certa sintesi, seppur deficitaria, della catena β.
Le mutazioni che determinano l’una o l’altra condizione sono di tipo differente: per esempio mutazioni a
carico del promotore della β-globina sono di tipo β+, in quanto consentono comunque la trascrizione del
gene e quindi la presenza di una certa quantità di catena β; infatti questo tipo di mutazione abbassa

28
moltissimo la trascrizione del gene, però non l’abolisce completamente: qualche molecola di mRNA, e
quindi qualche molecola di globina β, si forma comunque.
Possiamo poi avere mutazioni a livello dei siti di splicing, che comportano uno splicing alterato della
maggior parte di molecole di mRNA che si trascrivono a partire dal gene della globina β, però alcune
molecole riescono ad avere uno spilicing corretto, e quindi anche in questo caso un po’ di catena β viene
sintetizzata.
Viceversa, in quelle situazioni in cui abbiamo ad esempio l’inserzione di un codone di stop prematuro o di
mutazioni frameshift, la traduzione della β-globina non può aver luogo, e quindi non si formerà una catena
funzionale.
Quindi ricapitolando:
mutazioni dei siti di splicing, che possono generare dei siti ectopici di splicing oppure possono
nascondere dei siti di splicing fisiologici, generalmente sono di tipo β+, in quanto nelle molecole di
mRNA in cui verranno effettuati splicing ectopici o vengono meno splicing fisiologici, chiaramente
non si avrà la traduzione di una globina: generalmente quando questo succede, rapidamente si
incontra un codone di stop oppure si determina lo spostamento della cornice di lettura (frameshift).
Però non tutte le molecole di mRNA subiranno splicing ectopici o non avranno splicing fisiologici;
dunque qualche molecola di mRNA normale si formerà e darà vita a delle globine normali;
anche mutazioni della regione promotrice determinano una talassemia β+; in genere queste
mutazioni alterano i siti di legame per i fattori di trascrizione, riducendone la trascrizione del 75-
80%. Questo significa che l’affinità dei fattori di trascrizione si abbassa rispetto a quella normale, e
che mentre normalmente ad esempio si producono 100 molecole di mRNA, con la mutazione del
promotore ne verranno prodotte solo 20; quindi qualche molecola di mRNA e di β globina verrà
comunque prodotta;
nel caso di mutazioni nonsense e mutazioni frameshift, in cui abbiamo rispettivamente l’inserimento
di un codone di stop prematuro o lo slittamento della cornice di lettura, esse non permetteranno la
traduzione della proteina, in quanto si formerà una proteina monca o aberrante che verrà rapidamente
degradata.
Questa distinzione non è una distinzione puramente didattica, ma è una distinzione importante poiché
determina dei fenotipi differenti nei pazienti; infatti, la condizione fenotipica clinica dei pazienti può essere
molteplice.

Classificazione la classificazione europea delle β-talassemie prevede due tipi di fenotipo in base alla
gravità della patologia:
β-talassemia minor;
β-talassemia maior.
Gli americani distinguono inoltre un
terzo fenotipo, cioè la β-talassemia
intermedia.
I tre fenotipi richiedono attenzioni
cliniche diverse.
La β-talassemia minor è una
condizione di anemia molto lieve, di
tipo ipocromico e microcitico. Il
paziente fondamentalmente non
riesce a produrre sufficienti globuli
rossi, però non ha una anemia
emolitica importante, anzi l’emolisi è
quasi del tutto assente; essa è
associata ad una condizione di
eterozigosi, sia che il gene colpito
abbia una mutazione β+, sia che
abbia una mutazione β0. In genere i
pazienti eterozigoti con una
mutazione β0 stanno leggermente peggio, mentre quelli che hanno una mutazione β+ potrebbero anche non
accorgersi per tutta la loro vita di essere portatori del tratto β-talassemico.

29
Viceversa, le condizioni di omozigosi per il tratto talassemico sono condizioni in cui il paziente ha
un’anemia severa, da meno severa a più severa secondo quest’ordine: β+/ β+, β+/β0 e β0/ β0; queste
condizioni sono considerate come β-talassemia maior. In genere i pazienti che hanno il genotipo β+/β+ e
β+/β0 presentano comunque una certa quantità di HbA, poiché riescono a produrre una piccola quantità di β-
globina, mentre i pazienti omozigoti β0/β0 non possono proprio produrre HbA, e sono sicuramente quelli
affetti da una forma clinica più severa; si tratta di pazienti che spesso necessitano trapianto di midollo.
Nel caso della β-talassemia β0, abbiamo delle forme molto gravi, e questi pazienti normalmente hanno
bisogno di trasfusioni finché non ricevono il trapianto del midollo; i pazienti β+ possono avere bisogno di
trasfusioni oppure non avere bisogno di trasfusioni, ma comunque sono sottoposti a una terapia chelante
poiché hanno un overload di ferro.

Le mutazioni a carico della catena β determinano la β-talassemia; i meccanismi patogenetici della forma
maior sono doppi:
da una parte abbiamo una diminuita produzione di eritrociti, in quanto non si formano degli eritrociti
sufficientemente emoglobinizzati dato che abbiamo carenza o assenza completa della catena β, e
quindi questi eritrociti sono in genere microcitici e ipocromici. I globuli rossi sono quindi di
dimensioni ridotte, contengono poca emoglobina, e inoltre vengono prodotti in quantità ridotta;
vengono prodotti pochi eritrociti in quanto non si produce una sufficiente quantità di HbA (e dunque
i pochi che vengono prodotti sono degli eritrociti scarsamente o non emoglobinizzati), ma anche a
causa della precipitazione delle catene α soprannumerarie, che non possono interagire con le catene
β per formare HbA e polimerizzano in aggregati, determinando la morte dei precursori eritrocitari
nel midollo. Quindi la diminuita produzione di eritrociti è dovuta sia al danno causato dalle catene α
soprannumerarie, sia all’assenza della sintesi di emoglobina dovuta alla mancanza della catena β;
in più, i pochi globuli rossi che riescono ad essere prodotti e messi in circolo hanno una vita media
limitata in quanto si danneggiano rapidamente, dato che anche in questi globuli rossi le catene α
soprannumerarie precipitano e causano danno alla membrana. Osservando lo striscio di un paziente
affetto da β-talassemia maior si notano globuli rossi delle forme più svariate, una condizione nota
come anisopoichilocitosi, e quindi oltre alla eritropoiesi inefficace questi pazienti presentano anche
un’anemia emolitica extravasale, poiché la maggior parte di questi globuli rossi viene eliminata per
sequestro splenico.

Generalmente i pazienti affetti da β-talassemia maior, oltre all’anemia, presentano anche altri sintomi che
sono debilitanti per il paziente; abbiamo anomalie scheletriche dovute alla espansione compensatoria del
midollo dello scheletro assiale in seguito all’eritropoiesi inefficace (formazioni a crew cut, rilevabili tramite
radiografia): in questi pazienti aumenta la produzione di EPO, che induce proliferazione eccessiva dei
precursori eritrocitari, che occupano più spazio e determinano il riassorbimento di parte della matrice ossea.
Anche un altro sintomo è legato all’insufficiente ematopoiesi a livello midollare; infatti a volte nella β-
talassemia maior abbiamo condizioni di anemia così gravi che determinano l’attivazione dell’emopoiesi
extramidollare (a livello di fegato, milza e linfonodi).
Sicuramente però uno dei danni più gravi e che causa sintomi molto importanti è il fatto che aumenta
l’assorbimento di ferro: l’abbassamento della pressione parziale di ossigeno porta ad una inattivazione della
produzione di epdicina, e ciò porta ad un aumento dell’assorbimento del ferro per l’aumento dell’attività del
carrier a livello dell’enterocita; abbiamo quindi un overload di ferro con emocromatosi, una condizione in
cui si ha deposizione di ferro a livello dei tessuti (particolarmente grave quando avviene a livello di cuore e
fegato), che determina danno tissutale.

30
Se abbiamo una riduzione della β-globina,
globina, come nella β-talassemia
talassemia in condizioni sia di eterozigosi sia di
omozigosi, si ha un eccesso di produzione di α-globina; globina; questa tende a formare degli aggregati e a
precipitare, danneggiando la membrana cellulare, già già a livello dell’eritroblasto, cioè del precursore
eritrocitario; ciò determina la morte degli eritroblasti, con eritropoiesi inefficace. A livello del midollo
abbiamo infatti una eritropoiesi inefficace, e questo determina anemia e quindi una espansione del d midollo
con assorbimento dell’osso; pertanto in genere nei pazienti affetti da β-talassemia
talassemia riscontriamo alterazioni
ossee e deformazioni ossee.
La patogenesi dell’anemia però non è data solamente dalla cattiva produzione di globuli rossi, ma anche dal
fatto che le poche cellule eritrocitarie in circolo presentano danni di membrana dovuti agli aggregati dell’α-
dell’
globina, e dunque vanno incontro ad una emolisi extravasale: a livello della milza infatti vengono fagocitate
quelle poche cellule rosse che potrebbero
ebbero avere ancora una certa funzionalità residua, aggravando i sintomi
dell’anemia.
Oltre all’anemia nei pazienti β-talassemici
talassemici abbiamo quindi alterazioni ossee, emopoiesi extramidollare ed
emocromatosi, in quanto l’eritropoiesi inefficace determina un aumento dell’assorbimento di ferro
alimentare, che va a depositarsi a livello di fegato e cuore dove dà danno tissutale; infatti questi pazienti
quasi sempre, oltre alle trasfusioni, necessitano anche di una terapia chelante per il ferro.

31
 assificazione che prevede anche uno stato di β-talassemia
Questa è la classificazione talassemia intermediaIl genotipo della maior è

dato dallo stato di omozigosi, il genotipo della minor è dato da uno stato di eterozigosi; il fenotipo della β-
talassemia è molto variabile, in quanto comunque anche
anche in questo caso di malattia mendeliana così specifica
esistono geni modifiers che possono dare diverse ‘sfumature’ al fenotipo: per esempio, alcuni pazienti con
β+/β++ hanno una talassemia intermedia, mentre altri con lo stesso genotipo β+/β+ hanno una ttalassemia
maior; probabilmente una differenza tra queste due situazioni sta anche nei polimorfismi del gene per la
G6PD, che possono aiutare in modo maggiore o minore il globulo rosso ad affrontare lo stress ossidativo.
Dal punto di vista clinico, il veroo motivo per cui è stata introdotta questa classe intermedia di pazienti è che
questi pazienti presentano una severissima anemia ma non hanno bisogno di trasfusioni di sangue regolari, a
differenza di quelli affetti da talassemia maior, che invece devono sempre
sempre ricevere trasfusione (a meno che
non ricevano un trapianto di midollo). Dal punto di vista genetico chiaramente la differenza è data dalla
possibilità di sintetizzare una buona quota di HbA, una piccola quota di HbA, quasi nessuna molecola di
HbA o dalla
alla completa mancanza di HbA.
Come accade per l’anemia falciforme, spesso si ha un aumento dell’HbF, che nel caso della β-talassemia è
ancora più pronunciata: nell’anemia falciforme HbF aumenta non perché si ha un’espansione delle cellule
staminali in cuii c’è permanenza dell’espressione della catena γ,, ma aumenta in quanto in circolo i globuli
rossi con HbF sopravvivono di più; nel caso della β-talassemia
talassemia maior invece è proprio a livello midollare che
i precursori che non hanno effettuato lo switch tra le catene γ e β hanno un vantaggio selettivo di
sopravvivenza, poiché le catene α possono combinarsi efficacemente con le catene γ, γ e quindi il numero dei
precursori che non hanno effettuato lo switch γ-β aumenta, e aumentano inoltre anche i precursori che
esprimono le catene δ invece che le catene β;; quindi in questi pazienti spesso si ha anche l’aumento di HbA2.
Nel caso della talassemia minor, la produzione di HbA2 e di HbF è invece poco alterata o normale.
I pazienti affetti da talassemia hanno bisogno di
di una consulenza genetica nel caso in cui vogliano avere figli.

La β-talassemia
talassemia è molto frequente nel bacino del mediterraneo, e in particolare è molto frequente nell’isola di
Cipro. Fino a poco tempo fa, nell’isola di Cipro, 1 individuo su 7 era portatoreportatore di β-talassemia;
β inoltre 1
individuo su circa 150 nuovi nati era affetto da β-talassemia
talassemia maior. Da qualche anno però a Cipro non
esistono più bambini che nascono con la β-talassemia,
talassemia, e si è anche ridotto di molto il numero di pazienti
lattia. Prima degli anni ‘60, i pazienti affetti da β-talassemia
portatori della malattia. talassemia erano destinati a morire entro
il quarto anno d’età, soprattutto a causa dell’emocromatosi dovuta a mancanza di terapia chelante;
l’aspettativa di vita dei pazienti con il miglioramento delle cure mediche dopo gli anni ‘60 è però salita fino a
30 anni. Per aumentare l’aspettativa di vita dei pazienti β-talassemici
talassemici maior c’è stato bisogno di un forte
investimento nella spesa pubblica della sanità, e quindi il governo cipriota, molto sensibile alla a questione
economica, ha deciso di intervenire sia politicamente che religiosamente, in collaborazione con la chiesa

32
ortodossa: la popolazione infatti è stata sottoposta ad uno screening obbligatorio da effettuarsi prima di
qualsiasi matrimonio, per rilevare se uno dei due membri della coppia, o magari entrambi, fosse portatore di
β-talassemia. Nel caso in cui due portatori si fossero sposati, qualsiasi gravidanza sorta da questa unione
sarebbe stata soggetta a screening prenatale, e qualora il bambino fosse risultato affetto da β-talassemia
maior veniva suggerito l’aborto; se i genitori invece non acconsentivano, il bambino nasceva al di fuori del
sistema sanitario nazionale; questo può essere considerato un classico esempio di eugenetica.

α-talassemie
Le α-talassemie sono diffuse soprattutto nel Sud-Est asiatico; sono più comuni delle β-talassemia, e
soprattutto sono più gravi, dato che colpiscono non solo l’adulto ma anche il feto e possono determinare
morte intrauterina.
Per ogni locus di geni α-like noi abbiamo due alleli α, quindi in totale in una cellula abbiamo quattro catene
α; il fatto di avere quattro catene α da una parte è un bene, dall’altra però crea dei problemi, in quanto è
proprio il fatto di avere quattro catene α che può favorire la generazione del difetto genetico che determina
l’α-talassemia.
Innanzitutto l’α-talassemia, a differenza della β-talassemia, è generalmente causata non da mutazioni
puntiformi (a carico del promotore, dei siti splicing, nonsense o frameshift), ma da delezioni.
Si configurano quindi varie condizioni:
individui sani che hanno tutti e quattro gli alleli;
individui che hanno 1 allele mancante, cioè un locus è normale e l’altro presenta solo un allele α
(indipendentemente che sia α1 o α2); quest’individuo è un portatore silente, che rimarrà asintomatico
e non sarà a conoscenza del suo stato di portatore (a meno che casualmente non effettui un test
genetico che individui la mancanza dell’allele α);
individui che hanno 2 alleli mancanti, sia che manchino uno su un locus e uno sull’altro locus α
(compound heterozygosity), sia che manchino sullo stesso locus; questi individui hanno il tratto α-
talassemico con anemia lieve, di solito microcitica;
individui che hanno 3 alleli mancanti: questo quadro è molto severo, simile a quello della β-
talassemia maior, con severa anemia emolitica e necessità di trasfusioni. Si ha la formazione di
un’emoglobina atipica, HbH, costituita da quattro catena beta (β4); le catene α, a differenza di quelle
β, sono instabili e non riescono a stare in soluzione senza complessarsi con le catene β (pertanto non
si formano tetrameri α4 nella β-talassemia); l’HbH non funziona però in modo adeguato;
individui con 4 alleli mancanti: si ha la produzione di un’emoglobina patologica, l’emoglobina di
Barts, costituita da quattro catene gamma (γ4); il feto non nasce e va incontro ad idrope fetale.
Queste due emoglobine (HbH e Hb-Barts) sono patologiche in quanto legano l’ossigeno, ma non sono in
grado di liberarlo nei tessuti.

Il fatto di avere quattro alleli per le α-globine è sia un bene che un male, in quanto è la fonte dei difetti
genetici che portano alle α-talassemie; infatti la alta omologia che c’è tra α1 e α2 fa sì che nei fenomeni di
ricombinazione omologa ci possa essere un fenomeno di mis-appaiamento, e che invece di appaiare α1 con

33
α1 e α2 con α2, un allele α1 viene combinato con un allele α2 generando un disequilibrio, uno
sbilanciamento genico, per cui si genererà un locus che presenterà tre geni α e un locus che ne presenterà uno
solo. Il fatto che la perdita dell’allele α nei pazienti affetti da α-talassemia è dovuta ad eventi di
ricombinazione non corretti e non a banali delezioni è testimoniato dal fatto che effettivamente esistono
individui che presentano tre diversi alleli a livello del locus α-like, ad indicare che la genesi di questo tipo di
mutazione è dato dalla presenza di una ricombinazione sbagliata.

Ricapitolando, le condizioni cliniche dei pazienti che presentano delezioni delle catene α sono le seguenti:
abbiamo dei carriers silenti, a cui manca un solo allele; c’è poi una condizione equivalente alla β-talassemia
minor, quando mancano due alleli (o su un solo locus, o uno in ciascuno dei due loci); c’è una condizione
associata all’adulto, detta malattia da HbH, con formazione di tetrameri di β4, in cui c’è una sola catena α
che funziona bene, ed è una malattia che assomiglia alla β-talassemia intermedia o alla maior a seconda del
background del paziente; quando non c’è nessuna catena α abbiamo l’idrope fetale con morte intrauterina del
feto.
La presenza di queste due emoglobine patologiche, β4 e γ4, è patognomica di una α-talassemia;
l’emoglobina β4 è presente nella condizione in cui abbiamo un allele α che funziona e gli altri tre che non
funzionano; β4 è un’emoglobina che non funziona bene perché ha un’alta affinità per l’ossigeno, quindi lo
lega ma non lo cede e dunque non svolge efficacemente il suo ruolo. Inoltre anche le β-globine in parte
precipitano come fanno le catene α nelle β-talessemie, e ciò dà origine anche ad anemia emolitica.
L’emoglobina di Barts (γ4) viene trovata nei feti dei pazienti che abortiscono in caso di idrope fetale, e si
può trovare a pochi giorni dalla nascita anche nei bambini che hanno un solo allele α ancora funzionante,
prima che avvenga lo switch γ-β.
Un paziente affetto da α-talassemie mostra anomalie scheletriche, ematopoiesi extramidollare e eccesso di
ferro.

Emoglobinuria parossistica notturna

L’emoglobinuria parossistica notturna (PNH) è una patologia che comporta un’anemia esclusivamente di
tipo emolitico; la caratteristica interessante di questa malattia è che, mentre la maggior parte delle anemie
emolitiche studiate sono legate a difetti genetici congeniti, nel caso della PNH abbiamo anche qui un difetto
genetico, ma esso è acquisito, cioè si genera a livello delle cellule somatiche.

Il paziente presenta un caratteristico quadro clinico: nelle prime ore del mattino le urine appaiono molto
scure, e il colore di queste urine va schiarendosi durante la giornata; questo significa che la crisi emolitica è
associata soprattutto alle ore notturne, e che l’emolisi è intravasale, poiché si verifica il passaggio dell’Hb
nelle urine (da qui la denominazione di emoglobinuria parossistica notturna).

34
L’emoglobinuria parossistica notturna è dovuta a mutazioni
somatiche, non germinali, di un gene (PIGA) che codifica per
un enzima necessario per la sintesi dell’ancora GPI; tale ancora
è fondamentale per inserire alcune proteine a livello della
membrana plasmatica: queste proteine, che non sono proteine
integrali di membrana, possiedono generalmente un peptide
segnale che ne determina l’indirizzamento al RER e
l’escrezione al di fuori della cellula, ma mancano di un tratto
proteico transmembrana; esse però vengono comunque inserite
sulla membrana plasmatica attraverso una coda di fostatidil-
inositolo: il fosfatidil-inositolo è infatti inserito all’interno del
bilayer fosfolipidico; esso poi presenta una piccola coda di
glicani, che è legata alle proteine attraverso un meccanismo di
N-glicosilazione. L’ancora GPI è un modo non completamente
stabile di legare le proteine; infatti in alcuni casi queste
proteine possono essere sia secrete all’esterno della cellula, sia
ancorate alla membrana, a seconda se viene attaccata o meno
quest’ancora GPI.
Moltissime proteine sono GPI-linked, ossia legate alla
membrana attraverso un’ancora GPI, e nel globulo rosso in
particolare alcune di queste proteine con ancora GPI sono
molto importanti, in quanto sono degli inibitori della cascata
del complemento, come CD55, C8BP e CD59. CD55 previene
l’assemblaggio del complesso C3bBb, che costituisce la C3-
convertasi della via alternativa del complemento, e accelera il
disassemblaggio della convertasi già formata; CD59 invece
previene la polimerizzazione della componente C9, e dunque
inibisce la formazione del MAC.
I globuli rossi sono cellule che rimangono in circolo per 120 giorni circa, e sono continuamente sotto
l’attacco del complemento; essi però sono dotati sulla loro membrana di molecole, come ad esempio CD55 o
CD59, che sono markers di membrana, ma soprattutto sono delle proteine in grado di bloccare la cascata del
complemento, e quindi di proteggere i globuli rossi dall’attacco da parte del complemento stesso.

I pazienti che presentano questa patologia sono pazienti che hanno ‘selezionato’ i precursori eritrocitari che
danno vita a dei globuli rossi che mancano di CD55 e CD59; possiamo infatti analizzare il sangue di pazienti
affetti da PNH e confrontarli con quello di pazienti normali, attraverso la citofluorimetria a flusso (FACS).
La FACS è una tecnica molto utilizzata in ematologia, che consiste nel prendere cellule ematiche e tipizzarle
attraverso l’utilizzo di markers specifici: si utilizzano degli anticorpi rivolti contro questi markers di
membrana e legati a dei coloranti fluorescenti; il campione poi, dopo esser stato fatto reagire con questi
anticorpi fluorescenti, viene fatto attraversare in una macchina chiamata citofluorimetro, proprio perché è in
grado di misurare la fluorescenza delle cellule, facendole passare singolarmente una ad una dentro un
capillare e rilevandone la fluorescenza.
Se prendiamo i globuli rossi e utilizziamo due anticorpi che hanno due coloranti fluorescenti differenti, ad
esempio uno verde e uno rosso, possiamo andare a rilevare sulle cellule ematiche quante avranno la
fluorescenza verde (associata al 1° marker) o la fluorescenza rossa (2° marker), oppure entrambe: questa
tecnica è tipica dell’ematologia, per caratterizzare il sangue dei pazienti.
Tornando all’analisi dei soggetti con PNH, se noi dunque prendiamo il sangue di pazienti affetti da PNH e di
individui normali, e lo trattiamo con anticorpi anti-CD55 e anti-CD59, possiamo osservare quante cellule
ematiche hanno un marker e quante cellule hanno l’altro.
In un soggetto normale, le cellule risultano positive se analizzate con anticorpi fluorescenti contro CD55 e
CD59; per considerare una cellula positiva per un marker dobbiamo però ricordare che le cellule possiedono
una fluorescenza di base, e quindi determinare un valore di fluorescenza al di sopra del quale le cellule
analizzate vengono considerate positive; in realtà non si tratta di discriminare semplicemente la presenza o
meno di un determinato marcatore, ma bisogna considerare che la fluorescenza aumenta all’aumentare del
numero di molecole di quel marker che stiamo studiando.

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In un individuo normale (A) il sangue sottoposto a FACS ci dirà che globuli rossi esprimono sia CD55 che
CD59; invece il sangue di individuo affetti da PNH (B) sarà costituito da un grande numero di globuli rossi
che non esprimono CD55 e CD59, poiché sono cellule che hanno mutato il gene che serve per la sintesi
dell’ancora GPI.

Potrebbe apparire strano il fatto che questi pazienti selezionano questo particolare clone eritrocitario
incapace di sintetizzare
tetizzare l’ancora GPI; infatti si ritiene che durante la proliferazione del precursore dei globuli
rossi, ad un certo punto muti il gene PIGA che serve per la sintesi di quest’ancora, e che questo clone
acquisisca un vantaggio selettivo rispetto alle altre
altr cellule progenitrici.

Patogenesi in un soggetto normale, i globuli rossi presentano due markers di membrana, CD55 e CD59,
rilevabili tramite FACS; queste proteine sono fondamentali in quanto inibiscono l’attivazione del
complemento sulla membrana eritrocitaria,
trocitaria, inattivando la C3 convertasi (che converte C3 in C3b, il quale si
lega alla membrana del globulo rosso, opsonizzandolo) e la formazione del MAC; grazie a queste proteine il
globulo rosso riesce normalmente a resistere per 120 giorni all’attacco del complemento, costituito da fattori
solubili che si trovano nel sangue.
Nei pazienti con PNH esiste una grossa componente di globuli rossi che non presenta CD55 e CD59, in
quanto i precursori eritrocitari di questi individui non sono in grado di produrre
produrre la coda GPI che serve per
ancorare CD55 e CD59 alla membrana: non sono dunque mutati i geni di CD55 e CD59, ma è la coda GPI
che serve ad ancorare queste proteine alla membrana a presentare un difetto e a non venire più sintetizzata, a
causa delle mutazioni del gene PIGA.
PIGA. Quindi questi globuli rossi oltre a non avere CD55 e CD59, non
avranno neanche nessun’altra proteina GPI-linked;
GPI linked; tuttavia il fatto che siano deficitari in particolare per
queste due è particolarmente grave, perché quando C3 si lega alla alla membrana CD55 e CD59 non saranno in
grado di bloccare l’attivazione della C3 convertasi, quindi della C5 convertasi che convertirà C5 in C5b, e si
avrà la formazione del MAC, che determina la formazione di fori sulla membrana e lisi del globulo rosso,
conn rilascio di eme nel sangue, che poi è
escreta nelle urine determinandone il
colore scuro.
Le urine scure vengono generalmente
prodotte soltanto di mattina, mentre
durante il giorno tendono invece a
schiarirsi, in quanto questo fenomeno
emolitico avviene soprattutto durante le
ore notturne, a causa dell’abbassamento
della temperatura e del pH, che facilita la
conversione di C5 in C5b e la formazione
del MAC, e quindi l’attacco del
complemento alle emazie avviene in particolare di notte e si avrà un’emoglobinuria
un’emoglobinuria notturna.

Terapia negli ultimi anni sono stati sviluppati anticorpi monoclonali a scopo terapeutico per poter curare
malattie di diverso tipo, e tra questi sono stati identificati anticorpi monoclonali contro il C5, in grado di
legare il C5 e di inibire la conversione in C5b
C5b e la successiva formazione del MAC. Questi anticorpi vengono
utilizzati per molte patologie in cui c’è un abnorme attivazione del complemento, e sicuramente un loro
utilizzo può essere utile nella PNH, in quanto quello che succede in questa malattia è proprio
p l’attivazione
patologica del complemento contro i globuli rossi. Infatti se al paziente con PNH somministriamo
quest’anticorpo anti-C5,
C5, chiamato Eculizumab,, effettivamente i pazienti non hanno più l’emoglobinuria
parossistica notturna, e al loro risveglio
veglio le loro urine sono di colore normale (giallo).
Essi però continuano ad essere affetti da anemia, poiché la presenza di C3b sulla membrana, favorita
dall’assenza di CD55 e CD59 che normalmente bloccano l’eccessiva produzione di C3b, determina
l’opsonizzazione
nizzazione del globulo rosso, e quindi quello che si verifica è che il globulo rosso non è più lisato a
causa della formazione del MAC sulla membrana, ma esso viene riconosciuto dai macrofagi splenici e da
essi fagocitato; l’emolisi dunque avviene comunque,
comunque, ma non è più intravasale associata ad emoglobinuria,
bensì extravasale; quindi il trattamento per questi pazienti prevede, oltre all’anticorpo monoclonale contro il
C5, anche la splenectomia.

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Infine aggiungiamo qualche informazione sul meccanismo patogenetico per cui si seleziona quel clone di
globuli rossi che non esprime più l’ancora GPI.
Una delle ipotesi, che non è stata ancora formalmente dimostrata come vera, è che di fatto l’emoglobinuria
parossistica notturna è una malattia autoimmune, o almeno sia associata ad una patologia autoimmune;
l’automminità è rivolta probabilmente nei confronti di proteine GPI-linked, quindi verso un antigene non ben
specificato, legato alla membrana tramite una coda GPI. Questo significa che i precursori eritrocitari che
sono in grado di generare proteine legate con code glicofosfolipidiche vengono attaccati dalla malattia
autoimmune, dai linfociti T citotossici oppure dagli autoanticorpi, e vengono distrutti; c’è invece un
vantaggio selettivo per quei pochi precursori eritrocitari che hanno subito la mutazione di PIGA.
Questo è il motivo per cui vi è l’espansione proprio di quel clone deficitario per l’ancora GPI, che di fatto è
un clone poco funzionale, ma che viene messo sotto pressione selettiva, e in questo ambiente diviene più
‘fit’, più adatto, e quindi sopravvive e si espande, venendo selezionato favorevolmente rispetto a quei globuli
rossi che hanno invece la capacità di sintetizzare la coda GPI e di esporre sulla loro membrana questo
potenziale marker bersaglio della reazione autoimmune; questi ultimi per tale motivo vengono distrutti.
Le evidenze a favore di questa ipotesi sono due:
1. quando si analizza tramite il citofluorimetro il sangue di soggetti normali, si rileva che quasi la
totalità dei globuli rossi sono positivi per CD55 e CD59, ma una piccolissima minoranza di individui
avrà anche poche cellule che sono negative per CD55 e CD59; questo dimostra che anche nei
soggetti sani esistono dei precursori eritrocitari che mutano il gene PIGA, e che mutazioni a carico di
questo gene sono eventi piuttosto frequenti nella popolazione, però in alcuni individui che
sviluppano la malattia autoimmune questi precursori prendono il sopravvento;
2. la dimostrazione che PNH è associata ad un fenomeno di autoimmunità è che molti pazienti affetti
da essa sviluppano anemia aplastica, una malattia autoimmune proprio a carico delle cellule
staminali del midollo.
Quindi, il fatto che l’evoluzione naturale della PNH sia verso una patologia autoimmune, o meglio che essa
si associ ad una patologia autoimmune, suggerisce che la patogenesi della PNH e dell’anemia aplastica sia la
stessa, e sia dunque basata sull’autoimmunità.

Anemie da diminuita produzione di globuli rossi

Le anemie da diminuita produzione di globuli rossi sono le anemie più frequenti.

Tra le anemie da diminuita produzione, distinguiamo:
anemie da deficit di maturazione:
anemia megaloblastica da carenza di vitamina B12 o acido folico;
anemia sideropenica;
anemia da infiammazione cronica.
anemie da deficit di proliferazione:
anemia aplastica.

Anemia megaloblastica da deficit di vitamina B12 o acido folico

La vitamina B12 e l’acido folico sono due oligoelementi cruciali per l’ematopoiesi, perché servono
soprattutto a sintetizzare nucleotidi e amminoacidi; poiché i globuli rossi necessitano di un grande numero di
divisioni cellulari, la deficienza di vitamina B12 e acido folico porta come primo sintomo l’anemia; l’anemia
produce una straordinaria spinta eritrocitaria (midollo ipertrofico), ma l’eritropoiesi è inefficace; altri sintomi
legati alla carenza di questi due oligoelementi possono essere presenti in altri tessuti, oltre che in quello
ematopoietico.
Generalmente quello che succede è che si ha soprattutto un difetto della sintesi del DNA, in quanto sia
l’acido folico che i folati sono fondamentali per sintesi dei nucleotidi; questo significa che durante il
processo maturativo i globuli rossi andranno incontro ad un minor numero di divisioni cellulari; quindi alla
fine del processo maturativo essi avranno dimensioni più grandi rispetto a quelle dei globuli rossi normali
(anemia megaloblastica); pertanto l’ematocrito, ma soprattutto il volume corpuscolare medio (MCV) sarà
aumentato, mentre emoglobina sarà invece diminuita. Il difetto del metabolismo del DNA è evidente
soprattutto nei tessuti in attiva proliferazione; si verifica un blocco maturativo dei precursori degli eritrociti,
che hanno la cromatina meno condensata.
Generalmente la sintesi proteica non è colpita eccessivamente, sebbene sia la vitamina B12 che l’acido folico
servano per la sintesi della metionina a partire dall’omocisteina; infatti il deficit di vitamina B12 e acido

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folico determina omocisteinuria e aumento dell’omocisteinemia. Quest’ultima è una condizione di
predisposizione allo sviluppo di placche aterosclerotiche; quindi la carenza di vitamina B12 e acido folico
può anche causare ictus ed infarto del miocardio.
Altri effetti legati a questa carenza sono un aumento dell’emolisi, ma anche deficit neurologici, poiché questi
due oligoelementi servono anche per funzioni neuronali specifiche.

Cause dell’anemia megaloblastica

deficit di vitamina B12:
o è spesso associato alla dieta vegetariana; questo perché la vitamina B12 è sintetizzata dai
microrganismi, e quindi viene assunta attraverso le carni e i prodotti di origine animale, non
attraverso la frutta e la verdura. Quindi i soggetti sottoposti a diete vegetariane o vegane
hanno forti carenze di vitamina B12 oltre a carenze di ferro, perché il ferro eminico è
assorbito meglio, mentre il ferro contenuto nella verdura e nella frutta non viene ben
assorbito;
o nel caso della gastrite atrofica, in cui si verifica la riduzione della produzione di fattore
intrinseco, la vitamina B12 viene assorbita non più con un meccanismo attivo, ma con un
meccanismo passivo, che è molto meno efficiente, e quindi si va incontro a deficit di questo
oligoelemento;
o in generale, le malattie dell’ileo (malassorbimento, morbo di Crohn, sprue tropicale,
infezioni batteriche) provocano deficit di assorbimento di vitamina B12;
o infine esiste una condizione genetica in cui si ha un deficit congenito di transcobalamina,
proteina che veicola la vitamina B12 nel sangue, che quindi non può essere trasportata ai
tessuti periferici;
deficit di acido folico:
o diete povere di frutta e verdura, in quanto l’acido folico viene assorbito soprattutto da questi
alimenti;
o ridotto assorbimento generale;
o aumento del fabbisogno, come ad esempio in gravidanza; il deficit di acido folico e di
vitamina B12 in gravidanza causa un’aumentata incidenza di spina bifida, ossia una mancata
chiusura del tubo neurale. Infatti ormai per le donne gravide viene eseguito un trattamento
preventivo nei primi sei mesi di gravidanza tramite una somministrazione di compresse di
acido folico e vitamina B12;
o infine un’altra causa è l’utilizzo di alcuni specifici chemioterapici, come il methotrexate, che
viene utilizzato nella terapia di varie leucemie e che è un inibitore della diidrofolato
reduttasi.

Quadro clinico dal punto di vista clinico, ma soprattutto biochimico, l’anemia da deficit di vitamina B12 o
acido folico è rara; in questa anemia, si verifica un aumento del volume medio dei globuli rossi, ed è l’unico
caso di anemia in cui si verifica un aumento di volume degli eritrociti. Abbiamo poi perdita di peso, glossite
e cheilite (infiammazione cutanea al labbro) in quanto si ha deficit, anch’esso proliferativo, a carico delle
mucose del cavo orale; i pazienti mostrano ittero, in quanto questi megaloblasti aumentati di volume spesso
vanno incontro ad emolisi intravasale e quindi generano ittero; inoltre si può associare ad altre patologie,
come complicazioni durante la gestazione (difetti della chiusura del tubo neurale), oppure complicanze
dovute all’aumentata omocisteinemia, che predispone ad aterosclerosi, infarto del miocardio ed ictus
cerebrale.

Anemia sideropenica
L’anemia sideropenica è un’anemia molto frequente, soprattutto negli individui di sesso femminile, anche se
è presente anche nei maschi. Se si osserva la distribuzione del ferro nel nostro organismo, possiamo
distinguere due compartimenti fondamentali in cui esso è localizzato: uno costituito dalla ferritina ed
emosiderina, localizzato principalmente a livello del fegato e che svolge una funzione di ‘storage’, vale a
dire di deposito del ferro, e un secondo compartimento costituito dal ferro legato al gruppo eme, contenuto
quasi totalmente negli eritrociti; il rapporto tra ferro non eminico e ferro eminico è di circa 1:2 - 1:3.
La valutazione della quantità di ferro emonico e non eminico sono valori che possono essere richiesti se si
pensa che il paziente abbia una carenza di ferro; alcuni parametri in particolare ci fanno distinguere la
situazione clinica in cui si trova il paziente.

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Un paziente, per quanto riguarda lo stato delle riserve di ferro del proprio organismo, può trovarsi in una di
queste quattro condizioni:
condizione di normalità, con livelli di ferro normali;
bilancio di ferro negativo, in cui inizia ad esserci carenza di ferro; essa avviene prima a livello del
compartimento di deposito e poi a carico del ferro legato ai globuli rossi. Quindi tali pazienti stanno
bene, apparentemente non hanno alcun problema, ma stanno per entrare in sideropenia o meglio già
vi sono, soltanto che essa non è sintomatica;
pazienti in cui inizia ad esserci un’eritropoiesi inefficiente per mancanza di ferro e che presentano
una minima anemia, in quanto hanno esaurito completamente le ‘scorte’ di Fe e hanno iniziato ad
intaccare il Fe del compartimento eritroide. È difficile rilevare l’anemia in questi soggetti, anche se
essa si manifesta facilmente in particolari condizioni, quali ad esempio la febbre, in quanto mancano
le riserve di Fe;
infine pazienti in cui si ha francamente una condizione di anemia, dovuta all’assenza di Fe.

Per distinguere le quattro categorie, esistono numerose indagini che possono essere eseguite in modo da
comprendere e distinguere quale sia la ‘condizione di salute’ del compartimento del Fe nel nostro organismo.
In generale le varie indagini sono:
il dosaggio del deposito di ferro nel midollo;
la ferritina sierica;
la saturazione della transferrina (TIBC: Total Iron Binding Capacity);
il ferro sierico (SI: Sierum Iron);
la percentuale di saturazione dell’emoglobina;
la presenza di sideroblasti a livello del midollo;
la quantità di protoporfirina presente nei globuli rossi, che aumenta se il Fe è deficitario, mentre
normalmente se ne rileva poca poiché è quasi tutta complessata con il Fe;
la morfologia dei globuli rossi.

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Di fatto almeno tre di queste indagini o condizioni sono cruciali; se si sospetta carenza di Fe non bisogna
chiedere soltanto il dosaggio della sideremia (cioè la concentrazione di Fe nel sangue), ma anche il dosaggio
della ferritina sierica e della saturazione della transferrina.
transferrina
Notiamo che quando si comincia ad intaccare intaccare i depositi di ferro, mentre la sideremia rimane
fondamentalmente uguale, la quantità di ferritina sierica e successivamente la saturazione della transferrina
cominciano ad alterarsi; questo è importante, in quanto in un paziente del genere possiamo prevenireprev
l’eritropoiesi inefficace da mancanza di ferro e l’anemia da essa derivata iniziando una terapia di
supplemento di Fe. Quindi prima ancora che i livelli di Fe ematico scendano, si può già capire con questi due
valori se il paziente sta in qualche modo
modo andando in carenza di ferro, anche se poi ovviamente bisogna
approfondire per capire il motivo per il quale sta andando in carenza di ferro.

All’inizio di un’eritropoiesi inefficace da sideropenia si ha uno striscio di sangue ancora normale, un

emocromo anch’esso normale e il paziente non è ancora anemico, ma andrà facilmente incontro ad anemia
poiché è andato in carenza massiccia di Fe, non avendo più riserve; quindi se questo paziente deve produrre
un’aumentata quota di globuli rossi per compensare un fenomeno che altera l’emostasi, non è in grado di
produrli in quanto è deficitario di Fe, e andrà quindi facilmente incontro ad anemia.
La differenza tra la condizione di eritropoiesi sideropenica inefficiente e la condizione di anemia
sideropenica è la comparsa
mparsa di globuli rossi microcitici e ipocromici, proprio per la carenza di produzione di

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emoglobina; invece la differenza tra bilancio di Fe negativo e l’eritropoiesi inefficiente da deficit di ferro, è
che in quest’ultima condizione comincia ad esserci anche una diminuzione della sideremia.
Quindi si possono distinguere vari casi di depauperamento delle riserve di ferro in un paziente; ad esempio,
se il paziente presenta alterazioni soltanto della ferritina sierica e della saturazione della transferrina, ma ha
una sideremia normale, ciò vuol dire che soltanto il compartimento di deposito è stato intaccato; viceversa se
diminuisce anche la sideremia, ci troviamo in una condizione di eritropoiesi inefficiente da deficit di ferro, e
bisogna subito fornire ferro al paziente, in modo da ripristinare le scorte di questo elemento.
È importante precisare che il ferro ematico è quello legato ai globuli rossi, ossia è dato dal compartimento
eritroide e, prima che subisca una riduzione, vengono per primi consumati i ‘depositi’ di Fe.

Cause l’anemia sideropenica è l’anemia più frequente; essa è causata da svariate condizioni, legate all’età
e al sesso:
nel periodo neonatale, l’anemia sideropenica è dovuta a:
regime latteo prolungato (il latte non è un alimento particolarmente ricco di Fe);
nascita prematura;
presenza di emorragie neonatali;
carenza di Fe nella madre;
nell’adolescenza spesso si verifica anemia sideropenica in seguito ad un aumento del fabbisogno e
della richiesta di Fe, dovuto all’aumentata velocità di crescita e soprattutto all’aumento del volume
dei muscoli (e quindi all’aumento della mioglobina);
nell’adulto le cause principali sono diverse nei due sessi. In particolare, nel sesso femminile
l’anemia sideropenica è generalmente legata ad un ciclo mestruale abbondante; bisogna tener conto
che circa il 40% delle donne in età fertile ha un bilancio negativo di ferro, anche se non
necessariamente un’anemia, però se questo bilancio negativo non viene compensato molte di esse
sviluppano poi successivamente l’anemia.
Inoltre vi sono alcuni stili di vita che favoriscono la comparsa di anemia sideropenica, come la dieta
vegetariana, in cui si verifica una carenza di apporto di Fe; in tali individui è pertanto importante monitorare
lo ‘stato di salute’ delle riserve di ferro, e agire laddove esse si mostrino carenti.
Una delle cause più frequenti di anemia sideropenica nell’adulto è il sanguinamento cronico, che spesso è
indice di alcune specifiche patologie generalmente del tratto gastro-enterico, quali ulcere gastriche, ulcere
duodenali, malattie neoplastiche e varici del tratto gastro-intestinale.

Fisiopatologia 15/03/13 Carlomagno

EMOSTASI

L’emostasi è l’arresto di una emorragia, che si può verificare spontaneamente col meccanismo della
coagulazione; è il risultato di un insieme di processi, cellulari e biochimici, ben regolati che hanno due
diverse funzioni: mantenere il sangue allo stato liquido nei vasi normali e indurre la formazione del coagulo
emostatico in presenza di danno vascolare.
L’emostasi dunque avviene in caso di danno alla parete dei vasi, e il suo scopo è quello di impedire la
fuoriuscita di sangue; essa svolge un ruolo molto importante, in quanto emorragie acute possono mettere a
serio repentaglio la vita dei pazienti.

Tappe dell’emostasi
L’emostasi è costituita da tre momenti principali:
• fase vascolare vasococostrizione;
• fase piastrinica formazione del tappo piastrinico;
• fase coagulativa formazione del coagulo di fibrina.
La formazione del tappo piastrinico consente l’attivazione della cascata della coagulazione e la formazione
del coagulo; chiaramente è molto importante che il coagulo si localizzi solo ed esclusivamente dove si è
creato il danno vasale. Successivamente l’attivazione della coagulazione innesca di per sé anche l’attivazione
della fibrinolisi (fase fibrinolitica), determinando il blocco della propagazione del coagulo e la risoluzione
del coagulo una volta che è avvenuta la riparazione del tessuto.
Nelle tappe principali dell’emostasi, come primo evento abbiamo la vasocostrizione, che serve non solo a
ridurre il diametro del vaso e quindi diminuire il flusso attraverso il vaso, ma determina anche un’alterazione

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del flusso, il quale presenta una velocità ridotta, e questo fa sì che le piastrine, che viaggiano come tutti gli
elementi corpuscolati al centro del vaso (sebbene siano quelle che viaggiano più vicine all’endotelio),
possano entrare in contatto con l’endotelio stesso marginalizzazione delle piastrine.
Abbiamo quindi la formazione del trombo piastrinico, la quale avviene mediante una serie di steps:
adesione delle piastrine capacità delle piastrine di legarsi al sottoendotelio esposto in seguito al
danno endoteliale;
attivazione funzionale delle piastrine, grazie all’interazione col fattore di von Willebrand (vWF), che
a sua volta lega il collagene esposto;
cambiamento di forma da forma discoide a una forma irregolarmente sferica, con pseudopodi;
degranulazione piastrinica, con rilascio di ADP e trombossano A2, che reclutano altre piastrine per la
formazione del primo tappo emostatico, il coagulo bianco; questo tappo è detto bianco in quanto è
formato solo da piastrine, e non ci sono reticoli di fibrina in cui sono imbrigliati i globuli rossi;
aggregazione piastrinica adesione fra piastrine attivate.
Il rilascio dei granuli delle piastrine permette l’attivazione della cascata coagulativa. La cascata della
coagulazione può essere attivata tramite due vie, la via intrinseca e quella estrinseca; la via intrinseca inizia
quando il sangue viene a contatto con superfici cariche negativamente, come accade in seguito a danno
endoteliale per esposizione della membrana basale e del collagene; quella estrinseca è invece attivata dal
tissue factor (TF), fattore tissutale. Entrambe queste vie convergono nella via comune nella coagulazione,
che porta alla formazione della fibrina a partire dal fibrinogeno, per azione della proteasi trombina; il
coagulo a questo punto diventa rosso, in quanto nel momento in cui la fibrina polimerizza, vengono
intrappolate anche cellule ematiche, quali globuli rossi e addirittura leucociti.
Ricoperta la porzione del vaso che ha subito danno all’endotelio, il processo coagulativo dopo aver svolto la
sua funzione deve poi risolversi (fase fibrinolitica), e questo avviene attraverso la produzione di una serie di
sostanze da parte dell’endotelio, quali ad esempio l’attivatore del plasminogeno, che converte il
plasminogeno in plasmina, o la trombomodulina, che blocca la cascata della coagulazione; la plasmina è il
principale agente fibrinolitico, che agisce risolvendo il reticolo di fibrina.

Ricapitolando le fasi della formazione del trombo bianco, abbiamo:

- l’adesione delle piastrine all’endotelio avviene mediante il fattore di von Willebrand, che lega da una
parte le molecole di collagene esposte dall’endotelio danneggiato, e dall’altra le piastrine stesse. Il
fattore di von Willebrand si lega a queste ultime mediante un recettore esposto sulla membrana
piastrinica, chiamato recettore piastrinico GpIb;
- degranulazione l’attivazione delle piastrine (mediante il legame al vWF, e altre interazione
molecolari) e cambiamenti conformazionali del citoscheletro determinano degranulazione delle
piastrine, che secernono ADP e trombossano A2. Le piastrine espongono la fosfatidil-serina, che
serve a legare il calcio ed è cruciale in quasi tutte le tappe della coagulazione, in quanto molte di esse
per svolgersi devono avere luogo su superfici negative (come la membrana dei trombociti che
espongono fosfatidil-serina);
- con la liberazione dell’ADP e del trombossano A2 avviene l’aggregazione piastrinica, favorita da
queste due molecole e anche da altre, quali la trombina (che stimola la contrazione insieme ai PAR e
all’ADP); si forma dunque un vero e proprio tappo piastrinico, definito coagulo bianco. Importante è
anche il recettore GpIIb-GpIIIa presente sulla membrana piastrinica, che lega il fibrinogeno e fa da
ponte tra una piastrina e l’altra; questo recettore è importante in quanto stabilizza il trombo.
Quindi GpIb permette l’adesione delle piastrine alla parete danneggiata, mentre GpIIb-GpIIIa permette
l’adesione tra di loro.
Deficit di vWF causano difetti di adesione piastrinica, mentre deficit del recettore GpIIa-GpIIIb causano
difetti dell’aggregazione piastrinica, e entrambi determinano una diatesi emorragica; parliamo di malattie
trombocitopatiche, in quanto le piastrine sono incapaci di svolgere il proprio compito.

Ruolo dell’endotelio
L’endotelio ha un’azione dicotomica nei confronti della coagulazione, nel senso che in situazioni fisiologiche
esso deve impedire la formazione del trombo, e quindi ha funzione anti-trombotica, mentre esso stesso,
quando danneggiato, promuove la coagulazione; ci sono diversi fattori che possono spostare l’equilibrio
verso una delle due condizioni.

Normalmente, in situazioni in cui si ha assenza di danno epiteliale, ci sono una serie di fattori che

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impediscono l’attivazione impropria della cascata coagulativa (fattori antitrombociti), quali:
molecole simili all’eparina, che si legano all’anti-trombina 3 e inattivano la trombina;
la trombina può essere inattivata anche da un’altra molecola, la trombomodulina; la
trombomodulina, legando la trombina, ha una doppia azione anticoagulante, in quanto da una parte
blocca questo enzima che converte il fibrinogeno in fibrina, dall’altra attiva una proteasi, la proteina
C ematica, che degrada alcuni fattori della coagulazione;
abbiamo il blocco del fattore tissutale attraverso l’inibitore del pathway del fattore tissutale; questo
inibitore blocca il complesso tra tissue factor e il fattore VII, cruciale per l’attivazione della via
estrinseca;
le cellule endoteliali, oltre ad impedire l’attivazione della cascata coagulativa (attività anti-
coagulante), impediscono anche l’aggregazione aspecifica delle piastrine (attività anti-aggregante).
Infatti esse producono 3 fondamentali fattori anti-aggreganti, che competono con i fattori pro-
aggreganti che inducono l’aggregazione delle piastrine; questi fattori anti-aggreganti sono la
prostaglandina I2 (prostaciclina), l’NO e l’adenosina difosfatasi; quest’ultimo enzima inibisce
l’attività dell’ADP (un fattore pro-aggregante) idrolizzandolo;
inoltre, mediante la produzione dell’attivatore del plasminogeno, l’endotelio promuove l’attivazione
della cascata fibrinolitica.
Dunque i fattori antitrombotici agiscono a vari livelli, sia nella formazione del tappo bianco, del tappo di
fibrina che nella risoluzione di eventuali trombi che si sono formati in modo improprio.
Le cellule endoteliali infatti hanno un’azione sia anti-aggregante che anti-coagulante:
anti-aggreganti: prostaciclina e ossido nitrico (NO) impediscono l’adesione e la vasocostrizione ;
l’adenosina difosfatasi degrada l’ADP;
anti-coagulanti: le molecole eparin-like attivano l’antitrombina III; la trombomodulina lega la
trombina e la converte in un fattore anticoagulante, attivando la proteina C, che agisce insieme al suo
cofattore (la proteina S) inattivando il fattore Va e VIIIa; inibitore del pathway del fattore tissutale
(TFPI).

La situazione è completamente capovolta nel caso in cui avvenga danno all’endotelio, in quanto in questo
caso l’endotelio favorisce l’attivazione della cascata coagulativa, tramite fattori pro-trombotici.
È l’endotelio stesso infatti a sintetizzare il fattore di Von Willebrand, importante in entrambe le vie della
coagulazione; il vWF è il principale fattore che interagisce con le piastrine (che lo legano tramite la
glicoproteina GpIb) per concorrere al riparo del danno endoteliale, ma è anche importante in quanto lega il
fattore VIII, coinvolto in questo caso nell’attivazione della cascata intrinseca. L’endotelio danneggiato
espone il collagene dello stroma sottostante, ed è proprio il collagene sottoendoteliale a cui si lega il vWF per
mediare l’adesione delle piastrine al sito di danno endoteliale.
L’endotelio inoltre produce il tissue factor, che è il principale attivatore della via estrinseca.
Dunque, è l’endotelio stesso a promuovere la formazione del trombo in caso di danno endoteliale.

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Piastrinopoiesi
Le piastrine originano da precursori midollari che prendono il nome di megacariociti,
megacariociti i quali derivano a loro
volta da un precursore comune che si differenzia successivamente nella linea linea eritroide e nella linea
trombopoietica; i megacariociti sono cellule molto grandi, mononucleate, da cui si staccano veri e propri
frammenti di citoplasma che contengono granuli.
Anche le piastrine come i globuli rossi sono anucleate, e la loro emivita è di circa 6--10 giorni. La mancanza
di nucleo e l’impossibilità di trascrivere nuove proteine è cruciale, ed è da tenere presente ad esempio
quando si somministrano dei farmaci antiinfiammatori non steroidei, che inibiscono la cicloossigenasi
(COX): questi hanno infatti un’azione antitrombotica, in quanto interrompono la produzione di trombossano
da parte delle piastrine. Se la COX piastrinica è inibita irreversibilmente (come accade in caso di acetilazione
mediata dall’aspirina), le piastrine non saranno più
più in grado di sintetizzare nuovi enzimi COX funzionanti, e
questi ultimi saranno presenti solo sulle piastrine di nuova produzione.

Azione dei FANS i farmaci FANS hanno in genere un’azione anticoagulante; infatti i pazienti affetti da
angina pectoris, o che addirittura hanno subito un’ischemia del miocardio, assumono in maniera preventiva
l’aspirina, in quanto questo farmaco impedisce alle piastrine il rilascio di trombossano, e dunque
l’attivazione della cascata di coagulazione.
Contemporaneamente però l’enzima che viene inibito dall’aspirina, vale a dire la COX, è necessario anche
alla sintesi di prostaciclina,, un importante fattore antiaggregante; quindi l’azione dei FANS potrebbe essere
annullata, poiché da una parte impediscono la formazione di un fattore pro-aggregante
pro aggregante (il trombossano), ma
dall’altra inibiscono la produzione di un fattore anti-coagulante
anti coagulante (la prostaciclina). L’azione anticoagulante
anticoagulan
risulta però maggiore, in quanto mentre la prostaciclina è prodotta anche da cellule endoteliali, che sono
cellule dotate di nucleo e in grado di neosintetizzare proteine, i trombossani sono prodotti esclusivamente
dalle piastrine.
Infatti l’azione dell’aspirina
l’aspirina è irreversibile, e il legame di questo farmaco con la COX modifica
covalentemente tramite acetilazione questo enzima; la piastrina pertanto non sarà più in grado di produrre
trombossani. Viceversa, la cellula endoteliale sarà in grado di
risintetizzare
etizzare COX, e quindi l’azione finale dell’aspirina risulterà
anticoagulante piuttosto che procoagulante.

Osservando una piastrina al microscopio elettronico, si nota che

essa possiede diversi tipi di granuli:
granuli α,, che contengono fibrinogeno e fattori della

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 coagulazione;
granuli δ, che presentano fattori pro-aggreganti e che promuovono la vasocostrizione;
granuli λ, che contengono enzimi idrolitici ed enzimi per la dissoluzione del coagulo.

Cascata della coagulazione

La cascata della coagulazione può essere attivata tramite due vie, quella intrinseca e quella estrinseca. Dal
punto di vista fisiologico, il pathway più importante è quello estrinseco, attivato dal tissue factor, o
tromboplastina; il pathway intrinseco ha anch’esso una sua importanza, in quanto amplifica l’azione del
pathway estrinseco.
Nella via intrinseca della coagulazione, il fattore di Hageman (fattore XII) interagisce con superfici cariche
negativamente (collagene, membrana basale, eparina, pelle, ecc.), così come fa anche il chininogeno ad alto
peso molecolare (HMWK), che si posiziona vicino al fattore XII; sulla superficie non adesiva di HMWK
sono legati il fattore XI e la precallicreina, che così vengono presentati al fattore XII. Tutte queste quattro
componenti formano lo SPAC (sistema plasmatico attivabile dal contatto FXII, HMWK, precallicreina,
FXI); fino a questo momento tutte e quattro le componenti dello SPAC sono in forma inattiva. Si ritiene che
quando lo zimogeno FXII si lega al sottoendotelio, avvenga la sua attivazione a FXIIa a livello della zona di
danno endoteliale, con meccanismo ancora ignoto; indipendentemente dall’evento scatenante iniziale, il
fattore XII è attivato dalla callicreina che si forma nella zona della lesione a partire dalla precallicreina. La
precallicreina viene attivata dal FXIIa a callicreina attiva, la quale a propria volta è in grado di attivare altre
molecole di FXII e così via, amplificando l’attivazione del sistema.
Il fattore XI funge da substrato del FXIIa, diventando FXIa; il FXIa attiva il fattore IX, che insieme al fattore
VIII prosegue la cascata coagulativa andando ad attivare il FX.
Nella via estrinseca il fattore VII si complessa con il fattore tissutale, attivando il fattore X; il fattore tissutale
è inoltre in grado di promuovere l’attivazione del fattore IX (che poi a sua volta media l’attivazione del FX),
attuando un crosstalk e potenziando la via intrinseca della coagulazione. Infatti gli inibitori del tissue factor,
prodotti dall’endotelio non danneggiato, bloccano proprio queste due reazioni, che sono reazioni cruciali per
il compimento del processo coagulativo.
Il fattore X è il crocevia sia del pathway intrinseco che di quello estrinseco, e dà inizio alla via comune della
coagulazione; una volta attivato a FXa, il fattore X attiva il fattore V, e insieme attivano la trombina (fattore
II); la trombina, una volta attivata, converte il fibrinogeno in fibrina. Dopodiché intervengono anche altri
fattori, come il fattore XIII, che formano dei cross link tra le molecole di fibrina, stabilizzando il trombo e
fornendogli più stabilità.
Nella cascata coagulativa tutti i fattori sono nella forma di proenzimi inattivi, e vengono attivati da tagli
proteasici operati da altri fattori della coagulazione già attivati a monte; parliamo pertanto di cascata, in
quanto queste proteasi si tagliano a vicenda in modo piuttosto sequenziale; il TF invece non è una proteasi,
ma una proteina presente a livello della lesione tissutale.

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Molte delle reazioni della cascataascata coagulativa
devono avvenire in presenza di calcio; la membrana
delle piastrine è pertanto un sito ideale dove far
avvenire queste reazioni, poiché le piastrine
espongono la fosfatidilserina,, che è in grado di
legare il calcio. Spesso inoltre queste reazioni
devono avvenire in prossimità di fosfolipidi,
fosfolipidi e non
libere nel sangue, ed è questo un altro motivo per cui
le piastrine, con la loro mebrana, favoriscono la
coagulazione.
La parete delle piastrine funge da piattaforma per
l’attivazione dei vari proenzimi
roenzimi della coagulazione in

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enzimi proteolitici attivi, grazie non solo alla presenza di questi enzimi sulle piastrine, ma anche alla
presenza del calcio e dei fosfolipidi.
La cascata della coagulazione avviene attraverso una serie di conversioni enzimatiche che amplificano il
segnale; le componenti della reazione sono:
- un enzima che ha attività protesica, vale a dire il fattore della coagulazione attivato;
- un substrato, che a sua volta è un fattore della coagulazione sotto forma di proenzima;
- dei cofattori, quali il calcio o i fosfolipidi.
La via estrinseca è quella fisiologicamente più rilevante per l’attivazione della coagulazione in seguito a
danno tissutale in vivo.
Molti fattori della coagulazione sono carbossilati in posizione γ di un acido glutammico; questa
carbossilazione stabilizza l’attività dei fattori della coagulazione. L’enzima che attua questa carbossilazione
ha come coenzima la vitamina K; questo processo è svolto nel fegato. Uno dei veleni ratticidi più potenti è
un competitore della vitamina K, che provoca morte dell’animale in quanto causa emorragie interne e
impossibilità di avere la coagulazione, poiché i fattori della cascata coagulativa sono inattivi, mancando della
carbossilazione dell’acido glutammico in posizione γ.
La trombina è il fattore di coagulazione per eccellenza, in quanto è quello che viene attivato alla fine di ogni
cascata ed è quello che converte il fibrinogeno in fibrina, ma è anche coinvolta nell’attivazione di molti
proenzimi.

Parametri biochimici esistono parametri biochimici che ci informano se ci sono delle alterazioni a carico
delle componenti della cascata della coagulazione, o suggeriscono danno epatico:
PT ( tempo di protrombina) viene misurato come tempo impiegato per la formazione del coagulo,
aggiungendo ad una provetta calcio e tromboplastina (TF). È un misuratore della funzionalità della
via estrinseca;
PTT (tempo di tromboplastina parziale) è un misuratore della funzionalità della via intrinseca
della coagulazione; si osserva il tempo di formazione del coagulo aggiungendo alla provetta il fattore
XII e la Kaolina (che attiva il FXII);
conta delle piastrine normalmente le piastrine si trovano in una concentrazione di 150.000-
400.000 per microlitro; un abbassamento del numero di piastrine raramente può dar luogo a
emorragie spontanee: le piastrine devono infatti scendere ad un valore di circa 20.000 per microlitro
per indurre la formazione emorragie spontanee. Concentrazione di piastrine comprese tra 20.000 e
50.000/µL provocano alterazioni nel processo di emostasi, che porta alla formazioni di petecchie e
porpore cutanee.

Il coagulo viene risolto grazie ad un enzima proteolitico, la plasmina, attivato a partire dal proenzima
plasminogeno ad opera di un enzima che è prodotto dall’endotelio ed è chiamato attivatore del
plasminogeno. Un dato interessante è che l’attivatore del plasminogeno è attivato proprio dalla trombina, la
quale quindi, oltre ad attivare la coagulazione, stimola anche la risoluzione del coagulo. Tuttavia le cellule
endoteliali producono anche un inibitore dell’attivatore del plasminogeno qualora non ci sia stata una
restitutio ad integrum dell’endotelio danneggiato.
La plasmina agisce a livello del coagulo tagliando la fibrina, che viene pertanto degradata, risolvendo il
tappo emostatico. In circolo ci sono delle proteine in grado di bloccare l’azione della plasmina a distanza
dalla sede nella quale è generata, di modo che, qualora ci siano in circolo altri coaguli che non devono essere
risolti, essi possano permanere.

Fisiopatologia dell’emostasi
Quando parliamo di fisiopatologia dell’emostasi, ci riferiamo a due situazioni principali:
condizioni in cui abbiamo una aumentata tendenza alla coagulazione patologie trombotiche;
condizioni in cui invece abbiamo una diatesi emorragica, cioè c’è l’incapacità di attivare in modo
efficiente l’emostasi.
Delle due condizioni, la prima è quella più frequente, ed una delle principali cause di morbilità e mortalità,
soprattutto nei paesi occidentali.

Trombosi

Trombosi indica l’aumentata tendenza ad attivare la cascata della coagulazione in maniera non

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appropriata. La trombosi è un’inopportuna attivazione intravascolare dell’emostasi, che produce una massa
semisolida, il trombo, costituita da cellule e fibrina; il trombo riduce o ostruisce del tutto il flusso ematico
causando stasi ematica, ipossia e ischemia.
La trombosi determina la formazione di coaguli, o trombi, in zone in cui in maniera patologica il trombo
permane e non si risolve, rimane localizzato e dà durante la sua evoluzione tutta una serie di patologie e
complicanze. La formazione del trombo può avvenire sia a livello delle arterie sia a livello delle vene, ed ha
una forma differente nei due casi, causando inoltre alterazioni differenti e ancora evolvendo in maniera
differente.

La trombosi arteriosa è forse quella più grave; generalmente è una complicanza dell’aterosclerosi, e avviene
soprattutto a carico di particolari distretti: molto frequentemente sono coinvolte le coronarie e le carotidi, e
come esito per l’ostruzione del vaso si può avere rispettivamente infarto del miocardio e ictus cerebrale. In
genere la trombosi arteriosa è legata ad alterazioni di flusso che determina appunto formazione di coaguli, in
particolare nelle coronarie o nel circolo cerebrale.
La trombosi venosa invece è meno grave, ma può avere anch’essa degli esiti negativi, soprattutto in caso di
embolia polmonare; avviene generalmente negli arti inferiori, ed è generalmente causata da stasi. La stasi,
cioè l’assenza o comunque la riduzione del flusso ematico, permette infatti la deposizione delle cellule
sull’endotelio, e quindi il contatto tra le piastrine e l’endotelio, favorendo l’attivazione della coagulazione.

Triade di Virchow
La trombosi, cioè la tendenza patologica a formare trombi nel letto vascolare, è data essenzialmente da tre
stati alterati, individuati dal medico tedesco Virchow, un anatomopatologo vissuto nel XIX secolo; questi tre
stati costutiscono la cosiddetta triade di Virchow.
La trombosi è infatti uno condizione che si instaura quando vi è:
• danno endoteliale, ad esempio in seguito a condizioni patologiche che danneggiano l’endotelio;
• flusso ematico anormale;
• stato di iper-coagulabilità.
Il danno endoteliale di per sé è una condizione a cui siamo in grado di reagire fisiologicamente, ma se
avviene in un individuo con un anormale flusso ematico e con uno stato di iper-coagulabilità, questo danno
endoteliale può dare vita alla trombosi: si forma il coagulo, ma esso non si risolve e si forma una lesione
della parete del vaso.

Danno endoteliale è particolarmente grave quando avviene nelle camere cardiache e nelle arterie, poiché
l’alto flusso a volte impedisce la formazione del coagulo.
La perdita delle cellule endoteliali induce l’esposizione della matrice extracellulare, attivando la cascata della
coagulazione, con adesione delle piastrine, rilascio di tromboplastina e deplezione di prostaciclina e
attivatore del plasminogeno. Il danno endoteliale però non deve essere necessariamente un danno da perdita
di cellule endoteliali, poiché in alcuni casi possiamo avere delle alterazioni funzionali dell’endotelio, e
quindi il danno è un danno funzionale e non da alterazione della continuità della parete endoteliale.
L’endotelio infatti è cruciale nell’innesco della cascata della coagulazione, ma è importante anche
nell’inibizione di essa quando la coagulazione non deve avvenire; in alcuni casi però ci può essere uno
squilibrio tra fattori pro- e anti-coagulanti a favore dei primi, e ciò può causare formazione di trombi: ad
esempio, se vi è una produzione aumentata di trombina, non compensata dalla produzione da parte
dell’endotelio delle molecole che inibiscono l’azione della trombina (quali l’antitrombina III e la
Trombomodulina), in quanto l’endotelio non è in grado di produrre in misura adeguate le molecole
anticoagulanti, abbiamo di fronte un endotelio che promuove la formazione di trombi patologici.
Le cause che possono generare danno endoteliale sono molteplici:
- infezioni (liberazione di enzimi e radicali superossidi da parte dei leucociti, attivazione del
complemento da parte di endotossine, danni diretti);
- traumi esterni o interni da aumentato flusso ematico;
- sostanze tossiche o farmaci;
- reazioni di tipo autoimmunitario anticorpi anti-endotelio o immunocomplessi

Alterazioni del flusso ematico è importante che il flusso ematico sia stabile per evitare la coagulazione.
Normalmente il flusso ematico è laminare, le piastrine viaggiano al centro del vaso e non entrano in contatto
con l’endotelio; viceversa la turbolenza può causare danno endoteliale o comunque alterazioni dell’endotelio,

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ma anche zone di stasi ematica, che contribuiscono soprattutto alla trombosi venosa.
In caso di turbolenza le piastrine vengono a contatto con l’endotelio, e anche nel caso di stasi ematica, cioè in
assenza di flusso, le piastrine tendono a depositarsi sul fondo del vaso; inoltre il flusso è importante, perché
consente il cosiddetto ‘wash-out’, cioè la diluizione dei fattori della coagulazione: qualora questo non vi sia,
è più facile per i fattori della coagulazione attivarsi e rimanere attivi.
Situazioni cliniche che causano trombosi mediante stasi e turbolenza sono:
- placche aterosclerotiche;
- aneurismi;
- infarti del miocardio;
- stenosi mitralica;
- condizione di iperviscosità del sangue; si può verificare ad esempio nella policitemia primaria,
neoplasia che coinvolge la linea rossa e determina un aumento del numero di globuli rossi. Anche
l’abuso di EPO aumenta la viscosità del sangue, in quanto aumenta la produzione di eritrociti;
- anemia falciforme.

Iper-coagulabilità (trombofilia) alterazione dei pathways della coagulazione che predispongono trombosi.
È generalmente distinta in primaria (genetica) e secondaria (dovuta ad esempio alla somministrazione di
anticoagulanti, come l’eparina).

Mutazioni genetiche che inducono uno stato di iper-coagulabilità

• mutazione di Leiden condizione piuttosto frequente nella popolazione caucasica (2%); si tratta di
una mutazione del fattore V (Q506R), ed è detta mutazione di Leiden perché fu scoperta per la prima
volta in questa città olandese. Questa mutazione impedisce al fattore V di essere inattivato dalla
proteina C; la proteina C viene attivata dalla trombomodulina, complessata con la trombina, e va a
tagliare il fattore V e il fattore VII. Questa mutazione, in cui si ha la sostituzione della glutammina in
posizione 506 con l’arginina, induce la resistenza del fattore V alla degradazione, e quindi questi
pazienti tendono a coagulare più facilmente perché hanno livelli più elevati di fattore V. Fino al 25-
30% dei pazienti con una trombosi venosa profonda od un’embolia polmonare hanno questo
polimorfismo;
• polimorfismo del gene della protrombina un polimorfismo al 3’ non tradotto del gene della
protrombina determina una maggiore stabilità del trascritto di mRNA stesso, e quindi un aumento dei
livelli di protrombina (in quanto viene tradotta più proteina); i soggetto con questo polimorfismo
hanno un rischio tre volte maggiore di andare incontro a trombosi venosa rispetto alla popolazione
normale;

• aumento dei livelli di omocisteina in genere alti livelli di omocisteina nel sangue promuovono la
trombosi, in quanto questa tende a promuovere la formazione legami tioesterici di molte proteine, tra
cui il fibrinogeno e la fibrina. L’omocisteina si può accumulare in caso di deficit di folati; quindi i
pazienti che presentano deficit di folati hanno: anemia megaloblastica, maggior rischio di partorire
figli con difetti della chiusura del tubo neurale e possono anche andare incontro a trombosi. Altri casi
di iperomocisteinemia possono essere dovuti a deficit enzimatico della cistatione sintasi o del 5,10-
metilen-H4-folato-reduttasi: in questi ultimi casi, abbiamo una sintomatologia molto grave e
precoce;
• casi più rari sono i deficit genetici che determinano mancanza di molecole anticoagulanti, come la
proteina C, la proteina S, l’antitrombina III. Questi casi sono piuttosto lievi, e i soggetti con questi
difetti genetici conducono una vita normale, anche se bisogna cercare di evitare i fattori di rischio.

Cause secondarie di ipercoagulabilità

• trombocitopenia indotta da eparina (HIT) dovuta alla somministrazione di eparina e alla
induzione di anticorpi che riconoscono l’eparina sulla superficie delle piastrine, inducendo una
massiva attivazione e aggregazione con consumo (trompocitopenia) e danno epiteliale, contribuendo
a generare uno stato protrombotico (anche con poche piastrine ed in presenza di eparina, un
anticoagulante).
L’eparina viene ad esempio somministrata prima degli interventi chirurgici, a scopo precauzionale
nei pazienti a rischio di trombosi (al posto dell’aspirina, in quanto gli effetti dell’eparina vengono
smaltiti molto più velocemente di quanto non accada con l’aspirina) o in soggetti con fratture, per

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 evitare la formazione di trombi; paradossalmente però in alcune condizioni l’eparina può indurre uno
stato di iper-coagulabilità. Quindi bisogna monitorare il tempo di coagulabilità PT e PTT, perché si
può verificare questo effetto paradosso, cioè che l’eparina, un fattore anticoagulante, promuova uno
stato di iper-coagulabilità per attivazione delle piastrine, con consumo di piastrine e
trombocitopenia;
• sindrome da anticorpi anti-fosfolipidi un’altra condizione molto frequente è una condizione di
iper-coagulabilità su base autoimmune, determinata dallo sviluppo di anticorpi anti-fosfolipidi; è
caratterizzata da episodi ripetuti di trombosi, aborti, vegetazioni microbiche cardiache,
microangiopatia renale e trombocitopenia.
In effetti i fosfolipidi non sono immunogenici di per sé, ma gli anticorpi sono rivolti contro epitopi
proteici che sono presentati dai fosfolipidi della membrana delle piastrine e dell’endotelio; lo
sviluppo di questi anticorpi dà una condizione di iper-coagulabilità in quanto essi causano danno
endoteliale, attivano le piastrine e spesso interagiscono con il dominio catalitico dei fattori di
coagulazione e ne determinano l’attivazione.
La presenza di anticorpi antifosfolipidi che attivano la cascata della coagulazione in maniera
aspecifica può essere primaria, cioè non associata ad altri tipi di patologia autoimmune, oppure
secondaria a malattie autoimmuni, anche piuttosto gravi o sistemiche, come il lupus eritematoso
sistemico (LES), in cui abbiamo un complesso di anticorpi autoimmuni, tra cui quelli anti-
fosfolipidi.

Morfologia del trombo i trombi hanno una forma diversa a seconda che siano arteriosi o venosi. I trombi
possono svilupparsi ovunque e la loro morfologia dipende moltissimo dalla sede ma anche dalla causa della
loro formazione; i trombi arteriosi si sviluppano soprattutto nelle sedi di turbolenza, quelli venosi nelle zone
in cui c’è stasi ematica. I trombi arteriosi crescono in direzione retrograda rispetto al flusso, quelli venosi in
direzione del flusso; la zona di propagazione è labilmente attaccata al trombo e tende a distaccarsi.
Spesso sono presenti le cosiddette strie di Zahn; queste strie, visibili a occhio nudo o al microscopio, sono
costituite da strati alternati (laminazioni) di piastrine compattate con fibrina, che appaiono più chiari, e da
strati più scuri di globuli rossi. La loro presenza indica trombosi in un sito in cui il flusso sanguigno è rapido,
e dunque trombi che si sono formati prima della morte; nelle vene o nelle arterie più piccole, nelle quali il
flusso non è così elevato e costante, esse sono meno evidenziabili. Queste formazioni sono molto importanti
nella patologia forense, in quanto spesso si formano coaguli anche post-mortem per la stasi venosa, e c’è
pertanto bisogno di distinguere un trombo che era presente prima del decesso da un trombo che si è formato
invece dopo il decesso: se presenta le strie di Zahn il trombo è avvenuto quando il soggetto era ancora vivo.

Tipologie del trombo:

trombi arteriosi spesso coinvolgono coronarie, aorta e arterie femorali; sono aderenti alla parete
arteriosa danneggiata (da placca aterosclerotica, vasculite, trauma);
trombi venosi generalmente occlusivi; contengono più globuli rossi; sono localizzati generalmente
nelle vene degli arti inferiori;
coaguli post-mortem non sono adesi alla parete endoteliale. Sono gelatinosi, con un centro rosso
formato da globuli rossi che si depositano per gravità e una capsula giallastra. Presentano linee di
Zahn grossolane o microscopiche.

Destino evolutivo del trombo:

propagazione accumulo di quantità crescenti di piastrine e fibrina fino all’occlusione del vaso;
embolizzazione un trombo si stacca dalla parete del vaso che lo contiene e migra in un altra
regione del circolo, potendo ostruire altri vasi in distretti più importanti. Le più frequenti embolie
venose sono le embolie polmonari, mentre quelle arteriose sono caratteristiche dell’ictus cerebrale e
dell’infarto del miocardio;
dissoluzione rimozione ad opera dell’attività fibrinolitica; generalmente avviene solo nelle prime
fasi della formazione del trombo;
organizzazione e ricanalizzazione fibrosi con ristabilimento del flusso sanguigno attraverso canali
neoformati; si ha crescita all’interno del trombo di cellule endoteliali, fibroblasti e cellule muscolari
lisce; si possono formare capillari all’interno ristabilendo una continuità con il lume vascolare.

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I trombi arteriosi sono generalmente trattati con l’angioplastica. L’angioplastica è una metodica utilizzata in
ambito medico per dilatare un restringimento del lume (stenosi) di un vaso sanguigno, causato nella maggior
parte dei casi dalla presenza di una placca ateromasica.
La dilatazione del vaso viene effettuata per mezzo di uno speciale catetere a palloncino che viene introdotto
mediante la puntura percutanea di un’arteria, portato poi fino al vaso stenotico e successivamente gonfiato in
corrispondenza del restringimento, in modo da ripristinare il normale diametro del vaso e permettere un
incremento del flusso sanguigno. Gli interventi di angioplastica vengono effettuati soprattutto nel caso di
stenosi coronarica.
In seguito all’intervento di angioplastica, può essere anche introdotto uno STENT a livello del vaso occluso;
lo STENT è una struttura metallica cilindrica a maglie che viene introdotta nei vasi sanguigni e viene fatta
espandere fino a che il suo diametro è pari a quello del lume. Vi sono però dei potenziali problemi correlati
all’uso degli STENT vascolari: il più comune è la trombosi dello stesso, cosa che determina un’occlusione
acuta del vaso e ischemia (se si tratta di un vaso arterioso) del tessuto irrorato; in genere però sono eventi rari
e che si presentano nell’immediato o entro le 24 ore successive all'impianto. Infatti il dispositivo viene poi
riendotelizzato, cioè ricoperto da neointima, e l’utilizzo degli antiaggreganti aiuta tale processo; anche la
proliferazione intimale però, se eccessiva, può determinare una complicanza, definita restenosi.
Conseguentemente, la ricerca attuale si focalizza sulla riduzione della crescita di neointima dopo la
collocazione degli STENT; sono stati fatti considerevoli passi avanti per migliorare la metodica, tra questi
l’impiego di materiali più biocompatibili, l’utilizzo di STENT medicati con farmaci antiinfiammatori, di
stent coronarici a rilascio di farmaco, di stent riassorbibili e di stent bioattivi in titanio e ossido nitrico.
Nonostante queste precauzioni, vi può comunque essere trombosi tardiva, anche se questo evento è
scongiurabile con una attenta adesione del paziente alla terapia antiaggregante, che ad oggi deve essere
minimo di un anno, anche se si consiglia di seguirla per 18 mesi.
Questo tipo di trattamento comunque si effettua quando l’occlusione è di un moderato livello; se l’occlusione
cornoarica è massiva o addirittura totale, invece bisogna attuare un intervento di bypass arterioso; questa
tecnica consiste nel trapiantare segmenti arteriosi o venosi di altre zone del corpo alle arterie coronarie, in
modo da bypassare i restringimenti aterosclerotici, e migliorare l’afflusso di sangue al miocardio.

Diatesi emorragica

Condizione esattamente opposta a quella della trombosi è la tendenza al sanguinamento, definita diatesi
emorragica.
Essa può avvenire principalmente per tre condizioni:
disordini causati da anomalie della parete vascolare;
alterazione della funzione delle piastrine;
alterazione della funzione dei fattori della coagulazione.
Le alterazioni delle piastrine possono essere:
piastrinopenie alterazioni quantitative, che determinano riduzione del numero di piastrine;
piastrinopatie alterazioni qualitative, cioè della funzionalità delle piastrine; possono essere dovute
a varie cause, quali ad esempio mutazioni a carico del fattore di von Willebrand o dei recettori delle
piastrine che servono per l’aggregazione e per l’adesione, quali GpIb o GpIIa-GpIIIb.

I disordini causati da alterazione della parete vascolare causano delle particolari emorragie, dette porpore;
per porpora si intende un insieme di malattie avente come caratteristica comune un quadro emorragico a
livello dei tessuti caratterizzato da macchie di dimensioni variabili che non scompaiono alla digito-vitro-
pressione. Osservando la cute dei pazienti che presentano porpora notiamo emorragie subcutanee, di colore
rossastro, puntiformi, che poi per coalescenza dei vari punti emorragici possono formare vere e proprie
macchie; quando invece non c’è coalescenza e queste emorragie rimangono puntiformi, esse vengono dette
petecchie. In genere le porpore sono associate a difetti o della parete vascolare o delle piastrine.
Viceversa il tipo di emorragia provocata da alterazioni della cascata della coagulazione è caratterizzato da
ecchimosi ed ematomi post-traumatici, nonché da sanguinamento prolungato dopo lacerazioni e interventi
chirurgici; per ematoma intendiamo una raccolta di sangue (spesso piuttosto estesa) fuoriuscito dal sistema
circolatorio e localizzata in un tessuto parenchimatoso o in una cavità dell’organismo; gli ematomi sono
molto differenti dalla porpore, che invece sono piccole fuoriuscite di sangue.

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Alterazione della parete vascolare
In genere nei disordini causati da alterazione della parte vascolare possiamo avere porpore, definite porpore
non trombocitopeniche, o petecchie, ma anche dei veri e propri sanguinamenti come epistassi, menorragie,
ematuria e sanguinamento del tratto gastrointestinale.
Le cause dell’alterazione della parete vascolare sono numerose, e generano tutte un danno o comunque una
disfunzione della parete vascolare:
infezioni che determinano danno al letto vascolare (ad esempio la meningite meningococcica);
farmaci che possono causare un danno diretto, ovvero la formazione di immunocomplessi;
sindrome di Ehlers-Danlos, con difetti del collageno che indebolisce le pareti del vaso;
morbo di Cushing, con riduzione del tessuto extravascolare per protein-waste dovuto a
ipercortisolemia;
porpora di Henoch-Schönlein, forma di vasculite caratterizzata da immunocomplessi di IgA,
contraddistinta da porpora, colica addominale, poliartralgie, glomeulonefrite acuta;
amiloidosi perivascolare.

Alterazione delle piastrine

Se il disordine è causato da alterazione delle piastrine, il disordine stesso è distinto in:
porpore trombocitopeniche;
porpore trombocitopatiche.
In queste patologie, come del resto in tutte le patologie da alterata funzione piastrinica o da alterato numero
delle piastrine, PT e PTT sono normali, in quanto nonostante le piastrine siano importanti per attivare la
cascata della coagulazione, la coagulazione in vitro che andiamo a testare con PT e PTT non risulta alterata.

Porpore trombocitopeniche
Cause della diminuzione del numero di piastrine (trombocitopenia):
diminuita produzione aspecifica delle piastrine, come nel caso di anemia aplastica, in alcune
leucemie acute (in cui le porpore spesso sono uno dei primi sintomi, perché il midollo è
completamente invaso dalle cellule leucemiche e non produce più efficacemente piastrine), o per
danno alle piastrine da parte di virus, farmaci, droghe e alcol, etc.
diminuita sopravvivenza delle piastrine:
- per la presenza di autoanticorpi, situazione molto frequente sebbene benigna, in cui
questi anticorpi autoimmuni opsonizzano la parete delle piastrine, che vengono poi
sequestrate a livello splenico;
- da consumo (microangiopoatia trombotica);
- da trauma meccanico;
- trombocitopenia indotta da eparina;
sequestro di piastrine per ipersplenismo, condizione associata ad altre patologie, quali ad esempio le
anemie emolitiche con emolisi extravasale;
una diminuzione delle piastrine, non in numero assoluto, ma in concentrazione, può avvenire nel
caso di trasfusioni; può infatti succedere che le sacche di sangue vengono trattenute per molto
tempo, e poiché l’emivita delle piastrine è bassa (pochi giorni), il sangue che viene trasfuso non
contiene piastrine e diluisce quelle che sono presenti nel paziente.
A volte per un artefatto nel prelievo del campione si può diagnosticare una pseudo-trombocitopenia; si tratta
di un artefatto in vitro dovuto a agglutinazione e precipitazione delle piastrine ad opera di Ig in caso di
diminuzione di calcio nel campione per la presenza di EDTA (sostanza che chela il Ca contenuto nel
campione diminuendone la quantità), e pertanto nel momento in cui le andiamo a contare con
l’emocitometro, le piastrine risultano essere molte di meno di quanto non sia in realtà; di fatto il paziente ha
un numero normale di piastrine, e ciò viene verificato mediante l’analisi striscio di sangue: infatti, quando si
incontra una forte diminuzione di piastrine in un paziente che non presenta diatesi emorragica, si consiglia di
ripetere l’esame per il sospetto di un possibile artefatto di laboratorio.

Porpora trombocitopenia autoimmune (idiopatica) una delle maggiori cause di porpora trombocitopenica
è la presenza di una reazione autoimmune contro antigeni della superficie piastrinica, come ad esempio GpIb
o GpIIb-GpIIIa; questi anticorpi opsonizzano le piastrine, che vengono quindi successivamente riconosciute
dai macrofagi splenici e sequestrate. Questi pazienti vengono generalmente trattati con la splenectomia.
A differenza di quello che accade nelle anemie con aumentata emolisi extravasale, la milza è di dimensioni

52
normali e non aumenta di volume; la patologia si manifesta con piccole petecchie cutanee e tendenza al
sanguinamento per microtraumi.
La produzione di questi anticorpi (come accade anche per gli anticorpi
an anti-fosfolipidi)
fosfolipidi) può essere primaria,
cioè gli autoanticorpi anti-piastrina
piastrina sono gli unici che si producono, oppure secondaria a malattie
autoimmuni ereditarie e sistemiche (come il LES), ma anche alcune infezioni e leucemie possono
promuovere la produzione di questi autoanticorpi.

Porpora trombotica trombocitopenica un’altra

causa di trombocitopenia è la massiccia attivazione
delle piastrine, che in questo modo si consumano; è
caratterizzata da anemia
nemia emolitica, microangiopatica,
trombocitopenia, insufficienza
nsufficienza renale, sintomi
neurologici e febbre.
Questa massiccia attivazione delle piastrine può
avvenire per vari motivi, tra cui deficit (congenito o
mediato da autoanticorpi) della metalloproteasi
ADAMTS13,, la quale degrada il fattore fatto di von
Willebrand; infatti i polimeri del fattore di von
Willebrand inducono aggregazione piastrinica
massiccia, che alla fine risulta in una deplezione delle
piastrine. Al contrario, i normali polimeri del fattore di
von Willebrand sottoposto all’azione
all’azion della proteasi
ADAMTS13 sono più corti, e non sono
sufficientemente lunghi da promuovere l’aggregazione
piastrinica.

Porpore trombocitopatiche
Le porpore trombocitopatiche sono essenzialmente
dovute a mutazioni di fattori che mediano l’adesione e
aggregazione
azione piastrinica; sono generalmente patologie
di tipo ereditario, anche se raramente possono essere
acquisite.
I difetti ereditari possono essere classificati in tre tipi principali:
difetti di adesione;
difetti di aggregazione;
difetti di secrezione (deficit
ficit di secrezione di trombossano A2 e ADP).
Le mutazioni più frequenti sono a carico del fattore di Von Willebrand, del recettore del fattore di Von
Willebrand GpIb e del recettore del fibrinogeno che media l’aggregazione piastrinica GpIIb-GPIIIa.
GpIIb

Porporere trombocitopatiche da difetti acquisiti possono insorgere ad esempio per ingestione di grosse quantità
di aspirina e di altri FANS, in quanto essi inibiscono in maniera irreversibile la cicloossigenasi e la
produzione di trombossano A2, che è un forte agente
ag aggregante.
In alcuni casi poi possiamo avere anche delle tossine batteriche che danneggiano la parete delle piastrine,
come nel caso della sindrome emolitico-uremica
emolitico (HUS),), sindrome in cui, nel 90% dei casi, un’infezione da
E. coli enteroemorragico provoca, tramite la tossina shiga-like,
shiga like, un danno endoteliale (principalmente a
livello del glomerulo) e un’attivazione piastrinica (con successivo consumo); in una minor parte dei d casi la
HUS può essere provocata da alterazioni congenite del complemento o da un’infezione pneumococcica. La
tossina shiga-like
like entra nel sangue e provoca danni all’endotelio vascolare; il danno endoteliale generalizzato
porta all’attivazione delle piastrine.
strine. La tossina shiga-like
shiga inattiva inoltre ADAMTS13,
ADAMTS13 l’enzima di clivaggio
del fattore di von Willebrand, e questa inattivazione enzimatica è anch’essa coinvolta nella generazione della
porpora: una volta che ADAMTS13 viene inattivata dalla tossina, ha inizio l’attivazione piastrinica che è
causa della formazione di microtrombi.
Nel maggio del 2011 c’è stata un’epidemia di HUS associata a piastrinopatia, con decine di malati ed alcuni
casi mortali in Germania; la causa sembra essere dovuta a dei germogli germogli biologici contaminati di alcune
verdure, pur mancando la certezza di dove sia avvenuta la contaminazione degli stessi.

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Alterazione dei fattori della coagulazione
Nei disordini causati da alterazione dei fattori della coagulazione, il sanguinamento è molto
m diverso da quello
che si ha per deficit piastrinico; infatti in genere se la patologia non è eccessivamente grave, il
sanguinamento è legato soprattutto a traumi, con comparsa di ecchimosi e ematomi anche per traumi lievi,
oppure a sanguinamento prolungatongato dopo lacerazioni. Quindi in questi casi è difficile il sanguinamento
spontaneo; generalmente questi deficit inficiano infatti il momento in cui si deve innescare la cascata della
coagulazione, e comportano il fatto che quest’ultima non si innesca sufficientemente
sufficientemente bene; per cui abbiamo
forti emorragie post-traumatiche
traumatiche oppure sanguinamento dopo lacerazioni.

Le tre forme più frequenti di deficit ereditari dei fattori della coagulazione sono:
mutazioni a carico del fattore di von Willebrand;
mutazioni delel fattore VIII emofilia A;
mutazioni del fattore IX emofilia B.
In generale, i deficit ereditari dei vari fattori della coagulazione sono molto simili clinicamente; nel caso
invece di deficit del fattore XII, la patologia è più lieve, poiché esso è situato si proprio all’inizio
dell’attivazione della via di intrinseca, e non coinvolge il pathway estrinseco.
L’emofilia A e l’emofilia B sono entrambe patologie a trasmissione genetica X-linked.
X linked.
Il fattore di von Willebrand funziona legando il fattore VIII; l’emofilia A è data da mutazioni del fattore VIII,
che serve per attivare il fattore X, e quindi raggiungere il punto di congiungimento della via intrinseca e della
via estrinseca ; il fattore IX (il cui deficit provoca emofilia B) è un cofattore del fattore
fattore VIII.
Il fattore di von Willebrand in effetti, oltre a essere legato alla funzionalità piastrinica (favorendone
l’adesione all’endotelio), ha un ruolo anche nella cascata della coagulazione in quanto serve anche a
stabilizzare il fattore VIII, che se non non legato ai polimeri del fattore di von Willebrand viene degradato.
Quindi in assenza di fattore di Von Willebrand abbiamo non solo deficit dell’adesione piastrinica, ma anche
deficit della cascata coagulativa.
Quindi si comprende bene perché le tre patologie
patologie principali, cioè il deficit di vWF, deficit di FVII e FIX,
sono molto simili clinicamente, in quanto questi tre fattori agiscono a livello dello stesso punto della cascata
della coagulazione.

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Esistono anche deficit acquisiti dei fattori della coagulazione; ad esempio, deficit di vitamina K (che funge da
cofattore per la carbossilazione in posizione γ di acidi glutammici dei fattori della coagulazione, reazione che
ne attiva la funzione), determina il fatto che i fattori della coagulazione sono meno efficienti nel promuovere
la coagulazione.
Inoltre possiamo avere deficit dei fattori della coagulazione per loro consumo, situazione che si verifica
generalmente nella CID (coagulazione intravasale disseminata); infine possiamo avere deficit acquisiti dei
fattori della coagulazione per insufficienza epatica: infatti molti dei fattori della coagulazione vengono
sintetizzati dal fegato; per questo motivo sia PT che PTT servono non solo come indici della capacità di
coagulazione, ma anche come indicatori di funzionalità epatica: i pazienti che hanno alterazioni funzionali
epatiche hanno anche alterazioni del PT e del PTT, che possono essere sia aumentati che diminuiti.

Deficit del fattore di von Willebrand si tratta di una condizione molto frequente, presente in circa l’1%
della popolazione. Questa patologia è caratterizzata da una lieve tendenza al sanguinamento spontaneo
(come le epistassi), e diventa invece evidente soprattutto quando abbiamo interventi chirurgici e pratiche
dentistiche; infatti il deficit di vWF, così come accade generalmente per gli altri casi di deficit dei fattori
della coagulazione, tende a presentarsi non tanto con fenomeni di sanguinamento spontaneo, ma comporta la
formazione di grossi ematomi dopo lievi traumi o incapacità di interrompere il sanguinamento dopo
lacerazioni o interventi chirurgici.
I pazienti affetti da deficit di vWB presentano deficit di aggregazione piastrinica sebbene abbiano una conta
piastrinica normale.

Questa patologia è molecolarmente eterogenea, e esistono molte varianti e mutazioni diverse (più di 20) che
causano deficit del fattore di Von Willebrand; funzionalmente possiamo distinguere le mutazioni che
determinano deficit di vWF in almeno due gruppi, molto diversi dal punto di vista molecolare:
un gruppo di mutazioni in cui si ha una diminuzione della quantità del fattore di von Willebrand
circolante:
tipo 1 autosomico dominante, che ha penetranza incompleta e differente espressività;
clinicamente lieve;
tipo 3 autosomico recessivo, livelli molto ridotti di vWF; è una malattia grave;
un gruppo di mutazioni in cui c’è alterazione della funzionalità del fattore di von Willebrand; in
questo caso, andando a dosare le quantità di vWF in questi pazienti, le troveremo normali.
tipo 2A autosomico dominante; livelli normali di vWF, ma con mutazioni puntiformi che
portano ad assemblaggio difettivo (mancanza dei grossi complessi di vWB nel plasma o
aumentata suscettibilità al taglio da parte di ADAMTS13);
Tipo 2B aumento dell’affinità del vWF per le piastrine, responsabile della formazione di
aggregati di piastrine intravascolari; questi vengono rimossi rapidamente, causando modesta
trombocitopenia ciclica;
Tipo 2N incapacità di legare FVIII da parte del vWF.
Tra le forme con riduzione della quantità del vWF, possiamo avere delle forme autosomiche dominanti che si
manifestano già in eterozigosi per aploinsufficienza, che però sono lievi clinicamente; viceversa ci forme
autosomiche recessive in cui la condizione di eterozigote non è tale da determinare la comparsa della
malattia, ma che poi quando il gene è presente in omozigosi abbiamo un fenotipo clinico grave.
Per quanto riguarda le alterazioni qualitative, possiamo avere mutazioni che causano un assemblaggio
difettivo del fattore di von Willebrand, oppure un alterazione che ne aumenta la suscettibilità al taglio da
parte di ADAMTS13; alterazioni della stessa proteasi ADAMTS13 possono causare trombocitopenie per
aggregazione piastrinica, a causa della formazione di grossi polimeri di vWF. Possiamo poi avere mutazioni
che aumentano l’attività delle piastrine, e determinano clearance del fattore di von Willebrand, con
diminuzione della sua quantità non in quanto è prodotto di meno, bensì perché si lega alle piastrine. Infine
possiamo avere mutazioni che causano un incapacità di legare il fattore VIII da parte del vWF: il fattore VIII
viene così degradato facilmente, e si ha tendenza al sanguinamento.

Emofilia A fra tutte le patologie da deficit dei fattori della coagulazione, la più conosciuta è l’emofilia A,
di cui si riteneva fosse affetta la casa reale spagnola e russa, e che la regina Vittoria d’Inghilterra ne fosse
portatrice; nel suo caso la mutazione era comparsa de novo: la regina Vittoria ha poi trasmesso l’allele
malato a due sue figlie, che hanno vissuto normalmente, e a un figlio maschio, Leopoldo, che invece era
malato di emofilia. Le figlie femmine della regina a loro volta hanno trasmesso il gene malato ad altre

55
famiglie, infettando la famiglia reale
reale spagnola ma anche quella russa, mentre quella inglese non ne è stata
colpita, in quanto discende da uno dei figli della regina Vittoria che non aveva ricevuto l’allele malato. In
realtà nel 2009 su Science è apparso un articolo in cui, tramite la valutazione
valutazione dei frammenti organici della
famiglia Romanov e effettuando analisi del DNA, si sostiene che la famiglia reale era invece affetta da
emofilia B, cioè caratterizzata dal deficit del FIX della coagulazione del sangue; l’emofilia B è infatti una
condizione
ne clinicamente indistinguibile dall’emofilia A.

Questa patologia ha una classica trasmissione X-linked;

X linked; in genere le donne che hanno l’allele mutato in
eterozigosi non hanno problemi di coagulazione (tranne in rari casi in cui può esserci una lieve tendenza al
sanguinamento), e ciò perché la presenza dell’allele sano sull’altro cromosoma X compensa la funzione di
quello mutato. Nel 30% dei pazienti che presentano questa malattia, la mutazione compare de novo, cioè in
assenza di una storia familiare.
La malattia si può presentare con vari livelli di gravità, a seconda del grado di deficit del fattore VIII; la
condizione patologica subentra quando la percentuale di attività del fattore VIII è inferiore al 25% circa. Se il
grado di attività del FVIII e inferiore
nferiore all’1%, la malattia è molto grave; se esso è compreso fra il 2-5% 2 del
normale, abbiamo emofilia moderata, mentre se è tra il 5-60% 5 60% parliamo di emofilia lieve. Questa diversa
severità è dovuta al fatto che le mutazioni sono eterogenee (delezioni, inserzioni,inserzioni, mutazioni missense,
mutazioni nonsense), e causano un deficit più o meno grave.
Nell’emofilia A, non ci sono petecchie ma ematomi; inoltre, mentre il PT è normale, il PTT risulta
prolungato; ad essere colpita è dunque la via intrinseca. I pazienti
pazienti sanguinano comunque, anche se si ha la
possibilità di attivare la via estrinseca, in quanto la via intrinseca (nonostante rivesta un ruolo minore rispetto
al pathway estrinseco) è comunque importante per amplificare il segnale dell’emostasi; questo
probabilmente
obabilmente è il motivo per cui i pazienti che hanno deficit dei fattori VIII, IX o di von Willebrand non
hanno un sanguinamento spontaneo, ma nel caso in cui si deve mettere in atto la coagulazione, questo
processo avviene, ma non in maniera massiccia e amplificata
amplificata a sufficienza, in quanto manca l’apporto della
via intrinseca; quindi si formano ematomi estesi oppure abbiamo sanguinamento pronunciato. Un segno
caratteristico dell’emofilia A è il sanguinamento spontaneo nelle zone sottoposte a stress meccanici,
meccani come
all’interno delle cavità articolari (emartrosi
emartrosi).
Generalmente i pazienti con emofilia A in passato venivano trattati con trasfusioni di sangue, anche se adesso
si utilizza la somministrazione di fattore VIII ricombinante; fino a poco tempo fa i soggetti so con questa
patologia, poiché necessitavano trasfusioni ematiche, costituivano una categoria a rischio per l’infezione da
HIV, poiché il sangue non veniva adeguatamente controllato. Sia con le trasfusioni che con la
somministrazione di FVIII, molti pazienti sviluppano però anticorpi contro il fattore VIII, perché non sono
tolleranti verso di esso; infatti, poiché non lo esprimono nel loro timo o midollo, i linfociti che riconoscono
questa proteina non vengono eliminati, e quindi se somministriamo fattore fattore VIII a questi pazienti essi possono
riconoscerlo come un vero e proprio antigene.

Emofilia B clinicamente è identica alla A, ed è inoltre molto simile sia a livello biochimico che per
modalità di trasmissione; infatti anche il gene del fattore IX è localizzato sul cromosoma X, e dunque la
trasmissione è X-linked.

Deficit vitamina K il deficit di vitK comporta

l’incapacità di carbossilare alcuni fattori della
coagulazione, in particolare FVII, FIX e FX;
questa carbossilazione è importante per consentire
co
ai fattori della coagulazione di aderire meglio alle
piastrine e consentire di svolgere al meglio la loro
funzione protesica; infatti questi fattori sono meno
efficaci come proteasi se mancano della
carbossilazione γ in alcuni specifici residui di acido
glutammico. Il deficit di vitK porta pertanto a
diatesi emorragica.
Il deficit di vitK può dipendere da diminuito
apporto con la dieta, o da un deficit di
assorbimento.

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Disordini della coagulazione per insufficienza epatica l’insufficienza epatica
ca può determinare disordini
della coagulazione, non solo nel senso di tendenza al sanguinamento, ma può anche determinare uno stato di
iper-coagulabilità.
Il fegato è infatti un organo centrale per l’emostasi, poiché produce molti fattori pro-
pro e anti-coagulanti:
molecole pro-coagulanti
coagulanti,, come i fattori della coagulazione, ma anche la trombopoietina: quindi
in caso di deficit epatico possiamo avere non solo un’alterazione della coagulazione, ma anche
della funzione piastrinica; inoltre il fegato produce molecole
molecole come l’antiplasmina, che serve ad
evitare che la plasmina digerisca i trombi che si trovano lontano, e in cui magari non si è ancora
rigenerato l’endotelio sottostante;
fattori anti-trombotici,, come ad esempio ADAMTS13; questo fa si che in caso di deficit
de epatico
possiamo avere anche una condizione di aumentata coagulabilità, in quanto diminuisce la
produzione dei fattori anticoagulanti.

Coagulazione intravascolare disseminata (DIC) disordine trombo-emorragico

emorragico acuto, subacuto o cronico
causato da attivazione inappropriata della coagulazione; in genere è una complicanza di diverse patologie. La
DIC causa emorragie per consumo di piastrine e fattori della coagulazione, ipossia e infarti causati dai
numerosi trombi che si vengono a formare.
La coagulazione
zione intravascolare disseminata (CID)) è una gravissima patologia caratterizzata dalla presenza
disseminata di numerosi trombi; i trombi rappresentano il prodotto finale della cascata della coagulazione del
sangue. Nel caso della DIC, l’eccessiva formazione
formazione di trombi finisce col consumare i fattori della
coagulazione, determinando una coagulopatia da consumo caratterizzata da una scarsa tendenza del sangue a
coagulare, e quindi da fenomeni emorragici; peraltro la fibrinolisi iperattiva per sciogliere i numerosi
nume trombi
essa stessa può andare incontro ad esaurimento funzionale, con aggravio della malattia che finisce con
l’essere caratterizzata da episodi emorragici coesistenti con fenomeni trombotici.
I meccanismi principali che causano DIC sono due:due
rilascio di fattori procoagulanti in circolo:
circolo: placenta, PML (leucoencefalopatia multifocale
progressiva), muco secreto da adenocarcinoma, sepsi;
danno endoteliale massivo.

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EMOCROMATOSI

L’emocromatosi descrive una condizione caratterizzata da accumulo di ferro nell’organismo, la maggior

parte del quale si deposita negli organi parenchimatosi come il fegato e il pancreas; il ferro può accumularsi
anche nel cuore, nelle articolazioni o negli organi endocrini.
L’emocromatosi è distinta in:
- emocromatosi primaria è una malattia ereditaria a trasmissione autosomica recessiva, che
comporta un eccessivo assorbimento di ferro;
- emocromatosi secondaria (emosiderosi) accumulo di ferro nei tessuti per assunzione eccessiva di
questo metallo o per altri motivi (come la β-talassemia e le sindromi mielodisplastiche); non è quindi
una malattia genetica, ma una condizione acquisita.

Il ferro totale immagazzinato nell’organismo varia nei soggetti adulti sani da 2 a 6 grammi, di cui 0,5g sono
conservati nel fegato; nell’emocromatosi l’accumulo totale di ferro può superare i 50g, di cui 1/3 circa si
accumula nel fegato.
La malattia è caratterizzata dai seguenti aspetti:
i casi completamente sviluppati mostrano:
o cirrosi micronodulare (in tutti i pazienti);
o diabete mellito (75-80% dei casi);
o pigmentazione cutanea (75-80% dei casi);
l’accumulo di ferro dura tutta la vita, ma i danni causati dal suo eccesso sono lenti e progressivi,
pertanto i primi sintomi compaiono verso la 5°-6° decade di vita;
è predominante nei maschi (5-7:1), con una presentazione clinica lievemente precoce, in parte perché
la fisiologica perdita di sangue nelle donne (mestruazioni, gravidanza) ne ritarda l’accumulo.

Emocromatosi primaria

Patogenesi poiché non esiste una via regolata per l’escrezione del ferro, il suo contenuto totale corporeo è
attentamente controllato dall’assorbimento intestinale; nell’emocromatosi la regolazione dell’assorbimento
intestinale di ferro alimentare è alterata, e ciò porta ad accumulo netto di ferro di circa 0,5-1,0g all’anno. La
malattia si manifesta tipicamente dopo un accumulo di 20g di ferro.
Il ferro sembra avere una tossicità diretta sui tessuti dell’ospite, tramite vari meccanismi:
perossidazione lipidica attraverso le reazioni dei radicali liberi, la cui produzione è catalizzata dal
ferro;
stimolo alla secrezione e deposizione di collagene da parte delle cellule stellate epatiche;
interazione dei radicali liberi (ma anche del ferro stesso) con il DNA, che inducono danno cellulare
letale o predisposizione verso l’epatocarcinoma.

Il principale regolatore dell’assorbimento del ferro è la proteina epcidina, prodotta dal fegato, che è
codificata dal gene HAMP; la trascrizione dell’epcidina viene aumentata dalle citochine infiammatorie e dal
ferro, mentre viene ridotta dalla carenza di ferro, dall’ipossia e dall’eritropoiesi inefficace.
L’epcidina si lega alla ferroportina (FPN), il canale di efflusso cellulare del ferro, provocando
internalizzazione e proteolisi del canale: ciò impedisce il rilascio di ferro da parte delle cellule intestinali e
dei macrofagi, e pertanto l’epcidina abbassa i livelli di ferro nel plasma; al contrario, la carenza di epcidina
determina invece un accumulo eccessivo di questo metallo.
Altre proteine coinvolte nel metabolismo del ferro producono gli stessi effetti regolando i livelli di epcidina;
queste comprendono:
emogiuvelina (HJV) espressa nel fegato, nel cuore e nel muscolo scheletrico; topi KO per questo
gene presentano livelli di epcidina drasticamente ridotti;
recettore della transferrina 2 (TfR2) espresso soprattutto dagli epatociti, dove media
l’assorbimento di ferro legato alla transferrina;
HFE (human hemochromatosis protein).
La mancata espressione dell’epcidina, provocata da mutazioni del gene dell’epcidina, di HJV, TfR2 e HFE
determina emocromatosi: tra queste mutazioni, le mutazioni di HAMP e HJV inducono le forme più gravi
(emocromatosi giovanile), mentre le mutazioni di HFE e TfR2 determinano la classica forma di

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emocromatosi ereditaria nell’adulto. Le mutazioni della ferroportina inducono invece una caratteristica
malattia da accumulo di ferro, che si distingue dall’emocromatosi ereditaria.
I meccanismi precise con i quali HFE, HJV e TfR2 regolano l’epcidina e la ferroportina non sono stati
ancora determinati.

Le alterazioni morfologiche dell’emocromatosi ereditaria sono caratterizzate principalmente da:

deposito di emosiderina principalmente in: fegato, pancreas, miocardio, ipofisi, surrene, tiroide e
paratiroidi, articolazioni e cute;
cirrosi;
fibrosi pancreatica.

Fisiopatologia 06/03/13 Santoro

NEOPLASIE DEL SANGUE

Fisiopatologia del sangue le malattie del sangue rappresentano una collezione di diversi disordini
neoplastici e non neoplastici, che molto spesso possono essere considerate delle malattie molecolari, delle
quali cioè si conosce il gene coinvolto e di conseguenza si interpretano le conseguenze fisiopatologiche, e in
qualche caso si intravedono delle possibilità applicative mediche, diagnostiche o addirittura terapeutiche
basate sulla conoscenza della lesione genica, proteica, biochimica che è responsabile di una malattia
(permettendo l’applicazione di quella che viene chiamata medicina a bersaglio molecolare).

Le leucemie e i linfomi sono delle malattie neoplastiche del compartimento emopoietico che sono
caratterizzate dalla presenza nel sangue e negli organi emopoietici (midollo, e meno frequentemente in altri
tessuti) di cellule neoplastiche di origine emopoietica.
Le leucemie e i linfomi possono essere classificati in due grosse categorie sulla base del diverso meccanismo
di differenziazione delle cellule del sangue. Secondo uno schema semplificato, vi è una cellula staminale
totipotente, che attraverso dei progenitori multipotenti arriva poi a dei progenitori specifici di due linee, che
sono quella linfoide (da cui originano i linfociti T, B e alcune cellule NK) e quella mieloide (da cui originano
gli altri leucociti, gli eritrociti e le piastrine).
La prima grossa suddivisione che facciamo nell’ambito delle leucemie e linfomi è quella che riguarda il
compartimento linfoide e quello mieloide; quindi secondo questo primo livello di classificazione, citologico,
abbiamo:
leucemie mieloidi;
leucemie linfoidi e linfomi.
Un secondo livello di classificazione è più clinico, e si basa sul fatto che le leucemie linfoidi e mieloidi
possono essere ulteriormente classificate in:
leucemie acute;
leucemie croniche.
Per leucemia acuta si intende una malattia veloce, a innesco rapido, rapidamente evolutiva, certe volte
addirittura con un’evoluzione tumultuosa; è pertanto molto grave se non trattata. Per leucemia ‘cronica’
intendiamo invece una malattia lenta, indolente, a evoluzione più lenta e quindi meno aggressiva. Questa
separazione clinica-sintomatologica è supportata da una nozione biologica importante: le leucemie acute
sono caratterizzate da un accumulo di cellule indifferenziate, dette blasti, nel sangue periferico o nel midollo
a seconda delle fasi cliniche e dei vari tipi di leucemie. La maggior parte delle classificazioni oggi considera
il limite del 20% di blasti come cut off al di sopra del quale la malattia è considerata acuta. Viceversa, quella
cronica è una malattia lenta e indolente caratterizzata sostanzialmente da cellule differenziate o abbastanza
differenziate e da un piccolo numero di cellule blastiche (< 20 %).
Combinando le classificazioni avremo:
- leucemia mieloide acuta (AML);
- leucemia mieloide cronica (CML);
- leucemia linfoide acuta (ALL);
- leucemia linfoide cronica (CLL).
La leucemia mieloide cronica fa parte di un gruppo di malattie dette sindromi mieloproliferative.

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Linfomi neoplasie che colpiscono il compartimento emopoietico, in particolare le linee linfocitarie, ma
che si manifestano come neoplasie solide a carico degli organi linfoidi principali, soprattutto i linfonodi,
anziché del sangue.
Leucemie indica che ritroviamo cellule neoplastiche derivate dal compartimento ematopoietico nel
sangue.
Il limite tra leucemie e linfomi è estremamente sottile, e anzi in molti casi è praticamente inesistente: per
esempio, nello stesso paziente la malattia può cominciare nel linfonodo (linfoma) e poi nel corso
dell’evoluzione della malattia la troviamo anche nel sangue (forma mista leucemia/linfoma); viceversa
talvolta troviamo la malattia all’esordio nel sangue (leucemia) e poi a un certo punto si comincia a
manifestare come infiltrazione di queste cellule leucemiche negli organi linfoidi; in particolare il limite tra
leucemia linfoide cronica e linfomi è estremamente sottile. Ci sono però molte malattie diverse, sia nel
gruppo delle leucemie sia nel gruppo dei linfomi, che possono essere inquadrate in maniera netta in una delle
due categorie (la leucemia linfatica acuta nel bambino è una leucemia, il linfoma diffuso a grandi cellule B è
un linfoma, il linfoma follicolare è un linfoma, etc.)
Una forma particolare di malattia neoplastica che interessa questo gruppo è il mieloma multiplo, una
neoplasia che colpisce la fase terminale della maturazione dei linfociti B, cioè le plasmacellule, e quindi si
tratta di una neoplasia plasmacellulare.

Le leucemie acute sono sostenute da lesioni genetiche che vanno a bloccare in qualche modo il meccanismo
di differenziamento delle cellule, determinando quindi l’accumulo di cellule indifferenziate; generalmente
dunque i geni che vengono colpiti sono oncosoppressori coinvolti nel pathway della differenziazione; se
questi oncosoppressori non funzionano più, si ha l’accumulo di cellule indifferenziate.
Invece le leucemie croniche non presentano tanto questo problema differenziativo, ma si presentano
comunque come leucemie con cellule neoplastiche nel sangue; in questo caso però troveremo soprattutto
lesioni molecolari che contribuiranno in particolar modo all’aumento della proliferazione cellulare, spesso
riducendo anche il grado di apoptosi.
Quindi le forme croniche sono generalmente caratterizzate da lesioni che sostengono la proliferazione di quel
particolare tipo cellulare colpito dalla malattia, mentre invece le forme acute, che sono caratterizzate
dall’eccesso di cellule indifferenziate, sono caratterizzate da lesioni molecolari che bloccano il
differenziamento. Ovviamente per avere una malattia neoplastica conclamata non è mai sufficiente una sola
lesione molecolare; soprattutto le forme più aggressive, quelle acute, saranno causate da una cooperazione di
più lesioni molecolari, e in questo caso oltre a quelle che bloccano il differenziamento, c’è anche qualche
lesione che spinge verso la proliferazione.

Leucemia mieloide cronica

La CML è una malattia non frequente: l’incidenza è di circa 1 caso su 100.000 per anno; essa colpisce
soprattutto i soggetti più adulti (50-60 anni), ed è più frequente nei maschi che nelle femmine, con un
rapporto 2:1.

Quadro clinico questa patologia non ha manifestazioni né laboratoristiche né sintomatologiche

particolarmente specifiche, e quindi non è facile farne la diagnosi perché si potrebbe confondere con molte
altre condizioni. I soggetti presentano leucocitosi (fino a 100.000/mm³) non solo nel sangue periferico, ma
anche nel compartimento mieloide e nel midollo; le cellule sono sostanzialmente differenziate o abbastanza
differenziate, e la proporzione di cellule blastiche è bassa (<10 %, e quindi molto inferiore rispetto al cut-
off). Aumentano non solo i neutrofili, ma spesso anche i basofili, gli eosinofili, i monociti, le piastrine: vi è
quindi un’espansione policlonale del compartimento mieloide, in genere a discapito della componente rossa,
e quindi i pazienti possono presentare una modesta anemia. Tutto questo determina un quadro
sintomatologico generale molto poco specifico: non di rado la malattia si scopre per caso, attraverso un
emocromo occasionale che mostra la presenza di molti granulociti in uno striscio di sangue, o perché ad
esempio un soggetto maschio sui 50-60 anni inizia a mostrare gradualmente e in maniera indolente perdita di
peso, astenia, splenomegalia (poiché in qualche modo questi globuli bianchi in eccesso devono essere
distrutti), anemia aplastica da difetto di produzione dei globuli rossi, difetti dell’aggregazione piastrinica e
quindi sanguinamento o tendenza alla trombosi ed eventualmente infarto.

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Storia naturale la malattia ha una caratteristica storia clinica: la maggior parte dei pazienti manifesta la
malattia occasionalmente o sulla base di questi sintomi nella sua fase cronica, CP (chronic phase), che indica
la malattia classica con le caratteristiche sintomatologiche riportate in precedenza (CML chronic phase);
tuttavia, se lasciata alla sua storia naturale, dopo circa 4-5 anni la malattia evolve e dalla fase cronica passa a
una leucemia acuta, detta BP (CML blastic phase): si tratta di una leucemia acuta a tutti gli effetti, con
striscio di sangue o di midollo che rivela la leucemia con cellule blastiche, completamente indifferenziate
con un nucleo enorme, eucromatinico non plurilobato, uno strato sottile di citoplasma con pochi granuli.
Questa leucemia acuta blastica sviluppata dai pazienti affetti da CML se non trattata dopo 4-5 anni, nella
grande maggioranza dei casi (75%) è una AML, ma in qualche caso (25%) è una ALL (soprattutto dei
linfociti B, o B-ALL); ciò significa che la malattia parte a un livello nella via di produzione delle cellule del
sangue che è a monte della biforcazione mieloide-linfoide. A volte si riesce a individuare una fase
intermedia mista che viene definita fase accelerata (AP) che, se lasciata senza cura, passa a una leucemia
acuta.
Questo è un classico esempio di quella che viene definita progressione neoplastica: possiamo immaginare
che la fase cronica sia interessata da lesioni che stimolano la proliferazione cellulare, mentre nella fase acuta
si aggiungono a quelle già esistenti lesioni che ostacolano il differenziamento.

Cromosoma Philadelphia
La mortalità della malattia è stata abbastanza costante fino ai primi anni del 2000, e poi improvvisamente è
crollata; ciò è avvenuto grazie ad una scoperta che ha rivoluzionato la cura di questa malattia, anche se però
quest’ultima deve essere comunque perfezionata in quanto c’è ancora un certo tasso di mortalità per CML,
seppur minore rispetto al passato.
La citogenetista di Chicago Janeth Rowley negli anni ‘70, con un metodo di analisi che oggi sembra
piuttosto rudimentale, ovvero guardando i cromosomi con esami citogenetici (in quanto non era ancora
possibile guardare i singoli geni), scoprì in un paziente di Philadelphia affetto da CML una particolare
traslocazione cromosomica, che adesso sappiamo essere la causa della CML. Questa traslocazione fu
chiamata cromosoma Philadelphia (Ph+), e consiste in una traslocazione reciproca bilanciata tra il braccio
lungo del cromosoma 9 e il braccio lungo del cromosoma 22: il cromosoma 9 si rompe sul braccio lungo, il
cromosoma 22 si rompe anch’esso sul braccio lungo, e i due frammenti telomerici distali dei due cromosomi

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si scambiano; la porzione del cromosoma 22 che si spostava sul 9 è un po’ più lunga e allora il cromosoma 9
si allunga, mentre la porzione di cromosoma 9 che va sul 22 è un pezzo più piccolo, e quindi il cromosoma
22 si accorcia. Quello che fu evidente alla dottoressa Rowley sull’esame della metafase di queste cellule
leucemiche era la presenza di questo strano cromosoma 22, di dimensioni ridotte, che venne chiamato da
questa ricercatrice cromosoma Philadelphia.
Una volta che la dottoressa Rowley ebbe individuato questo particolare meccanismo per la CML, questa
scoperta ha fatto poi aumentare enormemente le conoscenze su queste particolari alterazioni cromosomiche
in altre leucemie e linfomi, ma anche in altre neoplasie. Oggi esistono dei metodi grazie ai quali si può,
tramite delle specifiche sonde fluorescenti, colorare virtualmente al computer ogni singolo cromosoma; ad
esempio, possiamo colorare il cromosoma 9 in bianco e il 22 in violetto, e notare che nei pazienti con CML
un pezzo di cromosoma 22 è andato a finire sul 9, mentre un pezzo più piccolo del 9 si è spostato sul 22,
generando il cromosoma Philadelphia.

Questa alterazione cromosomica che porta alla formazione del

cromosoma Philadelphia è in eterozigosi, cioè un allele è normale
mentre l’altro è malato, e questo tipo di assetto è tipico delle
mutazioni gain of function che colpiscono gli oncogeni.
I geni coinvolti nella traslocazione sono 2:
ABL (da Abelson) sul braccio lungo del cromosoma 9;
BCR (break-point cluster region) sul braccio lungo del
cromosoma 22.
Come conseguenza della traslocazione, una porzione del gene
ABL si sposta sul cromosoma 22, e determina la costruzione di un
gene chimerico di fusione BCR-ABL, dove BCR contribuisce alla
parte 5’ terminale del nuovo gene, mentre ABL contribuisce alla
parte 3’ terminale del nuovo gene chimerico, che è il gene che
determina malattia. Quindi si rompe il gene ABL sul cromosoma
9, si rompe il gene BCR sul cromosoma 22, e sul cromosoma 22 si
realizza questa fusione BCR-ABL, con la parte 5’ terminale del
nuovo gene (ovvero la parte N-terminale della proteina patologica
codificata da BRC-ABL) formata da una porzione di BCR, e con la parte 3’ terminale del nuovo gene (che
corrisponde alla parte C-terminale della proteina patologica) rappresentata da gran parte del gene ABL:
questa proteina BCR-ABL è la causa della CML nella sua fase cronica.
La proteina ABL (Abelson) era codificata da un gene già noto, perché scoperto in uno di quei retrovirus che
sembrava non fossero coinvolti nelle patologie dell’uomo, ma che avevano gli stessi geni che le cellule
tumorali umane mutano nelle neoplasie; il virus contenente ABL era stato chiamato virus di Abelson della
leucemia murina.
La parte attiva della proteina chimerica BCR-ABL è ABL; ABL è una tirosino-chinasi della famiglia delle
tirosino-chinasi citoplasmatiche SRC, e quindi ha una classica struttura modulare formata da:
- SH1 (dominio di omologia a SRC 1), che ha attività tirosino-chinasica;
- SH2, che è un sito d’interazione proteina-proteina che lega residui fosfotirosinici inseriti in contesti
amminoacidici specifici per ogni dominio SH2;
- SH3, un altro dominio d’interazione proteina-proteina che lega sequenze ricche dell’aminoacido
prolina.
Questa struttura è cruciale per capire:
a) come questa proteina quando è deregolata trasforma le cellule;
b) perché nel cromosoma Philadelphia questa traslocazione cromosomica deregola la proteina.
Per quanto riguarda il secondo quesito, bisogna considerare che i domini SH2-SH3 delle proteine della
famiglia SRC sono dei domini di regolazione, e dettano il livello di attività del dominio chinasico, e lo fanno
in quanto governano la conformazione tridimensionale della proteina, e quindi il grado di apertura del
dominio chinasico. Quando la proteina Abelson è normale, ovvero quando non è riarrangiata con BCR, è
intrinsecamente regolata da interazioni proteina-proteina che fanno si che il dominio SH3 riconosca delle
sequenze ricche in prolina presenti nel dominio chinasico, e che il dominio SH2 riconosca delle fosfotirosine
presenti anch’esse nel dominio chinasico: la proteina dunque si chiude su se stessa, e l’attività chinasica è
tenuta sotto controllo perché il dominio chinasico è forzato a stare chiuso da questa interazione a

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‘portafoglio’ che assume la proteina; questa è la modalità di regolazione classica per queste proteine
appartenenti alla famiglia SRC.
La cellula però in certe condizioni induce la proteina ad aprirsi, a svolgere il proprio ruolo di chinasi e a
stimolare la proliferazione cellulare; ad esempio, in condizioni fisiologiche la chinasi può essere attivata
legandosi ad altre fosfotirosine, come quando compare un recettore di membrana attivato che presenta una
fosfotirosina: quest’ultima allora realizza una competizione, e il dominio SH2 può, a seconda delle affinità
relative, preferire questa fosfotirosina (e quindi ABL si apre), oppure la fosfotirosina presente nel proprio
dominio chinasico. Un altro modo per attivare questa chinasi può essere l’azione di una fosfatasi che
idrolizza la fosfotirosina di ABL, ottenendo grossomodo lo stesso risultato, cioè l’apertura di ABL. A
seconda delle proteine di questa famiglia e delle varie condizioni, possono partecipare all’attivazione di esse
uno o più di questi diversi meccanismi.
Nella CML, questa proteina ha un nuovo peptide N-terminale che proviene dal gene BCR, il quale
sostanzialmente è un gene anonimo, di cui non sappiamo ancora se abbia una funzione specifica, e se questa
funzione specifica sia importante; questo peptide, che si fonde a gran parte della proteina ABL (non si ha
infatti una rilevante perdita di sequenze amminoacidiche nella porzione N-terminale di ABL), contiene dei
domini d’interazione proteina-proteina, dei domini di dimerizzazione. Ora le proteine con funzione
chinasica, in particolare le tirosino-chinasi, quando sono forzate a dimerizzare - per motivi conformazionali
allosterici, che sono soprattutto dettati da come si posiziona nella proteina monomerica rispetto alla proteina
dimerica un particolare anello di regolazione che sta nel dominio chinasico, chiamato anello di attivazione o
loop di attivazione -, tendono a cambiare conformazione e ad aprirsi, in questo caso in maniera incontrollata,
e a diventare perennemente attive. Evidentemente è più stabile l’interazione patologica BCR-BCR che tende
ad aprire la chinasi, rispetto alle interazioni fisiologiche SH2-SH3 che tenderebbero a chiudere la chinasi;
questo significa che questa tirosino-chinasi è eccessivamente attiva, con eccesso di trasduzione del segnale,
eccesso di attivazione delle MAP chinasi, eccesso di attivazione della fosfatidilinositolo-3-chinasi, eccesso di
trasmissione di segnali mitogenici.

L’importanza della rilevazione del gene chimerico BCR-ABL e del cromosoma Philadelphia si esplica a vari
livelli; prima di tutto ha consentito di fare una diagnosi più precisa della malattia: questa malattia infatti, per
molti aspetti è abbastanza aspecifica, e non presenta caratteristiche particolari.
Bisogna sottolineare che il cromosoma Philadelphia è presente nel 100% dei soggetti affetti da CML, il che
ne fa un marcatore diagnostico perfetto; gli ematologi degli anni ‘70 ricercavano la presenza di questo
marker guardando i cromosomi al microscopio con colorazione GIEMSA, con metodi poco sensibili rispetto
a quelli attuali, mentre gli ematologi molecolari degli ultimi anni hanno a disposizione numerose tecniche,
per esempio la PCR, per misurare in maniera più sensibile la presenza o meno di questi 2 alleli fusi tra loro,
cioè della presenza del gene chimerico BCR-ABL.
Questo, soprattutto adesso in cui le tecniche di analisi molecolare si sono notevolmente sviluppate, è
diventato uno strumento potentissimo in quanto non solo consente di fare la diagnosi di malattia, ma
permette anche di seguire l’evoluzione clinica della malattia, perché se abbiamo un marcatore molecolare, il
medico può vedere quantitativamente quanto marcatore molecolare c’è, e quindi quanto sia avanzata la
malattia: in uno striscio di sangue in un prelievo midollare, se c’è molto cromosoma Philadelphia o molto
gene chimerico BCR-ABL (più facile da misurare), significa che ci sono molte cellule leucemiche e che la
malattia è avanzata. Inoltre se nel corso della terapia, soprattutto nel corso di terapie più specifiche, il livello
di cromosoma Philadelphia o di prodotto del gene chimerico BCR-ABL crolla, significa che il paziente sta
rispondendo; se però, dopo che il paziente ha risposto e questo gene malato è scomparso dal sangue, ad un
certo punto ricompare il gene malato, ciò significa che anche se non si riesce ancora a osservare le cellule
leucemiche nel sangue, poiché sono poche, probabilmente la malattia sta ripartendo e bisogna intervenire, e
attuare qualche misura terapeutica per cercare di intercettare questo processo.
Ma soprattutto l’importanza della conoscenza del meccanismo molecolare che porta alla CML è stata la
possibilità di poter effettuare una terapia mirata, più precisa e specifica.

Imatinib
La scoperta intorno agli anni ‘70 del cromosoma Philadelphia (Ph+) ha chiarito la base molecolare della
leucemia mieloide cronica, perlomeno nella sua fase cronica, e ha offerto un marcatore diagnostico per
seguire l’evoluzione della malattia.
Osservando l’andamento delle curve di mortalità, si nota che questa scoperta ha anche favorito, seppur non
abbia ancora completamente risolto, il problema terapeutico della malattia. La logica alla base dell’utilizzo

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terapeutico di questa conoscenza adesso appare scontata; si parte dal fatto che la malattia è causata dal
cromosoma Ph+, il quale codifica per BCR-ABL, e che BCR-ABL è una proteina eccessivamente attiva
come conseguenza della dimerizzazione operata dal peptide BCR, e quindi il ragionamento vuole che
malattia sia causata da troppa funzione di BCR-ABL: bisogna dunque provare in qualche modo ad attenuare
questa funzione aumentata. In effetti quello che si è pensato di fare è simile a quanto si effettua anche per
altre proteine della stessa famiglia in generale, ossia chinasi coinvolte in altre neoplasie. Un eccesso di
funzione di BCR-ABL significa un eccesso di attività enzimatica; si è cercato dunque, per contrastare la
malattia almeno in fase cronica, di attenuare, visto che la regolazione fisiologica non ci riesce più,
quest’attività chinasica.
Lo studio della CML ha avuto un’importanza che prescinde dalla malattia stessa (la quale ha peraltro una
modesta incidenza): essa è infatti stata la malattia capostipite (cioè una malattia che ha raggiunto un
traguardo non ancora raggiunto nella stessa misura in altre malattie neoplastiche) ed è un esempio ancora
unico dell’efficacia dell’approccio delle terapie a bersaglio molecolare dei tumori, basate sulla conoscenza
della lesione genetica e rivolte ad un bersaglio mirato.
Buona parte di questi studi si devono a un ematologo clinico statunitense dell’università di Portland, che ha
seguito l’idea che i biochimici e i farmacologi stavano portando avanti, cioè che se delle malattie, ad esempio
di natura neoplastica (anche se il discorso addirittura prescinde dai soli tumori) sono legate a un eccesso di
funzione di una proteina chinasi (in questo caso la proteina BCR-ABL del cromosoma Ph+), si può provare a
tenere sotto controllo questa malattia con dei farmaci adeguati, piccole molecole con buone proprietà
farmacologiche, di farmacocinetica, di distribuzione, addirittura di somministrazione (infatti il farmaco
contro la CML è una pillola che si somministra per via orale) la cui azione sia quella di penetrare nel
dominio chinasico competendo con il substrato indispensabile affinché una chinasi funzioni, cioè l’ATP, il
donatore del gruppo fosfato. Questo farmaco dunque penetra nel dominio chinasico competendo con l’ATP,
e se ci si riesce in modo soddisfacente, la proteina chinasi, che sebbene sia iperfunzionante come
conseguenza del riarrangiamento, privata della possibilità di usare l’ATP viene inattivata (come accade
anche nel caso dell’oncogene B-RAF, anche se ciò è stato dimostrato inizialmente nel caso della CML).
Questo farmaco è una molecola chiamata Imatinib (è conosciuta in realtà con più nomi, anche se questo è il
più comune); esso ricorda la struttura del’ATP, cioè di una purina. Si tratta di una molecola che, come
dimostrato dal dottor Druker, è capace di legare il dominio chinasico di BCR-ABL, competendo con l’ATP e
attenuando la funzione chinasica di ABL nonostante il fatto che essa sia riarrangiata. Druker, che oltre a
effettuare gli esperimenti biochimici in laboratorio, era anche un medico che aveva rapporti con i pazienti, ha
prodotto uno studio clinico che ha portato alla registrazione di questo farmaco come cura di prima linea per
la CML.
Altri ricercatori hanno dimostrato che quello che Druker aveva sospettato sulla base di analisi biochimiche,
quindi di funzionamento dell’enzima, era vero: si è infatti ottenuta la struttura cristallografica a raggi X del
dominio chinasico di ABL in complesso con il farmaco, e si è visto che l’Imatinib lega la tasca di legame
dell’ATP della chinasi ABL, che come tutte le chinasi ha un piccolo lobo N-terminale e un grosso lobo C-
terminale, in mezzo ai quali c’è la tasca dove si realizza la funzione enzimatica, che è controllata dal loop di
attivazione.
Le analisi sullo striscio di sangue di un paziente prima del trattamento rilevavano che esso era pieno di
cellule leucemiche, anche se abbastanza differenziate, mentre dopo il trattamento con il farmaco si ‘puliva’ il
sangue dalle cellule leucemiche, ripristinando uno striscio sostanzialmente normale. La risposta clinica era
entusiasmante, perché la grande maggioranza dei pazienti con CML in fase cronica, trattati con Imatinib,
andava - e lo faceva anche velocemente (in pochi mesi) - in remissione citogenetica completa, cioè non
c’erano più cromosomi Ph+ da misurare in più del 90% dei casi, quindi in una frazione molto ampia di
pazienti.
Questo risultato numericamente era molto migliore rispetto a quanto si ottenesse con le migliori
chemioterapie convenzionali adottate all’epoca per la CML; non solo la risposta era buona in termini di
ottenimento della remissione, cioè di pulizia del sangue dalla presenza del cromosoma Ph+, ma anche in
termini di durata della remissione: infatti i pazienti in remissione erano più di quelli trattati con terapia
convenzionale, ma anche quelli che recidivavano erano in numero inferiore rispetto a quelli trattati con
chemioterapia convenzionale. Dunque questi risultati estremamente buoni hanno portato all’approvazione di
questo trattamento come trattamento di prima linea dei pazienti con la CML.
Questo farmaco ha creato un esempio, e quindi si è provato a trattare con lo stesso approccio tante altre
malattie neoplastiche, qualche volta con successo, ma mai così strepitoso.

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Il farmaco è dunque molto efficace, ma nonostante ciò ci sono comunque dei problemi, che oltre a quelli
clinici, sono anche legati al fatto che questi trattamenti hanno una certa tossicità. In primo luogo, dell’oltre il
90% pazienti che vanno in remissione, non tutti con un esame più approfondito risultano in realtà con
remissione completa. Infatti la proporzione di pazienti in remissione risulta così alta se si misura la frequenza
del cromosoma Ph+, ossia se viene effettuato un esame macroscopico; se però si va ad un livello molecolare
e si cerca di misurare non solo la presenza del cromosoma, ma si prosegue con metodiche più sensibili a
misurare la presenza del gene chimerico, man mano che viene aumentato il potere di risoluzione di ricerca
del cromosoma o del gene mutato, la curva dei soggetti in remissione si abbassa e si scoprono sempre più
pazienti che in realtà non riescono ad ottenere una remissione totale dalla malattia. Ad esempio, se
cerchiamo con tecniche sofisticate, ricercando per esempio l’mRNA della proteina BCR-ABL, anche nei
pazienti che rispondono bene al farmaco, si rileva che una piccola quota di cellule leucemiche che portano il
cromosoma Ph+ rimane comunque nel sangue, e soprattutto nel midollo dei pazienti.
Insomma, il trattamento funziona bene, velocemente, in maniera massiccia, ma non eradica la malattia,
almeno per quello che sappiamo fino ad ora.

Questo farmaco dunque funziona in maniera molto buona, ma ci sono due o tre aspetti problematici.
Il primo è il fatto che il farmaco non eradica la malattia ma lascia comunque pochi alleli, pochi cromosomi,
quindi poche cellule con BCR-ABL nel sangue o nel midollo; ciò significa che qualche cellula leucemica
avrà sviluppato resistenza al trattamento, o significa che qualche cellula leucemica forse è intrinsecamente
resistente al trattamento.
Oggi sappiamo che le cellule staminali leucemiche dei pazienti con CML rispondono molto meno bene al
trattamento che non le cellule leucemiche che troviamo nel sangue; dunque c’è una piccola quota di cellule
leucemiche, le cellule staminali della leucemia, su cui il farmaco funziona meno bene, e questo è il secondo
problema.
Il terzo problema è invece che i pazienti con leucemia mieloide cronica in fase blastica, quindi in cui il
trattamento è effettuato in una fase tardiva, rispondono molto meno bene dei pazienti in fase cronica
all’Imatinib.
Quindi, riassumendo:
1. dopo il trattamento, rimangono cellule leucemiche residue (in qualche paziente in numero maggiore,
in altri in numero minore), e questo può significare che cellule che prima rispondevano non
rispondono più e quindi hanno sviluppato resistenza;
2. la resistenza al trattamento può però anche essere dovuta al fatto che esiste una quota di cellule
leucemiche che risultano insensibili già dall’inizio all’azione del farmaco, e si sospetta fortemente
che si tratti delle cellule staminali della leucemia;
3. il trattamento funziona molto bene in fase cronica e molto meno bene in fase acuta.

Farmaco-resistenza le cellule leucemiche possono sviluppare resistenza al farmaco; le cellule neoplastiche

leucemiche non fanno eccezione alla regola generale delle cellule neoplastiche: esse cioè sono geneticamente
instabili e fanno mutazioni; infatti esse scaturiscono da mutazioni, e tendono a farle anche dopo che hanno
assunto il fenotipo neoplastico.
Quando il medico somministra un farmaco, applica contemporaneamente una pressione selettiva (come nel
caso di un batterio trattato con antibiotici); naturalmente questo effetto non è intenzionale, bensì è un effetto
collaterale che non può essere scisso dall’azione terapeutica del farmaco; in questo modo però le cellule
geneticamente instabili possono avere delle mutazione che consentono di sfuggire all’azione di quel farmaco.
Quindi alcuni pazienti che inizialmente rispondono poi non rispondono più o recidivano, e ciò avviene in
quanto in essi le cellule leucemiche fanno mutazioni all’interno del dominio chinasico; la mutazione più
caratteristica è quella che coinvolge una specifica treonina (treonina 315) posizionata vicino alla tasca dove
si lega il farmaco: quando la treonina viene sostituita con un amminoacido un po’ più grande (come
l’isoleucina), la tasca si occlude parzialmente e il farmaco non entra più sufficientemente bene come entrava
nella proteina che non aveva la mutazione.
Quindi le cellule neoplastiche fanno la mutazione di un gene (BCR-ABL) che inizia la malattia, e poi fanno
una seconda mutazione nello stesso gene che le fa sfuggire alla terapia e al trattamento. Questa è la prova
formale più solida che è proprio questa proteina (BCR-ABL) la causa della malattia: il fatto che la cellule
leucemiche per sopravvivere devono scacciare il farmaco per ripristinare l’attività di ABL vuol dire che
senza ABL esse non possono sopravvivere, e che è proprio ABL la causa della malattia.

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Dal 2004-2005 ad oggi sono già stati creati farmaci di seconda generazione, migliori e molto più potenti
dell’Imatinib, che entrano nella tasca della chinasi nonostante la presenza di alcune mutazioni che rendono la
chinasi resistente a questo farmaco; alcuni di questi farmaci di seconda generazione sono il Dasatinib (30
volte più potente) e il Nilotinib (300 volte più potente).
Proprio la mutazione della treonina 315 non risponde nemmeno a questi farmaci di seconda generazione, ma
proprio recentemente (nel dicembre del 2012) è stato trovato un terzo farmaco, il T315, che funziona persino
su questa mutazione cosi difficile da sopraffare; chiaramente neanche questo farmaco è definitivo, e man
mano che avverranno mutazioni si cercheranno nuovi farmaci per risolvere il problema.

Resistenza delle cellule staminali leucemiche se ci sono nel paziente leucemico alcune cellule che sono
resistenti al farmaco non per problemi mutazionali aggiunti, ma proprio perché possiedono una intrinseca,
innata resistenza al trattamento, vuol dire che queste cellule, anche se hanno BCR-ABL, non rispondono
bene al farmaco in quanto hanno sì bisogno di BCR-ABL, ma presentano anche altri meccanismi che li fanno
andare avanti in assenza dell’attività di questa proteina. Cellule con queste caratteristiche sono presenti nei
pazienti con CML, e probabilmente si tratta di cellule staminali, molto vicine alle cellule totipotenti, che
però hanno assunto un fenotipo leucemico e presentano il gene chimerico BCR-ABL; la presenza di questa
piccola popolazione di cellule leucemiche intrinsecamente resistente rende conto del fatto che la risposta
iniziale citogenetica è quasi completa, mentre la risposta molecolare è meno completa.
Infatti tramite il trattamento con l’Imatinib, già dall’inizio qualche cellula leucemica nel midollo di questi
pazienti dall’inizio non riusciamo ad eradicarla, a prescindere dalla possibilità di sviluppare farmaco-
resistenza nelle cellule sensibili al trattamento; probabilmente alcune o tutte le cellule staminali della CML
hanno BCR-ABL, ma anche qualche meccanismo ulteriore, per cui non hanno bisogno così fortemente di
BCR-ABL come le cellule mature.
Nel caso delle neoplasie si dice che una cellula neoplastica è ‘addicted’, cioè dipendente, da una lesione
genetica quando se quest’ultima viene a mancare la cellula neoplastica muore o comunque perde il fenotipo
neoplastico; in un paziente con CML il grosso delle cellule leucemiche è addicted a BCR-ABL, per cui se
inibiamo questo enzima, applichiamo una pressione selettiva che seleziona le cellule che subiscono ulteriori
mutazioni in questo gene, tali da renderle resistenti al farmaco.
Ragionevolmente le cellule staminali risultano meno addicted a BCR-ABL, e spegnendo la proteina
farmacologicamente, rallentiamo la proliferazione di queste cellule, ma non riusciamo ad ucciderle e ad
eradicarle. Molto probabilmente ciò dipende dal compartimento, dalla nicchia del midollo dove queste
cellule leucemiche sono annidate; forse queste cellule staminali sono refrattarie perché hanno altri
meccanismi fisiologici legati al microambiente nel quale sono localizzate, come altri pathway di trasduzione
del segnale che le sostengono e mantengono in vita, anche se spegniamo farmacologicamente BCR-ABL
(per esempio il pathway di WNT-β catenina). Se così fosse, vuol dire che non basta bloccare in queste cellule
BCR-ABL, ma è necessario bloccare anche tutti gli altri pathway che mantengono in vita la cellula
neoplastica, anche se con un’attività metabolica rallentata.

Inefficacia del trattamento nella BP se la CML non viene curata in tempo e diventa una leucemia acuta,
essa non risponde più al trattamento con Imatinib, o comunque risponde meno bene al trattamento; le cellule
leucemiche in fase blastica risultano dunque refrattarie.
Molto probabilmente, per il fatto stesso che le cellule leucemiche sono diventate cellule blastiche, esse
devono contenere lesioni genetiche ulteriori oltre a quella di BCR-ABL, in modo tale da renderle meno
dipendenti da BCR-ABL perché sostenute da altri meccanismi. Forse dipende anche in parte da queste
lesioni aggiuntive se la fase blastica è di tipo linfoide o mieloide, posto che questo è possibile solo se la
malattia ha colpito la cellula prima della biforcazione.
La maggior parte delle leucemie mieloidi in fase blastica presentano una particolare alterazione genetica:
esse infatti non hanno soltanto una copia del gene BCR-ABL, ma ne hanno molto. Infatti spesso nella fase
acuta della CML non troviamo più il classico quadro citogenetico osservato dalla Rowley, con un unico un
cromosoma Ph+, ma molto frequentemente le cellule che sono arrivate in questa fase hanno amplificato il
cromosoma Ph+ e ne possiedono più di uno; ciò si verifica a causa dell’instabilità genomica, aneuploidia,
amplificazione genica e cromosomica caratteristiche delle cellule neoplastiche. La cellula leucemica che ha
bisogno di BCR-ABL infatti, se ne possiede in maggiori quantità, è selezionata positivamente nella sua
evoluzione secondo un meccanismo di tipo darwiniano; quindi molto spesso troviamo nella fase blastica
della CML l’amplificazione di BCR-ABL, o perlomeno l’iperespressione pur senza avere aumento di copie
geniche di BCR-ABL stesso. Si tratta dunque sempre della stessa lesione genica, che però è presente in

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misura minore nelle cellule in fase cronica, mentre è amplificata nella fase blastica; dunque le cellule
blastiche forse sono più aggressive pure per un fatto quantitativo, poiché hanno più chinasi, e che quindi
rispondono meno al trattamento (basato su un farmaco competitivo) anche per un motivo stechiometrico;
bisogna però considerare pure una componente qualitativa, ossia il blocco nella differenziazione, altrimenti
queste cellule non evolverebbero verso una leucemia acuta, ma si manifesterebbero come una leucemia
cronica abbondante.
In effetti comprendiamo quest’ultimo punto un po’ meno bene, anche se comunque sono state individuate
alcune lesioni che si aggiungono a BRC-ABL, magari amplificata; da quello che sappiamo si evince che,
anche se si tratta di lesioni che vanno nella stessa direzione, esse sono qualitativamente diverse nel caso
dell’evoluzione blastica di tipo linfoide rispetto a quella di tipo mieloide. Queste lesioni sono diverse, e
seppure sono conosciute solo in parte o comunque non molto bene, è possibile suddividerle in due sottotipi,
in quanto toccano due aspetti diversi:
da un lato troviamo lesioni molecolari come p53 (soprattutto nell’evoluzione mieloide), e p16 e p14
(soprattutto nella forma linfoide), che sono dei geni oncosoppressi gate-keeper, che quindi bloccano
la proliferazione delle cellule; quindi possiamo immaginare che in una cellula leucemica abbiamo
BCR-ABL che, come una sorta di acceleratore, spinge verso la proliferazione, e se poi salta il freno
degli oncosoppressori, per esempio p53 (generalmente nella forma mieloide acuta) e p16 o p14
(soprattutto nella forma linfoide acuta), coinvolti anch’essi nel pathway di p53, la malattia va avanti
in modo più tumultuoso;
spesso oltre ad un aumento dell’espressione di BCR-ABL e alla perdita di oncosoppressori gate-
keeper, si inattivano anche geni che codificano per fattori trascrizionali importanti per governare il
differenziamento delle cellule mieloidi o linfoidi. Ad esempio nel caso dell’evoluzione in leucemia
mieloide, nella quasi metà dei casi troviamo mutazioni inattivanti il gene RUNX1, un fattore
trascrizionale che serve al normale differenziamento mieloide; in maniera simile, nell’evoluzione
blastica linfoide, oltre a BCR-ABL iperespresso e all’inattivazione dei geni gate-keeper che
arrestano il ciclo cellulare, spesso vengono inattivati in maniera cooperativa e non esclusiva dei
fattori trascrizionali importanti per governare il differenziamento linfoide, come IKAROS (50% dei
casi) e PAX5 (50% dei casi).

Quindi riassumendo, sappiamo bene come inizia la malattia, mentre conosciamo meno bene come
progredisce, anche se perlomeno si comincia a capire la biologia che c’è dietro: evidentemente la malattia
progredisce perché si accende ancora di più l’oncogene e perché saltano degli oncosoppressori che o
governano la proliferazione oppure indurrebbero le cellule a differenziare; in quest’ultimo caso, possiamo
rintracciare la causa del blocco maturativo che fa sì che la malattia da cronica diventi acuta. Questo
determina anche il fatto che non c’è più una sola lesione genetica in queste cellule, ma ce ne sono tante, e
quindi ovviamente il trattamento con un farmaco specifico a bersaglio mirato non risulta più così efficace;
infatti anche se la cellula risulta spinta a morire perché viene spento BCR-ABL con l’Imatinib, di fatto non
può morire perché ad esempio non ha più p53 e in essa viene meno il meccanismo stesso per morire.

Fisiopatologia 18/03/13 Santoro

Sindromi mieloproliferative
La classificazione delle leucemie in base al tipo cellulare coinvolto, e poi alla proporzione di cellule
indifferenziate, cioè blasti, nel sangue periferico o nel midollo, è la seguente:
leucemie mieloidi:
acuta (AML);
cronica (CML);
sindromi mieloproliferative (MPS);
leucemie linfoidi:
leucemia acuta;
leucemia cronica;
linfoma;
mieloma.
Quindi abbiamo principalmente quattro grosse categorie di leucemie: leucemia mieloide acuta e cronica, e
poi leucemia linfatica acuta e cronica. Nel caso delle forme che partono dai linfociti, possiamo avere anche i
linfomi quando le cellule neoplastiche, più che trovarsi nel sangue periferico, infliltrano gli organi linfatici, in

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particolare linfonodi; però la distinzione tra leucemie e linfomi è un po’ fragile, in quanto spesso le leucemie
linfatiche possono evolvere in linfomi e viceversa.
La leucemia mieloide cronica può evolvere dopo un certo periodo di tempo in leucemia acuta, e conosciamo
alcuni dei geni coinvolti nella progressione; la leucemia mieloide cronica in realtà è la forma più importante
e frequente, e quella meglio conosciuta, di un gruppo di condizioni neoplastiche croniche chiamate sindromi
mieloproliferative.
Le tre sindromi mieloproliferative più importanti sono:
policitemia vera;
trombocitemia essenziale;
mielofibrosi primaria.
Queste tre patologie sono comunque malattie rare (anche se la policitemia vera è leggermente più frequente),
ma insieme alla leucemia mieloide cronica rappresentano le manifestazioni più importanti fra le MPS. Sono
malattie di tipo leucemico, che ragionevolmente partono tutte similmente a quanto accade per la leucemia
mieloide cronica, cioè dal precursore emopoietico totipotente oppure da un precursore mieloide più o meno
committed verso la linea differenziativa mieloide.
Oltre alla CML, alla policitemia vera, alla trombocitemia essenziale e alla mielofibrosi primaria abbiamo
anche altre sindromi mieloproliferative, quali la mastocitosi sistemica, la leucemia eosinofila cronica e la
leucemia cronica mielomonocitica; di queste ultime però non conosciamo ancora bene come per le prime le
lesioni molecolari che le sostengono.

Policitemia vera la policitemia vera, detta anche policitemia rubra, è una malattia piuttosto rara, con
incidenza di 2 casi su 100.000 all’anno; sostanzialmente è caratterizzata da un’espansione globale del
compartimento mieloide, in particolar modo però del compartimento eritroide.
I soggetti affetti presentano un forte accumulo di globuli rossi (fino a 7 milioni/µL); si tratta quindi di cellule
differenziate, come del resto accade in generale nelle forme croniche, nelle quali non c’è un blocco
differenziativo importante. L’aumento degli eritrociti nel sangue determina un incremento considerevole
dell’emoglobina e dell’ematocrito (fino al 60%); essendoci però un’espansione globale del compartimento
mieloide, questi soggetti possono presentare anche leucocitosi (fino a 50.000/µL) e trombocitosi (fino a
500.000/µL).
Le manifestazioni cliniche sono legate al forte accumulo di globuli rossi, per cui abbiamo:
• aumentata viscosità del sangue;
• aumentato rischio di trombosi, soprattutto nei casi in cui all’accumulo di globuli rossi si associa
anche l’accumulo di piastrine;
• in casi specifici, se nell’ambito della leucocitosi c’è un accumulo di basofili, questi soggetti possono
presentare prurito, soprattutto notturno e in condizioni di aumentata temperatura corporea.
Queste però sono manifestazioni non molto specifiche per questa patologia.
Un primo elemento da considerare nella diagnosi differenziale sono i livelli di eritropoietina (EPO)
circolante; la policitemia vera è infatti una policitemia primaria, cioè non legata ad accumulo di
eritropoietina, anzi i livelli di EPO circolante sono bassi perché la produzione di questa sostanza è inibita,
tramite feedback negativo, dall’accumulo neoplastico di globuli rossi. Questa condizione è pertanto distinta
dalle altre eritrocitosi, chiamate eritrocitosi secondarie, che sono invece legate ad un aumento dei livelli
circolanti di EPO, come può accadere in caso di interventi farmacologici, negli atleti, in soggetti che vivono
ad alta quota, nei cardiopatici che hanno problemi circolatori e quindi ridotta ossigenazione dei tessuti,
insomma in molte condizioni in cui abbiamo come risposta una iperproduzione di EPO, e quindi
secondariamente un accumulo di eritrociti. La policitemia vera va poi anche distinta da eritrocitosi
secondaria ad altri eventi neoplastici che possono determinale policitemia, quali il carcinoma delle cellule
renali EPO-secernenti, il tumore epatico, il feocromocitoma e altri ancora.

Trombocitemia essenziale la trombocitemia essenziale, come accade anche per la policitemia vera,
presenta un’espansione globale del compartimento mieloide, ma in particolare del compartimento
megacariocitopoietico, quindi nei soggetti affetti rileviamo:
• accumulo di piastrine (600.000/µL);
• aumentato rischio di trombosi;
• splenomegalia da accelerata emocateresi delle piastrine o dei leucociti.

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Mielofibrosi primaria la mielofibrosi primaria (o idiopatica) presenta anch’essa un’espansione globale
del compartimento mieloide (quindi abbiamo anche leucocitosi e trombocitosi), ma si connota per una forte
reazione stromale (connettivale) del midollo, per cui si hanno anche:
• fibrosi midollare, probabilmente secondaria al rilascio di citochine quali il PDGF e il TGFβ rilasciati
dalle piastrine, che stimolano la proliferazione dei fibroblasti; questa fibrosi midollare tende a
rendere progressivamente insufficiente il midollo, proprio a causa della forte reazione connettivale;
• splenomegalia;
• emopoiesi extramidollare, in quanto la funzionalità del midollo è progressivamente soppressa dalla
reazione stromale.

Meccanismo patogenetico la policitemia vera, la trombocitemia essenziale e la mielofibrosi primaria sono

tre condizioni che si somigliano molto tra loro; infatti certe volte si possono osservare dei quadri misti, in cui
abbiamo dei pazienti che mostrano policitemia, che poi diventa una mielofibrosi e così via. Questa
somiglianza morfologica e clinica, e la conversione di un tipo in un altro, fanno sospettare che ci sia un
meccanismo comune alla base della patogenesi di queste malattie.
Si tratta di sindromi croniche; quindi, seguendo lo schema delle differenze fra le mutazioni delle sindromi
acute e croniche, dal punto di vista patogenetico risulta più evidente e marcato lo stimolo proliferativo del
compartimento mieloide o eritroide, rispetto al blocco differenziativo (che è invece caratterizza le malattie
acute). Quindi ci aspettiamo di trovare una lesione molecolare che provochi questa espansione di
compartimenti mieloidi sostanzialmente ben differenziati; inoltre ci aspettiamo che la lesione sia abbastanza
comune, altrimenti non si spiegherebbe la somiglianza delle manifestazioni che caratterizzano queste
malattie. In una proporzione molto ampia di pazienti affetti da queste condizioni, la lesione molecolare
interessa il sistema di trasduzione del segnale a valle delle citochine che normalmente sostengono la
proliferazione e l’espansione clonale delle cellule coinvolte in queste condizioni.
Il recettore dell’EPO, così come il recettore della trombopoietina (il fattore di crescita per i megacariociti), è
un classico recettore per citochine che funziona attivando una cascata trascrizionale, similmente a quanto
avviene per i recettori classici dei fattori di crescita, cioè i recettori tirosino-chinasi (TKR); tuttavia, i
recettori per le citochine (di cui fa parte il recettore dell’EPO) non hanno un’attività tirosino-chinasica
intrinseca, ma si avvalgono di tirosino-chinasi che si associano al dominio intracellulare del recettore.
Queste tirosino-chinasi sono della chinasi della famiglia JAK; esse si associano al dominio intracellulare del
recettore, e quando quest’ultimo dimerizza grazie al legame della citochina specifica, la dimerizzazione
coinvolge anche le JAK e ne determina l’attivazione enzimatica. Le chinasi JAK fosforilano una serie di
proteine su residui di tirosina; in particolare i substrati tipici di questa cascata di trasmissione del segnale
sono dei fattori trascrizionali che appartengono alla famiglia STAT, i quali sono fosforilati in tirosina dalle
JAK, dimerizzano, traslocano nel nucleo e stimolano la trascrizione di geni che sono coinvolti in varie
funzioni, come ad esempio la proliferazione dei precursori degli eritrociti.
Non è dunque casuale che il 90% dei casi di policitemia vera, e una proporzione significativa (50%) dei casi
delle altre 2 condizioni, si associno a mutazioni attivanti della componente più importante di questo sistema
di trasduzione, cioè JAK. Quasi sempre questa mutazione è specifica, cioè è una missenso del dominio
enzimatico della chinasi JAK; una mutazione frequente di JAK è quella in cui la valina in posizione 617 è
sostituita da un residuo di fenilanalina (V617F). Questo meccanismo di mutazione è analogo ai vari
meccanismi mutazionali che si verificano in diverse tirosino-chinasi in specifiche malattie neoplastiche: la
mutazione colpisce il dominio chinasico, e in qualche modo apre la chinasi e la fa funzionare in modo
eccessivo anche in assenza dello stimolo fisiologico (quale ad esempio l’EPO).
Le chinasi JAK (Janus chinasi) presentano una particolarità: hanno un doppio dominio chinasico nella
porzione enzimatica, di cui uno possiede attività enzimatica, mentre l’altro non è enzimaticamente attivo ma
ha funzione regolatoria, in quanto regola negativamente l’attività chinasica del primo dominio; la mutazione
disturba proprio la funzione regolatoria negativa di questo dominio, e dunque l’inibizione fisiologica operata
da esso viene meno e la chinasi si attiva anche in assenza di EPO. I precursori eritroidi, nel midollo soggetti
affetti da policitemia, è come se fossero continuamente sotto lo stimolo di EPO, poiché il sistema di
trasduzione funziona come se fosse presente l’EPO, anche se in realtà essa manca; questo rende conto della
somiglianza fra la policitemia primaria e condizioni di policitemia secondaria che non sono neoplastiche e
non sono basate su questo evento mutazionale, ma sono sostenute dall’EPO e dal suo sistema di trasduzione
del segnale.
Si è cercato di trovare una cura per questi pazienti; molto recentemente è stato approvato un inibitore che
mantenga sotto controllo la chinasi eccessivamente attiva. È stata infatti individuata una molecola di basso

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peso molecolare simile all’ATP che entra in modo specifico nel dominio chinasico della chinasi Janus; il
farmaco è chiamato Ruxolitinib.

Policitemia secondaria la policitemia secondaria è una condizione che va tenuta distinta dalla policitemia
vera in quanto non è primaria, ma secondaria ad un eccesso di EPO (in 3 su 4 casi). Questo eccesso può
essere farmacologico oppure legato ad altre condizioni patologiche, ma può anche essere dovuto a mutazioni
genetiche germinali che si trasmettono nella linea ereditaria che determinano eccessiva produzione di EPO e
quindi eritrocitosi, cioè policitemia, secondaria; sono comunque condizioni piuttosto rare.
Il meccanismo compromesso è quello coinvolto anche nell’angiogenesi e metastasi, e che ritroviamo alterato
anche in alcuni tipi particolari di carcinoma del rene; esiste un sistema che controlla i livelli di espressione di
alcune citochine, come il VEGF ma anche l’EPO, che è quello incentrato su HIF, fattore trascrizionale
sensibile all’ipossia, (di cui esistono varie forme) e su una una ubiquitino-ligasi composta da varie
componenti, tra cui VHL (la componente deputata a riconoscere il substrato dell’ubiquitina ligasi) che
normalmente degrada HIF:
quando c’è ossigeno, il fattore HIF viene idrossilato su residui di prolina dall’enzima prolil-
idrossilasi, e quando è idrossilato può essere riconosciuto dalla proteina VHL, poliubiquitinato e
indirizzato al proteasoma per la degradazione; quindi quando c’è ossigeno HIF è degradato;
quando non c’è ossigeno, il sistema che serve a degradare HIF non funziona, e dunque HIF si
accumula; tramite la sua attività di fattore trascrizionale, HIF va a stimolare quei geni che servono a
compensare la carenza di ossigeno, cioè l’ipossia; ad esempio sono trascritti VEGF, un importante
fattore neoangiogenetico, e l’EPO, che aumenta la produzione di globuli rossi, che in questo modo
possono portare ossigeno ai tessuti.
Esistono rare forme di eritrocitosi congenita secondaria che sono legate a mutazioni germinali di questo
sistema; queste forme sono da distinguere nettamente dalla policitemia vera, poiché mentre nella policitemia
vera la produzione di EPO è bassa, nella policitemia secondaria (anche se ci sono eccezioni) la quantità di
EPO circolante è elevata: in quest’ultimo caso dunque l’eritrocitosi è secondaria all’eccesso di EPO.
Nel sistema incentrato su HIF, abbiamo potenziali oncogeni e oncosoppressori:
HIF, che scatena la risposta ipossica, è un potenziale oncogene, in quanto determinando un aumento
della sintesi di eritropoietina causa anche una maggiore proliferazione dei globuli rossi;
la prolil-idrossilasi e la VHL, che grazia alla loro azione combinata comportano la degradazione di
HIF, sono dei potenziali oncosoppressori.
Queste rare forme di eritrocitosi secondaria congenita sono legate o a mutazioni attivanti di HIF o a
mutazioni inattivanti della prolil-idrossilasi o di VHL; la mutazione di VHL più frequentemente correla con

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la predisposizione al carcinoma del rene, in quanto la perdita della funzione di questo sistema è coinvolto
anche nella proliferazione delle cellule renali, anche se non conosciamo molto bene il meccanismo; questa
mutazione inoltre incide specificamente anche sul controllo dell’EPO.
Una particolare mutazione di VHL (R200W) è tipica di una popolazione della Russia occidentale, della
regione della Chuvashia, ma è frequente anche ad Ischia; è chiaro che si tratta di isolati genetici, cioè di una
mutazione che si è fissata in qualche modo in una popolazione piuttosto confinata.

Leucemia mieloide acuta

Epidemiologia
• si tratta di malattie non molto frequenti, con un’incidenza di 2/100.000 (simile all’incidenza della
leucemia mieloide cronica);
• più frequenti nei maschi che nelle femmine (rapporto di 2 a 1);
• più frequenti dai 65 anni in su; le leucemie linfatiche acute invece sono più frequenti in soggetti
giovani;

Sappiamo molto poco dell’eziologia di questa patologia, al contrario della patogenesi, che è abbastanza
conosciuta:
soggetti con alcune malattie genetiche hanno una predisposizione alla leucemia mieloide acuta, per
esempio quelli con sindrome di Down (dunque verosimilmente è coinvolto qualche gene del
cromosoma 21) o soggetti con malattie che causano instabilità genomica, soprattutto difetti di riparo
che causano rotture a doppio filamento del DNA, quali la sindrome di Bloom, di Fanconi, l’ATM e
altre ancora. Questo ci fa sospettare che aberrazioni cromosomiche siano alla base di questa malattia;
alcune sindromi mieloproliferative croniche sono predisponenti alla leucemia mieloide acuta per
definizione, in quanto nella storia naturale della leucemia mieloide cronica c’è evoluzione nella
forma acuta;
le sindromi mielodisplastiche sono condizioni croniche preneoplastiche che pure predispongono alla
leucemia mieloide acuta;
alcuni fattori ambientali aumentano il rischio di AML:
- esposizione a radiazioni ionizzanti (dimostrato dai disastri nucleari di Hiroshima e Nagasaki,
zone in cui dopo l’esplosione della bomba atomica c’è stata aumentata incidenza di AML), e
questo è congruente con la teoria che la malattia sia legata ad aberrazioni cromosomiche;
- cancerogeni chimici vari (benzene, erbicidi, pesticidi, fumo);
- alcuni chemioterapici: esistono infatti casi di AML secondaria in pazienti che hanno avuto
anni prima una neoplasia solida trattata con chemioterapici. Il rischio di sviluppare AML
dopo trattamenti con chemioterapici è dunque presente, soprattutto nel caso di alcuni
inibitori delle topoisomerasi; è dunque possibile che ci sia un legame tra le due condizioni
(chemioterapia e AML) perché queste AML in questi soggetti hanno alterazioni nel
cromosoma 11. Non sappiamo perché venga colpito questo particolare cromosoma, però
quando c’è correlazione tra esposizione ad un certo fattore eziologico e una certa lesione si
sospetta un rapporto tra le due malattie.

Quadro clinico da un punto di vista clinico l’AML si definisce come un’espansione leucemica del
compartimento mieloide con un numero di blasti superiore al 20%; nello striscio di questi soggetti, a
differenza di quello della leucemia mieloide cronica (in cui si vedevano molte cellule bianche, ma con un
nucleo polilobato tipico dei granulociti, e dunque differenziate), in questo caso si osservano cellule
indifferenziate (mieloblasti), con nucleo grosso, cromatina dispersa, eucromatica, con accumulo di nucleoli,
a volte con un principio di differenzazione aberrante che si manifesta morfologicamente con la presenza dei
corpi di Auer (bastoncelli citoplasmatici contenenti enzimi lisosomiali), cioè granuli non completamente
maturi che indicano inizio di differenziazione verso la linea granulocitaria; i corpi di Auer sono caratteristici
soprattutto della leucemia promielocitica acuta.
Il quadro clinico è poco specifico; dal punto di vista dei segni oggettivi, la malattia si caratterizza per aplasia
midollare legata all’infiltrazione di cellule leucemiche indifferenziate, per cui i soggetti hanno:
anemia;
piatrinopenia;

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 la leucemia nel sangue periferico in genere non è molto prominente: quello che caratterizza la
malattia non è tanto il numero dei globuli bianchi, ma il fatto che essi sono immaturi. Il più delle
volte dunque la leucocitosi periferica non è abbondante (15.000/mm³), mentre sono molto rari i casi
in cui invece lo è;
splenomegalia per aumento dell’emocateresi;
epatomegalia;
le cellule leucemiche sono sostanzialmente nel sangue e nel midollo, ma qualche volta possono
anche infiltrare le mucose, soprattutto nella forma monocitica M5 (generalmente a livello gengivale);
esiste la possibilità, anche se rara, che si formino masse solide di cellule leucemiche, e queste lesioni
tumorali sono chiamate sarcomi mieloidi; non si tratta di neoplasie dei fibroblasti, ma di cellule
leucemiche che si accumulano in masse solide nei posti più disparati, a livello delle ossa, della cute,
etc.
Anche i sintomi sono molto poco specifici:
febbre;
predisposizione alle infezioni, per difetto funzionale dei leucociti;
anemia, e manifestazioni tipiche connesse quali astenia e dispnea, per la soppressione midollare;
piastrinopenia, sempre a causa dell’infiltrazione midollare;
sanguinamento ed emorragia (questo è tipico del caso della forma M3, promielocitica).
Proprio a causa di questi sintomi aspecifici, l’unico modo per fare la diagnosi è fare un analisi del sangue
periferica, o meglio del midollo.

Classificazione mentre la leucemia mieloide cronica è una soltanto, la AML ha parecchi sottotipi. La
classificazione delle AML in vigore fino a pochi anni fa è quella elaborata da un gruppo di studio francese-
americano-inglese, ed è stata pertanto chiamata classificazione FAB, che suddivide i sottotipi sulla base di un
criterio morfologico.
Tenendo conto che le AML sono caratterizzate dai blasti, possiamo distinguere i sottotipi di AML basandoci
sull’aspetto dei blasti, se sono più simili a cellule immature, o a quelle che si avviano alla linea monocitaria,
eritrocitaria, megacariocitaria.
La classificazione FAB distingue 8 sottipi:
- M0 blasti completamente indifferenziati;
- M1 mieloblasti senza maturazione, che si avviano però alla linea bianca (20%);
- M2 mieloblasti con maturazione (30%);
- M3 promielocitica (10%); le cellule avviate decisamente alla linea granulocitaria;
- M4 mielomonocitica (15-20%); le cellule sono a cavallo tra mielociti e monociti;
- M4(eo) mielomonocitica con aumento di eosinofili midollari atipici;
- M5 monocitica;
- M6 eritroleucemia;
- M7 megacarioblastica.
Le più frequenti sono M1, M2, M3 e M4.

È abbastanza forte la correlazione tra alcuni di questi sottotipi e una particolare lesione genetica; gli
ematologi però hanno un po’ abbandonato questa classificazione, a favore di una più recente della WHO, la
quale porta all’estreme conseguenze la correlazione di certi tipi di leucemia mieloide acuta e certe alterazioni
cromosomiche, quindi fa prevalere l’alterazione genetica sull’aspetto morfologico. Si tratta di una
classificazione più complessa, ma ha il vantaggio di dare delle indicazioni prognostiche: sulla base
dell’appartenenza ad uno o l’altro dei sottogruppi, si può infatti predire la prognosi dei pazienti.
Questa classificazione è mista, genetica-morfologica-eziologica, e divide le AML in:
AML con specifiche alterazioni genetiche, che possono essere aberrazioni cromosomiche o
mutazioni puntiformi;
AML secondarie a sindromi mielodisplastiche;
AML legate a chemioterapie;
AML che non sono associate a specifiche mutazioni o alterazioni, cioè tutte le AML non comprese
nelle altre categorie; queste ultime sono suddivise ancora secondo le regole della classificazione
FAB, cioè secondo la morfologia.

72
Grazie a questa classificazione, possiamo individuare tre gruppi di pazienti AML distinti in base alla
prognosi:
pazienti con buona prognosi, cioè che hanno una sopravvivenza complessiva a 5 anni superiore alla
metà dei casi (45-80%); si tratta dei pazienti che hanno delle alterazioni cromosomiche specifiche,
ricorrenti (traslocazioni, inversioni);
pazienti che hanno una prognosi intermedia, con sopravvivenza complessiva a 5 anni del 20-40% ;
sono le AML che hanno alcune mutazioni specifiche puntiformi, soprattutto in tirosino-chinasi, ma
che presentano un cariotipo normale (NK);
pazienti con prognosi peggiore, con sopravvivenza complessiva del 5-20% a 5 anni; si tratta di
leucemie che presentano un quadro più grave d’instabilità genomica, cioè non hanno aberrazioni
cromosomiche specifiche ma presentano aneuploidia, per cui sono a cariotipo complesso (CK),
oppure sono caratterizzate da monosomie, perdite di cromosomi (MK), ad esempio del cromosoma
5, 7, del braccio corto del cromosoma 17.

Basi biologiche delle AML anche per quanto riguarda le leucemie acute, si tratta di una malattia della
cellula staminale; però, mentre nelle forme croniche la leucemia determina espansione clonale senza
ostacolare il differenziamento delle cellule, per quanto riguarda le AML abbiamo condizioni in cui le lesioni
genetiche non solo determinano espansione, ma anche un blocco maturativo. Quindi geni oncosoppressori
che normalmente governano la maturazione delle cellule della linea emopoietica devono essere alterati per
determinare il blocco maturativo che causa la AML; a seconda di quale livello avviene il blocco abbiamo
diverse forme di AML.

Fisiopatologia 20/03/13 Santoro

La AML è più complicata della CML (Leucemia Mieloide Cronica); infatti di leucemia mieloide acuta non
ne esiste un solo tipo, come accade per la CML, ma ne sono stati individuati diversi sottotipi, classificati con
varie classificazioni.
La classificazione storica è quella di un gruppo francese-americano-inglese, da cui la denominazione FAB;
questa classificazione distingue le AML da un punto di vista morfologico e per la presenza di parametri
differenziativi verso un certo ‘lineage’ mieloide: la classificazione FAB distingue le AML in 8 sottotipi, da
M0 ad M7 (M0, M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7), a seconda del grado di differenziamento e dell’indirizzo
del differenziamento. M0 indica cellule leucemiche indifferenziate; le forme mielogranulocitaria e
monocitaria dell’AML sono le più frequenti, mentre le forme eritroide e megacariocitopoietico sono meno
frequenti
Questa classificazione, nonostante sia molto utile, è stata ampiamente superata da un’altra classificazione,
quella della WHO; la classificazione della WHO, cioè l’OMS (Organizzazione Mondiale della Sanità)
affianca infatti al criterio morfologico anche quello genetico: ciò vuol dire che l’analisi genetica e

73
l’individuazione di mutazioni geniche o cromosomiche ha capovolto la classificazione delle AML; inoltre la
classificazione della WHO considera le caratteristiche cliniche e fisiopatologiche delle leucemie mieloidi
acute. Per quanto concerne le AML, possiamo dunque affiancare alla classificazione morfologica FAB
questa classificazione effettuata con il criterio genetico.
La classificazione della WHO, sebbene più complessa, ha il vantaggio di fornire un quadro prognostico delle
diverse forme di AML:
AML con specifiche alterazioni cromosomiche prognosi migliore;
AML con cariotipo normale (mutazioni puntiformi, generalmente di tirosino-chinasi) prognosi
intermedia;
AML con cariotipo complesso (aneuploidie, monosomie) prognosi peggiore.
Ci concentreremo prevalentemente sulle AML con specifiche e frequenti alterazioni cromosomiche, in
particolare su M2, M3, M4 ed M5 e sulle alterazioni cromosomiche a cui sono correlate:
M2 (leucemia mieloblastica con maturazione) t(8;21),
M3 (leucemia promielocitica acuta) t(15;17); questa traslocazione è presente solo in questo
determinato tipo di patologia e non altrove;
M4eo (forma mielomonocitica con accumulo di eosinofili) inv(16)
M5 (leucemia monocitica) t(11q23); le traslocazioni del cromosoma 11 non avvengono con uno
specifico cromosoma partner: queste infatti coinvolgono costantemente il braccio lungo del
cromosoma 11, che però si può legare a cromosomi diversi.
Bisogna rimarcare che l’associazione tra specifiche lesioni genetiche e un determinato tipo di AML non è
assoluta, e inoltre le stesse lesioni si possono trovare anche in altri tipi di leucemie. Possiamo però notare una
associazione prevalente tra determinate lesioni genetiche e alcune AML; queste correlazioni sono appunto
prevalenti, non assolute.
Forse l’unico caso in cui la correlazione è assoluta è la correlazione tra la t(15;17) e la leucemia
promielocitica acuta (M3 nella classificazione FAB); ciò vuol dire che tutti i casi di leucemia promielocitica
acuta hanno questo tipo di traslocazione (anche se raramente essa presenta delle varianti), e inoltre questo
tipo di traslocazione si trova solo nella leucemia promielocitica acuta: pertanto questo è un caso di
associazione assoluta. Questa traslocazione è emblematica di come funzionano le traslocazioni
cromosomiche che generano le varie forme di AML; infatti concettualmente il meccanismo con cui le altre
traslocazioni causano le altre patologie leucemiche è molto simile.

Leucemia promielocitica acuta (M3)

La leucemia promielocitica acuta è tra le più frequenti AML (intorno al 10% dei
casi di leucemia mieloide acuta); è indicata anche con la sigla APL e, secondo la
classificazione FAB, come M3. Essendo una leucemia acuta, lo striscio di
sangue presenta cellule blastiche in quantità superiore al 20%: queste cellule
sono indifferenziate, con un aspetto che però indica una certa tendenza al
differenziamento granulocitario: notiamo infatti la presenza di granuli, o
comunque di un abbozzo di formazione di granuli, che sarebbero tipici dei
granulociti; pertanto queste cellule sono definite promielocitiche, cioè tendenti
alla linea granulocitaria.
Spesso tali granuli si organizzano in strutture bastoncellari, chiamate corpi di
Auer (Auer rods); questi corpi possono trovarsi in questo tipo di leucemia o
Striscio di midollo osseo
anche in altri tipi di AML con indirizzo differenziativo verso la linea postchemioterapia di un paziente con
mielomonocitaria. I corpi di Auer sono raggruppamenti di materiale granulare leucemia promielocitica acuta
azzurrofilo, che formano aghi allungati visibili nel citoplasma dei blasti ipergranulare (AML-M3). Una singola
leucemici. cellula faggot, con numerosi corpi di
Auer, è presente in un contesto di
L’APL è un tipo di leucemia molto seria se non trattata. normali precursori dei neutrofili.
(Wright-Giemsa)
Quadro clinico i pazienti manifestano sintomi molto simile a quelli presenti in
altre AML; in particolare i pazienti con APL spesso presentano disordini della
coagulazione, quali coagulazione intravascolare disseminata (CID), e successivo depauperamento del
sistema di coagulazione con tendenza all’emorragia. Questi difetti della coagulazione non costituiscono un
quadro specifico dell’APL, ma nell’ambito delle AML sono caratteristici in particolare dell’APL.
Le alterazioni genetiche che troviamo in genere nelle AML (e anche nelle CML) devono in qualche modo
sostenere la proliferazione di queste cellule immature, ma devono inoltre contemporaneamente limitare il

74
differenziamento, perché altrimenti non si spiegherebbe l’arresto differenziativo nel corso della linea
maturativa; perciò tali alterazioni genetiche avranno la caratteristica di generare proteine patologiche, ovvero
proteine alterate, che sono in grado di intercettare e bloccare il differenziamento. La t(15;17) in APL
costituisce un paradigma che spiega bene questo tipo di meccanismi.

t(15;17) è una traslocazione reciproca bilanciata tra i bracci lunghi dei due cromosomi, il cromosoma 15 e
il 17; abbiamo una rottura del cromosoma 15, poi una rottura del cromosoma 17, e c’è quindi uno scambio
reciproco dei frammenti telomerici dei due cromosomi.
I breakpoints dei due cromosomi cadono in due geni importanti: PML, così chiamato proprio perché fu
scoperto per la prima volta nella leucemia promielocitica, in cui è coinvolto, e RARα, un gene che si trova sul
cromosoma 17, il quale era conosciuto prima ancora del gene PML, e che codifica per il recettore dell’acido
retinoico nella sua isoforma α. I breakpoints colpiscono questi due geni all’interno delle porzioni codificanti,
per cui, quando si realizza la traslocazione cromosomica, si generano geni chimerici con open reading frames
chimeriche, date in parte da PML e in parte da RARα. In genere si creano due geni chimerici:
1) PML-RARα (5’-terminale di PML + 3’-terminale di RARα
cromosoma 15);
2) RARα-PML (5’-terminale di RARα + 3’-terminale di PML
cromosoma 17).
Modelli animali suggeriscono che anche il prodotto proteico di
RARα-PML abbia un ruolo nella leucemogenesi; è sicuro però che
il gene chimerico PML-RARα è l’oncogene che causa la APL: si è
visto infatti che inibendo questa proteina prodotta da questo gene
chimerico si è riusciti a controllare tale malattia, che in caso
contrario sarebbe stata piuttosto aggressiva.

Recettore dell’acido retinoico (RAR) il RAR è un recettore

nucleare il cui ligando è costituito dall’acido retinoico, una
sostanza che deriva della vitamina A (o retinolo); il RAR ha la
struttura tipica dei recettori nucleari, ed è pertanto simile al
recettore degli androgeni, degli estrogeni e degli ormoni tiroidei. Si tratta di una proteina nucleare che funge
da fattore trascrizionale, e contiene alcuni sottodomini ben individuati:
• nella porzione N-terminale abbiamo un dominio di transattivazione, cioè un dominio che, una volta
che la proteina si è posizionata sul DNA a livello dei promotori dei geni che contengono le sequenze
consenso, è in grado di reclutare cofattori trascrizionali e quindi di far partire la trascrizione;
• una porzione centrale, che è il dominio che lega il DNA e consente il legame di questa proteina a
sequenze specifiche di DNA nei promotori dei geni responsivi;
• una porzione C-terminale, che lega il ligando (cioè l’acido retinoico).
Il punto di rottura del recettore dell’acido retinoico è abbastanza preciso, e non è molto eterogeneo nei
diversi pazienti: quasi sempre infatti la rottura stacca il dominio di transattivazione, che va via (in realtà
rimane nella traslocazione reciproca, anche se del ruolo di quest’ultima traslocazione sappiamo ancora poco),
e si conserva il dominio di legame al DNA, essenziale per la funzione della proteina chimerica, e il dominio
di legame del ligando, essenziale invece per capire le implicazioni terapeutiche.

Proteina della leucemia promielocitica (PML) è una proteina più complessa; si tratta anche in questo caso
di una proteina nucleare, in grado di legare il DNA o di stabilire interazioni proteina-proteina all’interno del
nucleo delle cellule nelle quali è espressa.
Può fratturarsi e rompersi in seguito alla t(15;17) in diversi punti, che mappano tutti nella parte centrale della
proteina.

In seguito alla traslocazione fra il cromosoma 15 e il 17, si genera un gene chimerico, costituito dal 5’-
terminale di PML (circa metà del gene) più la porzione 3’-terminale di RARα (praticamente quasi tutto il
gene, tranne il dominio di transattivazione, cioè quello di attivazione della trascrizione).
Il gene chimerico PML-RARα è la causa dell’APL, in quanto agisce come dominante negativo del prodotto
fisiologico del recettore dell’acido retinoico; per dominante negativo intendiamo una proteina che in
eterozigosi ha funzione dominante su quella codificata dall’altro allele, ma questa dominanza è negativa,
poiché la sua attività si esplica bloccando il funzionamento della proteina codificata dall’allele sano. La

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t(15;17) è infatti presente in eterozigosi; quindi i pazienti presentano un cromosoma 15 normale, un
cromosoma 17 normale, ma hanno un cromosoma patologico (15;17) e il suo reciproco. Il cromosoma
patologico (15;17) determina la sintesi della proteina PML-RARα, che funziona da dominante negativo di
RARα.
Per capire il meccanismo di leucemogenesi del gene chimerico, bisogna capire la funzione che possiede
RARα, e in che senso la soppressione della sua espressione, dovuta alla presenza della proteina malata,
determina la malattia, e cosa possiamo fare per curarla.
Il recettore dell’acido retinoico è presente in numerosi tessuti (soprattutto a livello dei cheratinociti, e incluse
le cellule ematopoietiche della linea mieloide), ed ha una funzione differenziativa; quando è legato al suo
ligando, RARα modifica l’espressione genica in modo da indurre il differenziamento:
induce l’espressione del fattore trascrizionale CEBPα, che è un master gene del differenziamento
della linea mieloide;
come accade in tutte le cellule che vanno incontro a differenziamento, induce la soppressione della
proliferazione (ad esempio, inducendo l’espressione di geni correlati all’arresto del ciclo cellulare);
possiede un effetto proapoptotico.
Fisiologicamente dunque il recettore dell’acido retinoico si trova nelle cellule mieloidi (ma anche in molte
altre cellule), dove agisce proteina pro-differenziativa, in particolare nelle fasi finali del differenziamento
(pro-differenziamento finale), arrestandone il ciclo cellulare e promuovendone la morte; il recettore
dell’acido retinoico svolge questa operazione perché, come tutti i fattori trascrizionali, possiede un dominio
di transattivazione tramite il quale recluta dei cofattori trascrizionali che rimodellano la cromatina,
trasformandola in eucromatica, aprendola e consentendo la trascrizione. Infatti per trascrivere dei geni è
necessario modificare in maniera covalente gli istoni: gli istoni possono andare incontro a diverse modifiche
post-traduzionali (metilazione, fosforilazione, acetilazione, etc.), ma anche lo stesso DNA può essere
modificato tramite varie reazioni, pur mantenendo la stessa sequenza di DNA; questo tipo di modificazioni
che modificano l’espressione genica, senza però alterare la sequenza primaria di DNA, rientrano
nell’epigenetica.
L’acetilazione degli istoni serve ad aggiungere una carica negativa agli istoni (che in genere hanno una
carica basica); l’aggiunta di questa carica determina un allontanamento degli istoni, l’apertura della
cromatina e la possibilità di effettuare la trascrizione.
Fisiologicamente il recettore dell’acido retinoico, se non fosse riarrangiato con il gene PML, svolgerebbe la
sua funzione tramite questa sequenza:
RARα lega l’acido retinoico (ligando);
si ‘siede’ su promotori di geni che servono al differenziamento o all’arresto del ciclo cellulare;
porta sulla cromatina delle istone-acetilasi;
le istone-acetilasi acetilano gli istoni;
gli istoni perdono la loro carica basica grazie al gruppo acetile, che presenta una carica negativa;
gli istoni si staccano dalla cromatina;
la trascrizione dei geni pro-differenziamento viene attivata.
La proteina chimerica patologica (PML-RARα), in quanto dominante negativo, grazie al nuovo peptide
chimerico che si fonde al recettore dell’acido retinoico cambia la stechiometria del reclutamento sulla
cromatina di enzimi che modificano gli istoni. Sulla cromatina infatti, invece di istone-acetilasi (che aprono
la cromatina, e ne consentono la trascrizione), vengono reclutate delle istone-deacetilasi, che determinano un
effetto opposto: abbiamo infatti la persistenza di istoni basici, la cromatina rimane chiusa e la trascrizione
bloccata. In genere comunque le istone-deacetilasi non sono reclutate direttamente dai fattori trascrizionali,
ma sono associate a corepressori reclutati dal fattore trascrizionale, e questi corepressori a loro volta
reclutano istone-deacetilasi. Il cambio dell’attività del RAR è legato al riarrangiamento con PML, e in
particolar modo a sequenze amminoacidiche specifiche che PML contiene, e che la t(15;17) porta sul
recettore dell’acido retinoico.
Le cause di certe patologie quindi non sono semplicemente schematizzate in oncogeni o geni
oncosoppressori; in realtà il recettore dell’acido retinoico agisce come un repressore tumorale
(oncosoppressore), mentre la funzione della proteina chimerica PML-RARα è oncogenica: è dominante in
eterozigosi, e inoltre abbiamo acquisizione di funzione (cioè la capacità di reclutare istone-deacetilasi), anche
se questa acquisizione di funzione significa bloccare una funzione fisiologicamente normale di soppressione
tumorale. Quindi è la perdita della funzione di soppressione tumorale dell’acido retinoico ad essere alla base
di questa malattia, e questa soppressione è esercitata mediante un meccanismo di dominanza negativa grazie
alla proteina chimerica PML-RARα.

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Le cellule che presentano questa proteina chimerica vengono selezionate in modo darwiniano, in quanto essa
è leucemogena; in particolare, il riarrangiamento PML-RARα viene selezionato perché sa fare tutto ciò che
compete al recettore dell’acido retinoico, incluso andarsi a posizionare sul DNA, ma al contrario di quanto
accade fisiologicamente, recluta sul DNA istone-deacetilasi invece che istone-acetilasi; quest’ultima azione
deriva dal possesso di un polipeptide ottenuto grazie alla traslocazione del gene PML. La fusione col gene
PML va a disturbare completamente l’attività del recettore dell’acido retinoico, proprio in quanto va a
competere con il recettore normale, cioè quello codificato dall’allele rimasto intatto dopo il processo di
traslocazione, grazie alla sua capacità di legare il DNA a livello delle stesse sequenze consenso del RAR, ma
bloccando la trascrizione, invece di attivarla.
La stessa situazione che è presente nell’APL è assimilabile a molte traslocazioni cromosomiche che troviamo
anche in altri tumori, anche se generalmente negli altri casi questo stesso processo è solo sospettato, mentre
per l’APL il processo di leucemogenesi indotto dalla traslocazione 15;17 è ben spiegato; APL dunque è
considerato un prototipo di questo tipo di alterazioni geniche (traslocazioni bilanciate, con formazione di
geni chimerici) che inducono sviluppo neoplastico.

L’APL è una patologia piuttosto complessa; la t(15;17) presenta infatti due conseguenze genetiche:
1. disturbo funzionale del recettore dell’acido retinoico;
2. alterazioni strutturali della proteina PML; la rottura a metà del gene PML ha conseguenze funzionali
non solo perché interferisce con la funzione del recettore dell’acido retinoico, ma anche con la
funzione stessa di PML.
La t(15;17) è così potente (infatti non si sviluppa APL se non c’è questa traslocazione cromosomica) in
quanto con un solo evento genetico si determinano due alterazioni funzionali: quella di RARα e quella di
PML.

PML proteina localizzata nel nucleo; ha dei domini capaci di legare DNA o di creare interazioni proteina-
proteina, anche se la sua funzione è ancora da scoprire. Ciò che sappiamo è che PML forma particolari
strutture all’interno del nucleo, i nuclear bodies (NB); PML recluta altre proteine sui nuclear bodies, come
ad esempio la proteina p53; dunque PML è un cofattore di p53, e agevola p53 nella sua funzione
oncosoppressoria, di controllo dei check-point, favorendo l’arresto della crescita, l’apoptosi, etc.

Si ritiene dunque che la proteina PML-RARα determini un doppio dominante negativo:

è dominante negativo su RARα;
è dominante negativo su PML e sul suo ruolo di cofattore di p53 (e probabilmente anche di
numerose altre proteine), e quindi sul funzionamento di questa proteina nel regolatore di crescita,
sopravvivenza e altre funzioni.
In un certo senso possiamo inquadrare questa condizione come un particolare esempio del modello dei due
hits di Knutson; un’unica lesione genetica determina 2 hits genetiche, uno su PML e uno su RARα, con la
creazione di un’unica proteina chimerica, che però va a disturbare nelle loro funzioni entrambe le proteine
normali, cioè la funzione differenziativa di RARα e quella di oncosoppressore di PML. Il fatto che questa
mutazione sia così presente nella leucemia promielocitica è dovuta al fatto che conferisce un vantaggio
selettivo alla cellula che la acquisisce, tramite un meccanismo darwiniano.
In una cellula, possiamo immaginare che ci siamo molte mutazioni casuali, ma soltanto quelle che
conferiscono un qualche vantaggio alla cellula vengono selezionate. Probabilmente nelle cellule leucemiche
si rompono tanti geni, tanti cromosomi: quindi se si rompe RARα, si disturba il buon funzionamento di
RARα, mentre se si rompe PML si disturba il buon funzionamento di PML; se però avviene la t(15;17), con
formazione del gene chimerico PML-RARα, si ha un’alterazione potentissima che disturba con un solo
evento due geni importanti; statisticamente poi è più probabile che si formi una sola mutazione, piuttosto che
si verifichino due mutazioni contemporaneamente, anche se nel caso della t(15;17) con una sola mutazione si
ottengono due alterazioni funzionali; abbiamo pertanto una selezione positiva per la cellula che presenta
questo tipo di alterazione, proprio in quanto non va più incontro ad apoptosi, senescenza, differenziamento,
etc., e questa cellula diventa leucemica.

Terapia le conoscenze genetiche di questa malattia hanno reso la sua cura un problema quasi risolto; in
genere infatti si riesce a far guarire i pazienti affetti. Il riarrangiamento disturba la funzione transattivante del
recettore dell’acido retinoico (anche se probabilmente questa funzione non si perde del tutto completamente),
e soprattutto aggiunge al RAR il peptide che recluta istone-deacetilasi sulla cromatina, ma lascia intatta la

77
capacità di questo recettore di legare l’acido retinoico. Si è visto che se si somministrano massicce dosi
farmacologiche di acido retinoico (dosi µM, anziché dosi nM quali sono presenti fisiologicamente
nell’organismo), si riesce a sovvertire il blocco funzionale operato dalla proteina dominante negativa. Ciò
succede per due motivi:
1. si favorisce l’attività dell’allele sano del recettore dell’acido retinoico, che non è stato disturbato
dalla traslocazione, nella competizione stechiometrica che si instaura tra RARα sano e PML-RARα;
2. si intercetta la funzione di PML-RARα che porta al reclutamento di istone-deacetilasi.
Per questo doppio motivo, si è visto che usando dosi farmacologiche di acido retinoico su queste cellule
leucemiche, si riesce a forzare il blocco differenziativo e a trasformare i promielociti (che scompaiono dal
sangue e dal midollo del paziente) in cellule differenziate (neutrofili).
Teoricamente l’acido retinoico potrebbe potenziare anche l’effetto dominante negativo; in realtà, nonostante
il processo biochimico non sia stato ancora del tutto ben chiarito, probabilmente si realizza una competizione
nella stessa proteina chimarica tra la capacità della porzione PML di reclutare istone-deacetilasi e quella
della parte sostanzialmente intatta del recettore dell’acido retinoico di reclutare istone-acetilasi. Inoltre gioca
un ruolo importante anche il recettore dell’acido retinoico intatto, che compete con PML-RARα sul sito di
legame con il DNA.

Come spesso succede nelle terapie antineoplastiche, anche in quelle specifiche a bersaglio mirato come
questa, le cellule tumorali trovano un modo per evadere la terapia, in quanto fanno mutazioni che le rendono
resistenti al trattamento. I pazienti affetti da AML e trattati con acido retinoico tendono a fare mutazioni nel
recettore RAR, in particolare a livello della proteina chimerica PML-RARα, che non le permette più di
legare l’acido retinoico, e di conseguenza queste cellule non rispondono più a questo trattamento terapeutico;
inoltre dobbiamo tener presente che la malattia è dovuta sia all’alterazione funzionale di RAR che
all’alterazione di PML nel coordinare p53, e questo secondo aspetto non è regolato dall’acido retinoico.
Esiste però la possibilità di superare questa problematica terapeutica: si è pensato che il modo più efficace
per provare a curare questa malattia sia eliminare la proteina chimerica PML-RARα, proteina tossica per
l’organismo che interferisce con la funzione sia di RAR che di PML; poiché almeno fino ad oggi non è
possibile risolvere la traslocazione, possiamo eliminare la proteina con l’arsenico, o meglio con il triossido di
arsenico; si tratta di una sostanza tossica, in quanto interferisce con i gruppi -SH (sulfidrilici) di molte
proteine, favorendone la degradazione via proteasoma. Questo composto però presenta una particolare
predilezione per la proteina PML-RARα; si è osservato infatti che a dosi terapeutiche, e quindi non
eccessivamente tossiche, di triossido di arsenico, è possibile accelerare la degradazione mediante proteasoma
della proteina PML-RARα in misura maggiore della corrispondente proteina wild-type.
Pertanto con la somministrazione, in molti casi sequenziale, di acido retinoico prima e, quando la malattia
non risponde più, un approccio un po’ più tossico mediante il triossido di arsenico, il problema clinico di
questa malattia risulta perlopiù risolto.

AML-M2
Le altre alterazioni cromosomiche che causano AML, anche se in genere sono meno conosciute, sono
comunque simili a quanto accade per l’APL, in quanto vanno tutte nella stessa direzione, ovvero la creazione
di geni chimerici, e dunque proteine chimeriche che intercettano fattori trascrizionali importanti per il
differenziamento.
Spesso nella AML forma M2, ovvero la forma
mieloblastica con accenni di maturazione,
abbiamo la traslocazione 8:21.
In questo caso entra in gioco un diverso fattore
trascrizionale, di cui si conosce molto meno
rispetto a RAR; questo fattore si chiama CBF
(Core Binding Factor), ed è un eterodimero
formato da due proteine codificate da due geni
localizzati su cromosomi differenti, ovvero il
cromosoma 21 e il cromosoma 16.
La proteina codificata sul cromosoma 21 si
chiama CBFα; come spesso accade, questo gene
ha molteplici nomi: infatti CBFα è anche indicato
con altri nomi, cioè RUNX1 o AML1. Questa

78
proteina costituisce la componente che lega il DNA in corrispondenza di sequenza consenso su promotori
specifici. CBFβ invece è più semplice; questa proteina è codificata da un gene sul cromosoma 16, e coadiuva
con CBFα nel legame con il DNA per eseguire la sua funzione di induttore trascrizionale; mentre CBFα è
coinvolto nella t(8:21) di M2, CBFβ è coinvolto invece nell’alterazione cromosomica tipica di M4.
Il complesso trascrizionale CBFα/CBFβ è un complesso che funzionalmente svolge funzioni molto simili al
recettore RAR; ragionevolmente però la sua azione si esplica in cellule diverse, o comunque in stadi
maturativi diversi nelle cellule della linea mieloide, e ciò determina uno stadio maturativo di arresto diverso
nella M2 rispetto alla M3. Questo complesso attiva un programma genetico di soppressione tumorale in
quanto:
favorisce il differenziamento;
arresta la proliferazione delle cellule mieloidi in maturazione;
favorisce la senescenza.
Un esempio di geni target del complesso sono:
i ‘partner’ di p53, ovvero p21, che è un effettore, e p14, che è un attivatore di p53;
TGFα e TGFβ che inducono l’arresto proliferativo, l’apoptosi e il differenziamento delle cellule
mieloidi;
CEBPα, master gene del differenziamento mieloide, la cui importanza è riscontrabile anche nelle
mutazioni puntiformi che avvengono in alcune leucemie.
Quindi sia in M2, dove c’è una t(8:21), che colpisce CBFα che sta
sul cromosoma 21, che nella M4, dove invece abbiamo una
inversione sul cromosoma 16 che colpisce quindi CBFβ, si avrà
un mal funzionamento del complesso trascrizionale CBFα/CBFβ;
sicuramente non è solo questa alterazione a promuovere la
leucemogenesi, altrimenti non si spiegherebbe il diverso fenotipo
delle due malattie.
In particolare, nel caso di M2, la traslocazione determina la
formazione di un gene chimerico, che si ha fondendo il gene
CBFα (che sta sul cromosoma 21) con un altro gene, anonimo fino
all’individuazione e caratterizzazione di questa traslocazione,
chiamato ETO (Eight Twenty One), formando il gene chimerico
AML1-ETO.
Lo stesso gene, con un partner di fusione diverso, è anche
coinvolto in altre leucemie linfatiche acute diverse da M2; quindi
evidentemente CBFα deve essere un gene piuttosto importante
nella regolazione del differenziamento delle cellule emopoietiche,
e non specificamente delle cellule mieloidi, come si può rilevare in particolari forme di leucemia linfatica
acuta dei linfociti B.

CBFα il gene CBFα wild type presenta due domini, uno di legame al DNA e un altro di attivazione
trascrizionale. In M2 il gene si rompe a livello della regione che regola la trascrizione, e si fonda con il gene
ETO, creando così il gene chimerico AML1-ETO; anche in questo caso, la porzione funzionale di
regolazione della trascrizione di CBFα è disturbata dalla traslocazione, e pertanto il meccanismo è simile a
quanto avviene nella traslocazione che genera PML-RARα.
Normalmente, il complesso CBFα/CBFβ è un fattore trascrizionale che regola la crescita, la trascrizione ed il
differenziamento, reclutando istone-acetilasi che aprono la cromatina per permettere la trascrizione genica; la
proteina chimerica invece, come per PML-RARα, a causa del peptide ETO che si aggiunge alla proteina
recluta corepressori che richiamano istone-deacetilasi, formando un complesso che compete con le istone-
acetilasi, e di conseguenza la cromatina e gli istoni rimangono deacetilati e quindi compatti; pertanto, così
come PML-RARα funge da dominante negativo di RARα, AML1-ETO lo è di AML: laddove la proteina
normale funzionava da regolatore del differenziamento, ora la proteina chimerica agisce come repressore del
differenziamento e, per qualche motivo (dovuto forse ad altre mutazioni genetiche), favorisce l’arresto
maturativo delle cellule in una fase determinata, cioè la fase mieloblastica con inizio del differenziamento.

Terapia mentre nel caso di PML-RARα il recettore coinvolto era RAR, dunque in qualche modo una
proteina che può fungere farmacologicamente da bersaglio terapeutico tramite la somministrazione di alte
dosi di acido retinoico (questo infatti ha offerto una possibilità terapeutica importante, perlomeno in prima

79
linea), nel caso di M2 il meccanismo patogenetico appare analogo, ma il fattore trascrizionale disturbato non
è un recettore per ligandi fisiologici o farmacologici noti, e quindi in questo caso il concetto di bloccare la
proteina che disturba il fattore trascrizionale con un ligando, in modo da favorire il differenziamento, non è
applicabile.
Esistono però delle possibilità farmacologica anche in questo caso; infatti anche in M2 sono coinvolti degli
enzimi di rimodellamento della cromatina: l’esecuzione del blocco differenziativo è infatti dovuto al fatto
che la proteina lega altre proteine, che infine legano degli enzimi, e sono proprio questi enzimi gli effettori
terminali del blocco maturativo, in quanto rimuovono i gruppi acetili degli istoni e fanno compattare la
cromatina. Quando sono coinvolti degli enzimi, essi presentano per definizione dei siti attivi, ovvero dei siti
che fisiologicamente legano dei substrati e servono al funzionamento dell’enzima stesso, ed è possibile agire
su questi siti per bloccarne l’azione; si sono pertanto elaborati degli inibitori farmacologici competitivi
dell’enzima istone deacetilasi per inibire il compattamento della cromatina.
Dal punto di vista terapeutico, la malattia non è trattata in modo molto specifico, poiché non bersagliamo la
proteina malata ma il meccanismo generale di controllo della trascrizione, e quindi andiamo a disturbare in
modo più consistente l’omeostasi di molti tessuti che normalmente necessitano dell’istone deacetilasi; però
dobbiamo tener conto che il paziente con AML è un paziente grave, e pertanto gli effetti terapeutici risultano
maggiori degli effetti collaterali.
Gli inibitori dell’istone deacetilasi non sono ancora registrati, ma sono in sperimentazione molto avanzata
per questo tipo di malattia.

AML-M4eo
Nella leucemia M4eo (mielomonocitica con eosinofilia) è coinvolto lo
stesso complesso di M2; l’alterazione cromosomica non riguarda però
più CBFα, bensì CBFβ. Anche in questo caso ciò che accade è molto
simile, con la differenza i due break point marcano tutti e due sullo
stesso cromosoma, ovvero il cromosoma 16.
L’inversione e la traslocazione sono avvenimenti che si verificano
abbastanza spesso nei tumori: a volte i geni traslocano da un cromosoma
all’altro, altre volte traslocano sullo stesso cromosoma in quanto esso si
rompe in due punti, e il frammento poi si inverte; i due punti in cui il
cromosoma si è rotto possono determinare la fusione di due geni, come
nel caso del cromosoma 16 per M4: dunque la malattia è causata da due
geni chimerici che si trovano entrambi sullo stesso cromosoma. Nel caso
del cromosoma 16, i due geni codificano uno per CBFβ (il partner di
CBFα) e l’altro per una catena della miosina; si forma così un gene
chimerico CBFβ-MYH. Non possediamo i dettagli biochimici di questa
proteina, ma ragionevolmente anche questa proteina patologica, un po’
come accade per AML-ETO nel caso di t(8:21), funge da dominante
negativo di CBFβ, e alla fine le due alterazioni determinano l’inefficacia
del complesso CBFα/CBFβ e quindi del differenziamento di queste cellule, naturalmente in modo diverso,
altrimenti non si spiegherebbe il differente fenotipo di M2 e M4.

AML-M5
Un ulteriore esempio di queste traslocazioni cromosomiche che sono strettamente collegate con una
determinata AML, anche se non sempre sono necessariamente presenti in quella patologia (solo PML-RARα
è infatti specificamente correlato a M3 ed è sempre presente), è quello che si verifica in M5, cioè l’AML con
prevalente differenziazione monocitaria.
Come si può rilevare dalla classificazione della WHO, certe forme di leucemia possono essere secondarie a
chemioterapia, ovvero svilupparsi dopo anni rispetto al trattamento chemioterapico per trattare una
precedente neoplasia primaria; il trattamento chemioterapico danneggia infatti il DNA. I danni da
chemioterapici in particolare sono generalmente traslocazioni che colpiscono il braccio lungo del cromosoma
11; nel caso di M5, il cromosoma 11 è sempre coinvolto, però presenta molti partner genetici diversi su vari
altri cromosomi: sono stati mappati per il momento addirittura una settantina di diversi riarrangiamenti del
cromosoma 11 insieme ad altri cromosomi e geni.

80
Sebbene i geni partner della traslocazione possano essere vari, è
importante sottolineare che il gene coinvolto sul cromosoma 11 è
sempre lo stesso; come del resto avviene anche per altri geni (tra cui
RUNX1), questo gene si può trovare nelle leucemie linfatiche oltre che
mieloidi, e per questo motivo è stato chiamato MLL (leucemia a lineage
misto): infatti si può trovare sia in forme di leucemia mieloidi che
linfoidi. Questa traslocazione, per quello che attualmente sappiamo, non
fa eccezione rispetto a quello descritto per PML-RARα e CBF: anche in
questo caso infatti è coinvolta una proteina che regola la trascrizione.
MLL, il gene disturbato da questa traslocazione, regola la trascrizione ad
un livello leggermente diverso rispetto a quanto accade per PML-RARα
o CBF: MLL infatti non è un fattore di trascrizione, ma è uno di quegli
enzimi che modificano la struttura della cromatina; in questo caso
specifico, il processo coinvolto non è l’acetilazione, bensì la metilazione. MLL infatti è un istone metilasi, in
particolare metila la lisina 4 sull’istone H3; questo tipo particolare di metilazione, analogamente a quanto
accade con l’acetilazione, è un evento che apre la cromatina e favorisce la trascrizione.
A seguito della traslocazione, indipendentemente dal tipo di traslocazione, se si analizza la struttura di MLL
rileviamo che costantemente quella che si perde è la porzione enzimatica di MLL, e di conseguenza viene
meno la capacità di metilare la lisina 4 in zone specifiche della cromatina quando ci sono dei fattori
trascrizionali con i quali MLL interagisce, e quindi si perde la capacità di attivare la trascrizione di geni che
presumibilmente sono coinvolti nel differenziamento e nell’arresto proliferativo. Anche in questo caso si
genera una proteina chimerica, che non funziona più e che quindi porta alla perdita da parte della cellula
della capacità di coordinare un programma genetico differenziativo. Quello che si è osservato, inoltre, è che
in un modo ancora non del tutto chiaro si possono attivare geni che sono pro-proliferazione e pro-
trasformazione neoplastica, come ad esempio l’oncogene Myc (fattore trascrizionale) coinvolto anche nei
linfomi, e in particolare nel linfoma di Burkitt; in seguito alla fusione con vari geni (come Myc, Bcl, CDK6)
si può determinare infatti una trascrizione aberrante.

Mutazioni puntiformi nelle AML

Oltre alle traslocazioni o inversioni cromosomiche, ci sono anche altre alterazioni geniche che causano
AML; queste altre alterazioni si ritrovano in un gruppo distinto nella classificazione del WHO, e sono
coinvolte in AML che presentano una prognosi più aggressiva.
Dunque nelle AML non ci sono solo traslocazioni cromosomiche, ma anche mutazioni puntiformi; queste in
alcuni casi sono concomitanti, o meglio cooperano, con le alterazioni cromosomiche descritte in precedenza,
e un esempio è proprio la leucemia promielocitica acuta; in altri casi si trovano mutazioni puntiformi anche
in assenza delle traslocazioni cromosomiche trattate in precedenza, ma anche se mancano queste alterazioni
cromosomiche più frequente non è detto che non ce ne siano altre, che non sono state ancora rilevate.

Questo settore della genetica molecolare dei tumori, e in particolare delle leucemie, è letteralmente esploso
negli ultimi anni grazie ai progetti di analisi massiva del genoma delle cellule tumorali, e si stanno scoprendo
tuttora molte alterazioni genetiche; ci sono però molte altre alterazioni che non conosciamo. Numerose
alterazioni sono alterazioni cariotipiche, e quindi rilevabili dall’osservazione dei cromosomi tramite l’analisi
del cariotipo, cioè tramite metodiche di analisi semplici; inversioni, traslocazioni e mutazioni puntiformi più
subdole non si vedono osservando i cromosomi, ma si scoprono e si scopriranno con il sequenziamento dei
cromosomi.
In ogni caso, esistono anche mutazioni puntiformi nelle AML, e alcune di queste hanno un cattivo significato
prognostico, mentre altre no. Sono stati scoperti in particolare tre geni che sono colpiti da mutazioni
puntiformi nell’AML:
• mutazioni di CEBPα, fattore trascrizionale buona prognosi;
• mutazioni di NPM (nucleofosmina), una proteina nucleare buona prognosi;
• mutazioni di geni che codificano per le tirosino-chinasi cattiva prognosi.
La diversa prognosi è dovuta probabilmente al fatto che i primi due geni assomigliano funzionalmente ai
geni descritti in precedenza nelle traslocazioni cromosomiche, ovvero proteine nucleari che regolano
differenziamento e crescita, e quindi causano la leucemia ma non portano a leucemie molto aggressive; nel
caso di leucemie aggressive invece abbiamo mutazioni di geni che vanno ad attivare oncogeni e quindi
stimolano la proliferazione e l’espansione clonare.

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CEBPα è un fattore trascrizionale; presenta due domini, uno di attivazione della trascrizione e l’altro di
legame al DNA. È coinvolto nel differenziamento mieloide e in particolare granulocitario, ed è uno di quei
geni la cui espressione è controllata in modo positivo, cioè è stimolata, dai fattori trascrizionali RAR e CBF,
e quindi risulterà disturbata sia dalla proteina PML-RARα che da AML-ETO; queste due proteine
chimeriche hanno un ruolo importante nella leucemogenesi, senza però determinare un comportamento
particolarmente aggressivo della neoplasia.

NPM in modo analogo, un altro gene trovato mutato nella leucemia che non ha specificità, nel senso che
non c’è una correlazione specifica genotipo-fenotipo, è il gene NPM; questo gene codifica per una piccola
proteina nucleare, localizzata soprattutto nel nucleolo, che si chiama nucleofosmina, e che la cui funzione
normale agisce sul pathway di p53. La funzione non è ben conosciuta; si ritiene però che la proteina sia in
grado di aumentare il funzionamento della proteina p14ARF, nello specifico determinandone un aumento dei
livelli.
p14ARF è una proteina labile nelle cellule, ma NPM la stabilizza e ne prolunga l’emivita. ARF a sua volta
stimola positivamente p53, in quanto inibisce l’ubiquitino-ligasi MDM2 che degrada p53, il quale tende
quindi ad accumularsi; con questo circuito pertanto NPM favorisce l’attività di p53.
Nelle leucemie quindi può essere disturbato anche un altro pathway di p53; infatti oltre a mutazioni dirette di
p53, a oncoproteine dei virus oncogeni a DNA che bloccano p53, alla perdita di funzione di ARF (che fa si
che MDM2 degradi p53), possiamo anche avere la perdita di funzione di NPM, che a sua volta attiva ARF;
quest’ultimo, bloccando MDM2, permette l’accumulo di p53, che serve a governare l’arresto proliferativo,
oppure l’apoptosi anche delle cellule mieloidi in caso di stress, danno o comunque un problema che fa si che
sia meglio eliminare queste cellule piuttosto che lasciarle dividere.

Tirosino-chinasi oltre a mutazioni puntiformi che presentano una buona prognosi, abbiamo anche AML
dovute a mutazioni puntiformi che invece manifestano una prognosi più aggressiva; si tratta di mutazioni che
colpiscono, più che i geni che regolano il differenziamento e l’arresto proliferativo, geni che disregolano la
capacità mitotica delle cellule e consentono di andare incontro a proliferazione autonoma. In gran parte dei
casi, queste mutazioni colpiscono geni che codificano per i recettori tirosino-chinasi, oppure in qualche altro
caso non colpiscono direttamente i recettori tirosino-chinasi ma uno degli effettori, tra cui i più importanti
sono le proteine della famiglia RAS.
Nelle AML possiamo trovare mutazioni attivanti dei recettori tirosino-chinasi di membrana, come KIT e
FLT3, oppure meno frequentemente mutazioni in RAS, e più specificamente l’isoforma di RAS che si trova
più spesso mutata in leucemia è N-RAS (mentre K-RAS si trova più frequentemente mutato nelle neoplasie
epiteliali).
Trattando queste mutazioni più aggressive, passiamo dal settore degli oncosoppressori a quello degli
oncogeni.

KIT KIT è un recettore di membrana con attività tirosino-chinasi; il suo ligando è costituito da un fattore
di crescita chiamato SCF, Stem Cell Factor (anche se negli anni ha assunto vari nomi); come appunto
suggerisce il nome di SCF, fisiologicamente il sistema KIT-SCF è un sistema importante per l’espansione di
alcuni compartimenti staminali.
KIT in particolare è importante per:
• melanogenesi (sviluppo melanociti);
• spermatogenesi (gametogenesi maschile);
• emopoiesi.
L’importanza di KIT è stato dimostrato in topi knock-out per KIT: essi risultano essere albini (poiché non
hanno i melanociti), sterili (non hanno gli spermatozoi) ed inoltre hanno problemi di emopoiesi.
Nell’AML le mutazioni di KIT sono frequentemente accompagnate dalle traslocazioni cromosomiche
spiegate in precedenza, ad esempio t8:21 (AML-ETO) o inv16 (CBFβ-MYH) in M2 e M4eo rispettivamente,
e ciò detta una prognosi più severa. Le mutazioni di KIT sono eterogenee, e quelle che hanno un ruolo nella
leucemogenesi sono tutte mutazioni attivanti.

FTL3 è un recettore che appartiene alla stessa famiglia di KIT; è chiamato così in quanto assomiglia ad
una tirosino-chinasi associata ad un retrovirus. Anche questo recettore è importante per il mantenimento

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della staminalità sia dei precursori mieloidi che linfoidi; il suo ligando è chiamato FTL3-ligando, o FLT3L.
Le mutazioni di FTL3 si associano a mutazioni precedentemente trattate sia a traslocazione cromosomiche.
Come nel caso di mutazioni di KIT, anche le mutazioni di FTL3 dettano una prognosi peggiore; in questo
caso la mutazione è più frequente, infatti FLT3 è mutato nel 30% delle AML, soprattutto insieme con PML-
RARα, AML-ETO, NPM1 e CEBFα. Le mutazioni di FLT3 sono attivanti, in quanto colpiscono quelle
porzioni del dominio tirosino-chinasico che esercitano funzioni di regolazione; il dominio chinasico infatti
può essere mantenuto aperto o chiuso, quindi attivo o inattivo, da una zona flessibile detta loop di
attivazione.
In assenza di ligando, il loop di attivazione normalmente è chiuso, inattivando la chinasi, perché interagisce
con porzioni adiacenti alla porzione N-terminale; fisiologicamente, quando arriva il ligando di FTL3, questo
recettore dimerizza, c’è un cambio allosterico del dominio chinasico e l’activation loop si apre. Nelle
situazioni patologiche invece ci sono delle mutazioni che colpiscono il loop di attivazione o il dominio
proteico con il quale il loop di attivazione interagisce per chiudere il dominio enzimatico; il loop di
attivazione pertanto non può più chiudersi, e quindi a prescindere dalla disponibilità del ligando il dominio
catalitico di FLT3 rimane sempre attivo e dunque è in grado di attivare la cascata trasduzionale nelle cellule
leucemiche.
Dal punto di vista biologico pertanto queste cellule leucemiche diventano delle cellule incontrollabili; da un
lato esse hanno delle lesioni genetiche che non le permettono di differenziare e di reagire ad uno stress
oncogenico, e dall’altro hanno una lesione genetica che le spinge nella proliferazione.

FLT3 e KIT sono chinasi; di conseguenza, è possibile cercare di inibire questi enzimi con uno di quei
composti che entrano nella tasca patologicamente aperta e riescono ad inibire la chinasi; inibitori di FTL3
sono in corso di studio, anche se non sono ancora una realtà attualmente utilizzata (siamo ancora a livello di
trial clinici), mentre un buon inibitore di KIT esiste già, ed è proprio il composto utilizzato per la leucemia
mieloide cronica, cioè l’Imatinib. Questi composti analoghi all’ATP infatti non sono troppo specifici, e nel
caso dell’Imatinib questa parziale specificità diviene un beneficio: infatti questo farmaco è anche un buon
inibitore di KIT, e quindi efficace nelle leucemie mieloidi acute in cui ci sia una mutazione di KIT (sebbene
associata ad altri interventi terapeutici, in quanto l’AML ha anche un blocco di differenziamento, e gli
approcci terapeutici non possono essere delle monoterapie).

Neoplasie linfoidi

Le neoplasie emopoietiche possono interessare anche il ramo che porta alla formazione dei linfociti; nella
grande maggioranza dei casi la cellula colpita dalle neoplasie linfoidi è un linfocita, in particolare il linfocita
B: infatti più dei tre quarti delle neoplasie del sangue che interessano il compartimento linfoide colpiscono il
linfocita B; evidentemente il linfocita B ha qualche problema nella sua fisiologia che rende questa cellula
particolarmente propensa ad andare incontro a trasformazione neoplastica. Peraltro le neoplasie linfoidi sono
dal punto di vista epidemiologico un argomento più importante, poiché i circa 3/4 delle neoplasie del sangue
interessano il compartimento linfoide.
Lo schema generale di classificazione delle neoplasie linfoidi è molto simile a quello delle neoplasie
mieloidi; anche in questo caso abbiamo:
leucemie linfatiche acute (ALL), quando ci sono molto blasti periferici (>20%);
leucemie linfatiche croniche (CLL), quando ci sono cellule sostanzialmente differenziate.
Oltre però a queste due divisioni, nel caso delle neoplasie linfoidi il discorso è più ampio; infatti la neoplasia
linfoide, oltre a localizzarsi sotto forma di leucemia nel sangue, può anche manifestarsi come infiltrazione
dei tessuti solidi (in particolar modo i linfonodi), ed allora prende il nome di linfoma.
I linfomi sono divisi in due grosse categorie:
• linfoma di Hodgkin (HL);
• linfoma non Hodgkin (NHL);
questa è la classificazione tradizionale; la base biologica di questa classificazione adesso risulta piuttosto
fragile, e anche se esistono alcune differenze morfologiche e anatomopatologiche tra le due forme, ci sono
dei linfomi che presentano caratteristiche intermedie; le differenze che hanno permesso di differenziare
queste due grandi categorie in passato rientrano perlopiù in ambito clinico.
Oltre alla leucemia acuta e cronica e ai i linfomi Hodgkin e non Hodgkin, abbiamo un ulteriore tipo di
neoplasia che colpisce anche’essa il compartimento linfoide, ma più che colpire i linfociti B colpisce le
plasmacellule. Proprio per la particolarità del tipo cellulare coinvolto e per la particolarità clinica di colpire

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il midollo osseo, questo tipo di neoplasia viene distinta dalle altre neoplasie linfoidi ed è chiamata mieloma,
o mieloma multiplo (MM).
In conclusione dunque, le leucemie di tipo linfoidi vengono differenziate in leucemie acute o croniche,
linfomi Hodgkin e non Hodkgin e mielomi.
Queste differenze però non sono sempre così nette, e possono essere considerate piuttosto delle prevalenze;
infatti nello stesso paziente si può passare da un tipo di malattia all’altra: ad esempio la leucemia linfatica
cronica in pratica non è distinguibile da un linfoma, più nello specifico da un particolare tipo di linfoma
chiamato linfoma a piccoli linfociti B. In effetti leucemia linfoide cronica e linfoma a piccoli linfociti B
designano la stessa malattia: in qualche paziente questa malattia si trova prevalentemente nel sangue, mentre
in qualche altro paziente si trova perlopiù nei linfonodi; questo forse è il caso più eclatante dell’impossibilità
di attuare una classificazione netta tra queste due categorie. D’altro canto, è possibile che forme che nascono
come linfomi poi diventino delle leucemie, soprattutto linfomi di tipo aggressivi quali i linfomi di Burkitt o il
linfoma diffuso a grandi cellule B; perfino il mieloma multiplo nelle fasi più aggressive e più avanzate può
diventare una leucemia plasmacellulare.
Dunque non ci sono limiti netti fra le varie categorie; la divisione delle neoplasie linfoidi in leucemie linfoidi
(acuta e cronica), linfomi (HL e NHL) e mieloma non è una classificazione vera e propria, ma un sommario
descrittivo. La vera classificazione dell’organizzazione mondiale della sanità è molto complicata per
l’eterogeneità delle malattie:

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La WHO separa le leucemie linfoidi in tre grosse categorie; la classificazione della WHO mantiene il
linfoma di Hodkgin separato per il suo aspetto morfologico e clinico particolare e per il sequenziale il
coinvolgimento dei linfonodi, anche se però biologicamente questo linfoma non è molto diverso dagli altri, e
poi individua le neoplasie del sistema linfoide in neoplasie che colpiscono le cellule B dalle neoplasie che
colpiscono le cellule T.
Abbiamo molte tipologie di neoplasie che colpiscono le cellule T, ma queste hanno una bassa frequenza; le
neoplasie che colpiscono le cellule B sono anch’esse diverse, tra cui abbiamo la leucemia linfatica acuta a
cellule B e la leucemia linfatica cronica a cellule B (che sono i tipi più frequenti rispettivamente di ALL e

85
CLL). La leucemia linfatica cronica a cellule B si manifesta anche come un linfoma a piccoli linfociti B, ma
si tratta sostanzialmente della stessa malattia.
Infine i linfomi vengono differenziati dalla classificazione della WHO soprattutto dal punto punt di vista
morfologico; c’è però anche una base genetica che sostiene questa classificazione.
Abbiamo numerosi tipi di linfomi, di cui i più importanti sono:
linfoma follicolare,, un linfoma dei linfociti B, poco aggressivo;
linfoma diffuso a grandi cellule B (DLBCL, diffuse large B cell linfoma), che è invece un linfoma
molto aggressivo;
linfoma di Burkitt;; è un linfoma a cellule B molto raro, ma che ha una base eziopatogenetica molto
ben nota.
La classificazione della WHO è molto articolata; lo schema semplicesemplice è invece: neoplasie a linfociti B (più
frequenti) o a linfociti T; entrambi questi gruppi poi possono essere ulteriormente suddivisi in leucemia
(acutica o cronica), linfomi (HL e NHL), e infine il mieloma multiplo, cioè una neoplasia plasmacellulare.
plasmacellulare
Il grosso delle neoplasie emopoietiche sono quelle dei linfociti, in particolare quelle dei linfociti B;
questo diagramma a torta rappresenta la frequenza delle neoplasie linfoidi in generale:

Neoplasie linfoidi

Linfoma non Hodgkin (63%)

Linfoma Hodgkin (8%)
Leucemia linfatica cronica (9%)
Leucemia linfatica acuta (4%)
Mieloma multiplo (16%)

Come si osserva dal diagramma, più della metà delle neoplasie linfoidi sono rappresentate dai linfomi non
Hodgkin (più del 60%); poi abbiamo una porzione piuttosto consistente (circa il 10% dei casi) che è
rappresentato dal linfoma di Hodgkin; un’analoga distribuzione è quella della leucemia linfatica cronica;
croni c’è
poi una fetta più piccola, data dalla leucemia linfatica acuta; infine abbiamo il mieloma multiplo, che ha una
frequenza intermedia.
In ordine di frequenza decrescente, abbiamo dunque:
linfomi non Hodgkin;
mieloma multiplo;
leucemia linfatica cronica
ica e linfoma di Hodgkin;
leucemia linfatica acuta;

Possiamo ulteriormente suddividere queste categorie; questo diagramma illustra la distribuzione dei linfomi
non Hodgkin:

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Se dunque ad esempio consideriamo i linfomi non Hodgkin, osserviamo che una proporzione ragguardevole,
poco meno di 1/3, è rappresentato dal linfoma diffuso a grandi cellule B; una proporzione analoga è
rappresentata dal linfoma follicolare, che dunque insieme al DLBCL rappresenta circa la metà dei linfomi
non Hodgkin.
Le patologie linfoidi sono pertanto piuttosto frequenti nell’ambito del sistema emopoietico; in particolar
modo più spesso è il linfocita B ad essere protagonista della trasformazione neoplastica. Non è difficile
ipotizzare il motivo, anche sulla base di alcune delle aberrazioni cromosomiche che sono presenti in queste
malattie: ad esempio, nel linfoma di Burkitt c’è una traslocazione che colpisce i geni delle immunoglobuline,
che si vanno a fondere con altri geni partner modificandone la funzione. Il linfocita B è infatti una cellula
intrinsecamente propensa a fare mutazioni, in particolare un certo tipo di mutazioni, vale a dire le
traslocazioni cromosomiche; questo in quanto il linfocita B per svolgere la sua attività deve diventare una
plasmacellula e sintetizzare le immunoglobuline, e per produrre le Ig deve possedere un meccanismo
intrinseco di instabilità genetica che gli consenta di effettuare le tre fasi genetiche sequenziali nelle
costruzione dei geni delle Ig: prima la ricombinazione VDJ, poi una volta migrato nel centro germinativo
l’ipermutazione somatica (che serve a sviluppare l’affinità per l’antigene della porzione variabile delle Ig) e
infine lo switch di classe che serve a produrre le IgG, IgA e IgE.
Tutti questi meccanismi sono meccanismi o di ricombinazione genica (ricombinazione VDJ, switch di
classe) o di mutazione puntiforme (ipermutazione somatica), cioè si tratta di meccanismi regolati di danno
del DNA; si è però osservato che il linfocita B purtroppo può commettere degli errori in questo percorso di
riarrangiamento dei geni delle Ig, e per sbaglio invece di riarrangiare i geni delle Ig correttamente, riarrangia
insieme ai geni delle Ig altri geni, disturbando la funzione di questi ultimi. La cellula che ha effettuato questo
riarrangiamento aberrante è poi soggetta alla selezione clonale; l’alterazione funzionale dei geni partner
determina la linfomagenesi e la trasformazione neoplastica.
La sede dove ragionevolmente succede questo accumulo di alterazioni genetiche, e quindi la generazioni
delle cellule B trasformate, è rappresentato dal centro germinativo dei linfonodi; qui i linoficiti B naïve, che
non hanno visto ancora l’antigene e hanno incominciato a effettuare la ricombinazione VDJ, passano
aspettando l’antigene per poter compiere l’ipermutazione somatica, e dunque sviluppare l’affinità delle loro
catene variabili per l’antigene, e infine lo switch di classe; questi ultimi due meccanismi (ipermutazione
somatica e switch di classe) sono coordinati dall’enzima AID (activation induced deaminase). Questi
processi che inducono variabilità genomica possono però fare errori e determinare, invece del
riarrangiamento e dell’evoluzione dei geni delle immunoglobuline, una mutazione genica.

Nel percorso maturativo dei linfociti B, il processo di leucemogenesi o linfomagenesi può iniziare a vari
livelli.

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Per quanto riguarda le leucemie linfatiche acute, si nota che esse dal punto di vista genetico non sono molto
diverse dalle leucemie mieloidi, poiché sono cellule ancora molto immature, e pertanto si tratta di cellule
piuttosto indifferenziate; date le caratteristiche delle cellule neoplastiche coinvolte, e osservando soprattutto
l’analisi del riarrangiamento delle Ig, si ritiene che gran parte delle leucemie linfatiche acute dei linfociti B
(B-ALL), essendo per definizione acute e quindi costituite prevalentemente da blasti, partono da linfociti B
naïve, cioè cellule pre-linfonodo e pre-centro germinativo.
Una volte che queste cellule migrano nel linfonodo e nel centro germinativo, qui esse effettuano
l’ipermutazione somatica e lo switch di classe, e diventano cellule bersaglio della linfomagenesi; queste
cellule infatti sono quelle che generano la maggior parte dei linfomi, di cui i più importanti sono il linfoma
diffuso a grandi cellule B e il linfoma follicolare (per l’ampia diffusione), e il linfoma di Burkitt e di
Hodgkin (per il meccanismo patogenetico). Queste cellule linfomatose sono cellule neoplastiche; in queste
cellule, se si va a studiare il riarrangiamento dei geni delle Ig, si osserva che è avvenuta la ricombinazione
VDJ, e stanno effettuando l’ipermutazione somatica e in alcuni casi anche lo switch di classe, da cui si
deduce pertanto che esse partono dal centro germinativo.
Infine, quando i linfociti B hanno sviluppato alta affinità per l’antigene e tornano nel midollo, in attesa che
arrivi l’antigene per poter organizzare la risposta plasmacellulare, anche a questo stadio i linfociti B possono
essere colpiti dal trasformazione neoplastica; le plasmacellule sono infatti le cellule bersaglio del mieloma
multiplo. Le plasmacellule sono dunque il punto di partenza del mieloma multiplo, neoplasia che interessa il
midollo osseo, il microambiente delle plasmacellule.
Schematizzando, possiamo dire che la leucemia linfatica acuta parte dal pre-linfonodo, i linfomi partono dai
linfonodi, mentre i mielomi partono dalle plasmacellule e quindi dal midollo; per quanto riguarda la
leucemia linfatica cronica, l’inquadramento dell’origine è invece più complesso; la CLL può infatti originare
a vari livelli: in certi casi, come accade nella leucemia linfatica acuta, le cellule leucemiche CLL possono
partire dalla cellula B immatura midollare pre-linfonodo; in altri casi, la B-CLL deriva da cellule B del
centro germinativo, o anche da cellule B della memoria.

Siti fragili è sempre risultato poco chiaro quale sia il meccanismo con cui si selezionasse il gene partner
del riarrangiamento; si potrebbe pensare che alla base di questo processo ci sia un meccanismo casuale, ma
evidenze recenti sembrano sostenere il contrario: ci sarebbe infatti una certa propensione al riarrangiamento
di certi geni, e questo meccanismo sostiene ulteriormente il motivo per cui proprio il linfocita B sia una
cellula con alta propensione ad andare incontro a trasformazione neoplastica.
Si conosce da tempo che nel genoma degli eucarioti, i cromosomi contengono delle regione fragili, ovvero
regioni particolarmente propense ad andare incontro a rottura, e come conseguenza della rottura a successivo

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riarrangiamento e a ricombinazione; fino a poco tempo era conosciuta solo una categoria di siti fragili del
genoma, cioè quelli che il più delle volte sono localizzati in regioni cromosomiche particolari, per esempio
all’interno di geni piuttosto grandi, oppure all’interno di sequenze contenenti particolari strutture secondarie:
siccome si tratta di geni particolarmente grossi e disturbati dalla presenza di strutture secondarie, ciò
comporta che la DNA polimerasi non sia in grado di duplicare bene queste regioni, e quindi queste zone in
qualche caso sono solo parzialmente duplicate nella fase S e possano arrivare nella fase M quando non sono
state ancora duplicate del tutto, ed in questa fase possono essere forzati a fratturarsi. Questi sono i siti fragili
classici; essi sono correlati al cancro, in quanto sono siti in cui mappano geni che si è visto essere coinvolti
nel processo di cancerogenesi.
Da poco invece si è scoperta una seconda categorie di zone fragili dei cromosomi (siti fragili di seconda
generazione), che sono localizzate in regioni del genoma che si replicano presto, in quanto sono
particolarmente dense di origini di replicazione; queste zone hanno caratteristiche di sequenza nucleotidica
diverse rispetto ai siti fragili classici, e soprattutto tendono a fratturarsi più facilmente poiché si trovano in
regioni dei cromosomi che sono attivamente trascritte, e quindi nelle quali è più facile che si realizzino dei
conflitti tra il sistema di trascrizione e quello di duplicazione dei geni; questo può favorirne la fragilità e la
rottura.
Questa scoperta molto recente ha illuminato quello che probabilmente succede nei linfociti B; i linfociti B
infatti sono delle cellule che replicano molto velocemente, e sono fra le cellule più rapide a nel moltiplicarsi
fra le cellule dei vari tessuti del nostro organismo, in quanto devono formare rapidamente le plasmacellule; i
linfociti B hanno poi delle regioni cromosomiche particolarmente trascritte, poiché devono produrre le Ig e
svolgere altre funzioni.
Si è osservato pertanto che i linfociti B hanno una doppia suscettibilità alla trasformazione neoplastica: da
un lato riarrangiano frequentemente le Ig, per svolgere in maniera efficiente il loro compito immunitario;
dall’altro presentano in modo particolarmente spiccato molte zone fragili del genoma, in quanto hanno una
duplicazione veloce e inoltre possiedono alcuni geni, particolarmente le Ig, che sono trascritti massivamente:
quindi è piuttosto frequente che si rompano i geni delle Ig o altri geni, proprio perché le cellule B possiedono
un’elevata densità di siti fragili di seconda generazione.
Pertanto, nel corso del loro sviluppo, i linfociti B possono acquisire facilmente mutazioni, e avere il genoma
ricco di fratture, quindi di riarrangiamenti cromosomici e traslocazioni cromosomiche.

Fisiopatologia 22/03/13 Santoro

Per quanto riguarda le neoplasie del sistema linfoide, il dettaglio relativo ai meccanismi patogenetici ci
sfugge ancora in gran parte; le informazioni che possediamo però sono congruenti con il principio generale
che le neoplasie linfoidi sono particolarmente frequenti nell’ambito delle neoplasie del sangue, e in
particolare lo sono quelle colpiscono i linfociti B. Ragionevolmente questo è legato ad una combinazione di

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motivi: da una parte i linfociti B sono cellule che riarrangiano con meccanismi diversi e che esprimono ad
alti livelli i geni per le immunoglobuline, quindi possiedono dei geni che sono propensi a riarrangiare,
proprio per il fatto che per espletare la loro funzione fisiologica devono compiere questo processo; dall’altra
rileviamo che i geni delle immunoglobuline possono trovare (probabilmente soprattutto nei linfociti B) dei
partner di fusione, cioè degli altri geni con cui ricombinare in traslocazioni cromosomiche - poiché anche
geni che non appartengono al gruppo dei geni delle Ig si possono riarrangiare in tutte le cellule, soprattutto i
geni che mappano nelle zone fragili del genoma - ed è possibile che queste zone siano particolarmente
propense a riarrangiarsi in cellule, quali i linfociti B, che hanno alti ritmi dei trascrizione genica e alti ritmi
proliferativi: quando c’è molta trascrizione, è più facile che ci siano collisioni tra la RNA polimerasi e la
DNA polimerasi, e questo favorisca la rottura di geni; inoltre l’elevato ritmo proliferativo, intrinseco
anch’esso nel ruolo dei linfociti B, determina una maggiore propensione delle zone fragili del genoma a
riarrangiare; forse è la combinazione di questi due parametri (immunoglobuline e altri geni fragili nel
genoma) che fa sì che queste lesioni genetiche possano occorrere, e possano occorrere in particolar modo nei
linfociti B.

Le leucemie, in grossa approssimazione, partono soprattutto dalle cellule B naïve, cioè quelle che precedono
l’arrivo nei linfonodi e la maturazione coordinata dall’interazione con l’antigene; questo è sicuramente vero
per la leucemia acuta a cellule B, ed è probabilmente vero anche per una parte delle leucemie croniche a
cellule B. I linfomi invece originano sostanzialmente nei linfonodi, nei centri germinativi, dove avviene
l’ipermutazione somatica e poi lo switch di classe; quindi il linfoma diffuso a grandi cellule B, il linfoma
follicolare ed altri, come il linfoma di Hodgkin, probabilmente originano a questo livello. Il mieloma
multiplo è invece una neoplasia che parte dalle plasmacellule. Non è però così semplice individuare l’origine
delle neoplasie del sistema linfoide; per esempio, non possiamo inquadrare in modo netto l’origine della
leucemia linfatica cronica: infatti è possibile, ed è stato accertato, che certi tipi di leucemia linfatica cronica
in alcuni pazienti partano da cellule più mature, e di ciò ce ne si può rendere conto in quanto si osserva che
queste cellule hanno già effettuato i riarrangiamenti dei geni delle immunoglobuline, e in certi casi hanno
effettuato addirittura l’ipermutazione somatica.
Sappiamo relativamente poco delle lesioni molecolari che caratterizzano le leucemie linfatiche, mentre
invece sappiamo qualche cosa di più per quanto riguarda le lesioni genetiche che caratterizzano i linfomi, in
cui si verifica un riarrangiamento dei geni delle immunoglobuline,.

Leucemia linfatica acuta

La leucemia linfatica acuta è una condizione che parte dai linfociti B indifferenziati, cioè da cellule midollari
che sicuramente non hanno visto ancora l’antigene, e anzi non hanno nemmeno effettuato ancora la
ricombinazione VDJ; si tratta pertanto di cellule abbastanza prossime alle cellule staminali del
compartimento linfoide. Come accade anche per le altre leucemie acute che colpiscono il sangue, cioè quelle
della serie mieloide, anche la leucemia linfatica acuta si contraddistingue per la presenza di cellule
indifferenziate, cioè i blasti; queste cellule si caratterizzano per un rapporto nucleo-citoplasma molto elevato,
caratteristico di cellule indifferenziate: ci sono cellule che sono costituite quasi esclusivamente da nucleo con
cromatina dispersa, con uno strato molto sottile di citoplasma.
Il quadro sintomatologico e clinico è poco specifico, come nel caso delle leucemie mieloidi acute; nei
pazienti con ALL abbiamo infiltrazione da parte delle queste cellule indifferenziate del midollo, quindi c’è
una sofferenza delle altre linee cellulari: questi soggetti infatti soffrono di anemia, trombocitopenia,
predisposizione alle infezioni (in quanto c’è meno sviluppo della linea granulocitaria), con espansione di
tutto il compartimento emolinfopoietico. Una nota particolare di questa leucemia, tra le malattie del sangue
discusse in precedenza, è quella che più caratteristicamente colpisce pazienti giovani; le leucemie mieloidi,
invece, sono generalmente più tipiche dei soggetti adulti o anziani.

Basi molecolari on abbiamo molte informazioni sulle basi molecolari della leucemia linfatica acuta, e
ancora meno sulla leucemia linfatica cronica, la quale risulta ancora un po’ misteriosa proprio dal punto di
vista della cellula d’origine; in ogni caso, anche la leucemia linfatica acuta non fa eccezione alla regola
generale delle leucemie acute: così come accade per le leucemie mieloidi acute, si tratta di una malattia che
per manifestarsi è ragionevole sia necessario avere sia lesioni genetiche che bloccano la maturazione delle
cellule e che le fanno rimanere indifferenziate, sia lesioni molecolari che spingono queste cellule immature
verso una proliferazione eccessiva, in maniera tale che si sviluppi una leucemia. Quindi, le poche

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informazioni che abbiamo sulla patogenesi della leucemia linfatica acuta si inscrivono in questo schema
generale.
Le cellule leucemiche della ALL sono sostanzialmente indifferenziate, quindi non abbiamo una forte
specificità di lesioni molecolari; infatti le lesioni molecolari sono abbastanza simili a quelle che troviamo
nella leucemia mieloide acuta e cronica, non solo per il fatto che le lesioni bloccano il differenziamento e
stimolano la proliferazione, ma addirittura i geni coinvolti spesso sono gli stessi.
Nella leucemia linfatica acuta, soprattutto nei casi pediatrici, troviamo frequentemente riarrangiamenti del
gene RUNX1, che si trova sul cromosoma 21, conosciuto come AML1 o anche CBFα (core binding factor α),
che è coinvolto in alcune forme di leucemia mieloide acuta. In questo caso il riarrangiamento che ne inficia
la funzione, con un meccanismo analogo al riarrangiamento AML/ETO (presente nella leucemia mieloide
acuta M2), in genere non avviene con il gene ETO, ma con un altro gene, il gene TEL (ETV6), situato sul
cromosoma 12. La t(12;21) è un altro esempio di traslocazione cromosomica con la generazione di un
prodotto proteico chimerico che ragionevolmente, come nel caso della traslocazione AML/ETO (anche se il
partner di fusione è diverso) inficia il funzionamento del fattore trascrizionale AML e ne impedisce la
capacità di coordinare il differenziamento; questo fattore dunque deve essere fisiologicamente importante
anche nel caso del lineage linfoide e non solo nel caso del lineage mieloide.
La somiglianza con le leucemie mieloidi acute va oltre questo parallelismo, in quanto in altre leucemie
linfatiche acute delle cellule B, invece di trovare questa traslocazione cromosomica, spesso, soprattutto nelle
leucemie linfatiche acute che insorgono in bambini molto piccoli, o addirittura nelle forme neonatali di
leucemia linfatica acuta (70% dei casi), si trovano traslocazioni cromosomiche che colpiscono il braccio
lungo del cromosoma 11, inficiando quello stesso gene che modifica la cromatina, il gene MLL, che è
coinvolto anche nella leucemia mieloide acuta M5.

Oltre a queste traslocazioni, nella leucemia linfatica acuta troviamo altre lesioni genetiche che
ragionevolmente compromettono sia il differenziamento, sia l’arresto proliferativo correlato al
differenziamento.
Parlando della leucemia mieloide cronica e della sua evoluzione blastica quasi inevitabile se manca un
intervento terapeutico, abbiamo detto che a volte questa evoluzione blastica è diretta, stranamente, verso la
linea linfoide piuttosto che verso la linea mieloide; adesso cominciamo a conoscere alcune delle lesioni
molecolari che troviamo in questa progressione neoplastica, che indirizza o verso la leucemia mieloide acuta
oppure verso la leucemia linfatica acuta, con delle differenze tra i due tipi di evoluzione. Quei geni che
controllano o la sintesi di fattori trascrizionali che servono in qualche modo al differenziamento linfoide, o
che controllano il ritmo proliferativo delle cellule (e che quindi servono a determinare l’arresto proliferativo,
che è strumentale alla differenziazione terminale), cioè quegli stessi geni che si ritrovano mutati nella
progressione della leucemia mieloide cronica a leucemia linfatica acuta, certe volte si trovano mutati anche
nelle leucemie linfatiche acute de novo, cioè che non derivano da una leucemia mieloide cronica preesistente.
Ad esempio, è ragionevole che se il gene p16 è importante nella fisiologia del linfocita per determinare
l’arresto in G1 del ciclo cellulare, in modo tale che questo linfocita possa andare in contro al
differenziamento, la mutazione di questo gene può sia favorire l’evoluzione di una leucemia mieloide acuta
in linfatica acuta sia causare una leucemia linfatica acuta senza che ci sia alla base una leucemia mieloide
cronica preesistente.
Possiamo quindi avere:
mutazioni inattivanti p16INK4A/p14ARF (50%);
mutazioni inattivanti IKAROS (50%), fattore di trascrizione linfoide;
mutazioni inattivanti PAX5 (50%), fattore di trascrizione linfoide.

L’analogia tra leucemie linfatiche acute che insorgono sulla base di una mieloide cronica e leucemie
linfatiche acute de novo va oltre queste mutazioni, in quanto essendo leucemie acute, c’è bisogno di blocco
differenziativo e di stimolo proliferativo; in alcuni casi, lo stimolo proliferativo nelle leucemie linfatiche
acute, in particolare nelle leucemie linfatiche acute degli adulti (mentre invece nelle forme pediatriche si
trovano più spesso le lesioni di p16, IKAROS e PAX5), deriva dal cromosoma Philadelphia, cioè dalla
traslocazione BCR-ABL. Quindi ancora una volta abbiamo una convergenza dei meccanismi molecolari della
leucemia linfatica acuta, sia come progressione della leucemia mieloide cronica oppure come leucemia
linfatica acuta de novo.
Il cromosoma Philadelphia è presente nel 35% dei casi di B-ALL nell’adulto e nel 5% dei casi pediatrici di
B-ALL. Il cromosoma Philadelphia dunque si può trovare in una percentuale significativa delle leucemie

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linfatiche acute a linfociti B degli adulti e, in questo caso, è proprio identico al cromosoma Philadelphia che
troviamo nella leucemia mieloide cronica, cioè il breakpoint è esattamente lo stesso, e si genera pertanto una
proteina chimerica uguale a quella della CML; qualche volta però, un po’ meno frequentemente, il
cromosoma Philadelphia si trova anche nelle forme pediatriche di leucemia linfatica acuta, e in questi casi
abbastanza spesso, nonostante i geni coinvolti siano sempre gli stessi (BCR e ABL), il punto di rottura
(breakpoint) del gene BCR è diverso, in genere leggermente più N-terminale rispetto a quello che troviamo
nel cromosoma Philadelphia classico. Questo genera una proteina chimerica un po’ più piccola, più tipica
della leucemia linfatica acuta rispetto alla leucemia mieloide cronica, e in particolare più caratteristica delle
forme pediatriche di leucemia linfatica acuta; anche se non conosciamo bene il motivo per cui il breakpoint
sia differente, e dunque la proteina chimerica risulta più piccola, questa caratteristica è molto importante, in
quanto i clinici e gli ematologi utilizzano questa variante del gene chimerico BCL-ABL come marker
molecolare per caratterizzare la patogenesi della malattia.

In ogni caso nelle forme pediatriche di B-ALL questo cromosoma Philadelphia ‘atipico’, cioè che ha un
breakpoint diverso, è piuttosto raro; le ALL che non hanno questo cromosoma Philadelphia dovranno però
avere comunque qualche lesione genetica che stimoli la proliferazione. È infatti importante sottolineare che
nelle leucemie linfatiche acute c’è bisogno, per avere una malattia così tumultuosa caratterizzata da cellule
che proliferano vigorosamente, che ci sia contemporaneamente un blocco differenziativo e uno stimolo
proliferativo. Lo stimolo proliferativo certe volte deriva da BCR-ABL e altre volte, quando non c’è BCR-
ABL, questo stimolo è generato tramite meccanismi simili, cioè grazie a mutazioni o riarrangiamenti che
colpiscono recettori o tirosino-chinasi che sono in grado anch’essi di attivare pathway di trasduzione del
segnale che stimolano la proliferazione cellulare:
riarrangiamenti di ABL;
riarrangiamenti di JAK2;
riarrangiamenti di EPO-R;
riarrangiamenti di PDGF-RB;
riarrangiamenti di FTL3.
Numerosi di questi geni sono coinvolti nella leucemia acuta di tipo mieloide, e addirittura in sindromi
mieloproliferative croniche.

Leucemia linfatica cronica

La leucemia linfatica cronica è la forma di leucemia più frequente, soprattutto nell’adulto; nonostante ciò,
purtroppo sappiamo abbastanza poco di questa patologia, che rimane una malattia abbastanza misteriosa
anche per quanto riguarda la cellula d’origine. Nel caso della leucemia linfatica cronica, c’è sicuramente
un’eterogeneità fenotipica e quindi genotipica; pertanto le caratteristiche che descriviamo sono
necessariamente imprecise, in quanto bisognerebbe avere delle analisi più accurate per individuare qual è la
cellula target da cui parte un particolare caso di leucemia linfatica cronica, e con quali mutazioni quel tipo di
leucemia correla. Bisognerebbe pertanto suddividere la CLL in sottogruppi e quindi caratterizzare ogni
singolo sottogruppo, ma le attuali conoscenza non sono ancora così sviluppati da consentire di effettuare
questa operazione.
La CLL è un tipo di leucemia particolarmente frequente, molto diversa dalla leucemia linfatica acuta; questa
patologia, un po’ come avviene per le leucemie mieloidi, è più frequente negli individui adulti, soprattutto
negli anziani, e leggermente più frequente nei maschi rispetto alle femmine.
Non sappiamo nemmeno molto bene quale sia il linfocita colpito: in certi casi sembra proprio che sia un
linfocita midollare, cioè quello pre-linfonodo che però ha già effettuato la ricombinazione VDJ, mentre in
altri casi nelle cellule leucemiche invece si trova anche la presenza della maturazione dei geni delle
immunoglobuline, quindi deve trattarsi di un linfocita B che ha già effettuato l’ipermutazione somatica ed è
pronto a diventare plasmacellula; sicuramente perciò queste due condizioni devono essere malattie diverse,
poiché le cellule di origine sono molto differenti.

Quadro clinico la leucemia linfatica cronica è una malattia poco specifica da un punto di vista clinico;
come accade in generale nelle leucemie, anche in questo caso abbiamo una massiccia espansione di una parte
del compartimento bianco, con una forte linfocitosi (spesso maggiore di 4.000/mm3). La malattia è molto
subdola e lenta, e spesso i pazienti convivono con questa malattia per 10-15 anni; pertanto si tratta di una
patologia che è anche difficile da individuare. I pazienti possono presentare una massiccia espansione del
compartimento emolinfopoietico, quindi linfoadenopatia, linfomegalia, splenomegalia, epatomegalia e, nelle

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forme più avanzate, un quadro di aplasia midollare, cioè di sofferenza midollare in seguito a infiltrazione di
queste cellule neoplastiche che assomigliano molto ai linfociti, con conseguente leucopenia, anemia e
trombocitopenia.

Patogenesi da studi molto recenti pubblicati quest’anno di analisi genomica sistematica del genoma delle
cellule neoplastiche, tramite metodiche di sequenziamento massivo del genoma, si è finalmente affrontato il
problema di caratterizzare le lesioni genetiche della leucemia linfatica cronica, e il quadro che comincia ad
emergere è abbastanza complesso. Fino a questo momento, non si sono trovate lesioni che correlano con la
specificità cellulare dei linfociti, cioè non troviamo i riarrangiamenti dei geni delle immunoglobuline, che
sono tipici ad esempio dei linfomi; sicuramente però ci troviamo di fronte a un quadro complesso, nel senso
che sembra proprio che la malattia insorga sulla base di disordini molecolari che colpiscono diversi pathway
di trasduzione del segnale:
pathway del BCR (RAS);
pathway della DDR (ATM, p53);
pathway della maturazione dell’RNA (SF3B1);
modificazione della cromatina (MLL);
pathway di NFkB;
pathway di WNT.
A volte ci sono delle lesioni molecolari che non sono molto diverse da quelle osservate nella leucemia
linfatica acuta e nella leucemia mieloide acuta, che coinvolgono ad esempio geni che codificano per enzimi
deputati al controllo dell’organizzazione della cromatina, come quelli che agiscono metilando gli istoni (gene
MLL); spesso si trovano poi mutazioni di geni coinvolti nella risposta al danno al DNA, quali p53 e le
chinasi che sono sensori del danno.
Il pathway dell’RNA è un argomento totalmente nuovo, la cui importanza sarà sicuramente messa in rilievo
nei prossimi anni; studiando la leucemia linfatica cronica, si è scoperto che certe volte nei tumori, nelle
neoplasie (e in particolare nella CLL), oltre ai geni classici coinvolti nella patogenesi tumorali, quali gli
oncogeni e i geni oncosoppressori, possono essere coinvolti dei pathway che in precedenza non si sospettava
potessero essere oncogenici. Ad esempio, nella leucemia linfatica cronica (ma non solo) si trovano spesso
mutazioni di enzimi che sono coinvolti nello splicing della maturazione dell’RNA messaggero; in linea di
principio è possibile che la maturazione dell’RNA messaggero possa essere un pathway coinvolto in
oncogenesi, ma la sfida sarà scoprire quali sono gli RNA messaggeri che subiscono questo difetto
funzionale, e che quindi contribuiscono alla leucemogenesi.

Qualche volta ci sono invece delle mutazioni che sono più caratteristiche del lineage delle cellule B; ad
esempio, si possono trovare mutazioni in geni che sono coinvolti nel pathway di trasduzione del segnale a
valle del recettore delle cellule B (anche se le componenti a valle del BCR non sono comunque specifiche
della leucemia), e a volte si trovano mutazioni del pathway di trasduzione del segnale di NFκB, che è un
pathway molto spesso coinvolto nella leucemogenesi e linfomagenesi.
Questo è un sistema di trasduzione del segnale un po’ diverso rispetto a quello classico, costituito dalla
sequenza fattore di crescita tirosino-chinasi attivazione della via RAS-MAP chinasi, e così via; si tratta
di un pathway che fisiologicamente è importante in molte cellule, ma in particolar modo nei linfociti, in
quanto si trova a valle di una serie di citochine, come ad esempio anche il TNF, ed è un pathway che
sostanzialmente culmina con l’attivazione di una famiglia di fattori trascrizionali (di cui il primo identificato
è stato chiamato REL, ed è una delle 5 proteine classificate in questa famiglia che, in buona approssimazione,
possiamo chiamare fattori NFκB) che, quando attivati, entrano nel nucleo e legano sequenze consenso
specifiche su geni bersaglio, attivando risposte biologiche molto complesse che, sostanzialmente, sono pro-
oncogeniche, in quanto ci sono geni coinvolti nella proliferazione cellulare, nel blocco dell’apoptosi e geni
coinvolti nell’immortalizzazione e nell’evasione dalla senescenza.
Questi fattori trascrizionali responsivi a NFkB (fattori NFκB), tra cui REL, ricevono il segnale dai recettori
di membrana per citochine attraverso un meccanismo di trasduzione del segnale un po’ più complesso,
diverso da quello classico delle tirosino-chinasi: in questo caso il fattore trascrizionale è normalmente
segregato nel citoplasma grazie al legame con inibitori (inibitori di NFκB, o IκB) che lo bloccano nel
citoplasma, non consentendogli l’ingresso nel nucleo, e quindi esso non può agire come fattore trascrizionale
pro-oncogenico; questa inibizione avviene normalmente nella cellula a riposo, cioè nella cellula non
stimolata da citochine e non neoplastica. Fisiologicamente, il meccanismo si sblocca quando il recettore di
membrana, per esempio il recettore del TNF, riconosce il ligando e attiva una chinasi, chiamata chinasi

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dell’inibitore di NFκB (IKK) che fosforila IkB, il quale una volta fosforilato è avviato alla degradazione
proteolitica mediante proteasoma; in questo modo il fattore trascrizionale è liberato dal suo inibitore, trasloca
nel nucleo e svolge la sua attività; in realtà questa è la via classica di attivazione del pathway di NFκB, ma ci
sono anche delle vie alternative.
Questo sistema, a vari livelli di questa cascata, è però frequentemente coinvolto in leucemogenesi e
linfomagenesi; infatti mutazioni di questo sistema si trovano non solo nella leucemia linfatica cronica, ma
anche piuttosto frequentemente in linfomi (mutazioni del pathway di NFkB è presente in circa una metà dei
casi di linfoma diffuso a grandi cellule B, ma è frequente anche nel linfoma di Hodgkin) e nel mieloma
multiplo. Infine, questo sistema è anche coinvolto nella linfomagenesi associata al virus di Epstein-Barr, in
quanto l’oncoproteina principale di questo virus complesso, la proteina LMP1, è un attivatore di NFκB.
Quindi nella CLL abbiamo molte mutazioni, in molti sistemi diversi e con poca specificità; in comune con
altri linfomi però vi è un particolarmente frequente coinvolgimento del sistema di trasduzione del segnale di
NFkB.

Come avviene spesso, le malattie un po’ più misteriose sono quelle che portano alle scoperte più innovative;
comincia ad emergere infatti il concetto che anche la maturazione, cioè lo splicing dell’mRNA, può essere un
pathway oncogenico.
Un’altra peculiarità della leucemia linfatica cronica è che ha consentito la scoperta di una categoria di geni
completamente nuovi, coinvolti in trasformazione neoplastica: si tratta di geni che non codificano per
proteine, ma per RNA regolatori dell’espressione genica; oggi sappiamo però che questi geni non sono
coinvolti solo nella leucemia linfatica cronica, ma anche in altre neoplasie. Questi geni codificano per dei
piccoli RNA, chiamati microRNA; nel nostro genoma ci sono infatti moltissimi geni, il cui numero preciso
non è ancora noto con esattezza, che codificano per proteine, ma c’è anche una vasta parte del genoma che
non codifica direttamente per proteine e che è stata comunque fortemente conservata nell’evoluzione, e
quindi deve avere qualche funzione importante di tipo regolatorio. Si è scoperto da qualche anno che parte di
questo genoma non codificante per proteine codifica per piccoli RNA, che si chiamano miRNA o
microRNA, i quali non sono utilizzati direttamente per la sintesi proteica (come gli mRNA), ma regolano
l’espressione genica, in quanto hanno la capacità di appaiarsi, con il meccanismo della complementarietà
delle basi di Watson e Crick, con degli RNA messaggeri e, associandosi a questi RNA messaggeri, ne
bloccano la traduzione oppure ne favoriscono la degradazione, e quindi ne bloccano l’espressione genica.
Questi microRNA quindi sono degli importanti regolatori dell’espressione genica, ed esistono dei microRNA
che controllano l’espressione anche dei geni coinvolti in trasformazione neoplastica; ci sono dunque degli
oncogeni che codificano per microRNA e non per proteine, e ci sono anche dei geni oncosoppressori che
codificano per microRNA. Il ruolo e l’importanza di questi miRNA, che sta assumendo un sempre maggiore
rilievo per numerosissime neoplasie, sono stati scoperti proprio nella leucemia linfatica cronica, in quanto si
è visto che in questa leucemia spesso c’erano delle delezioni di una particolare regione del cromosoma
13(13q14).
Dopo la rilevazione di questa frequente delezione, c’è però voluto del tempo per scoprire quali fossero i geni
coinvolti, poiché in quella stessa regione vi è un altro gene importante nella progressione neoplastica, vale a
dire RB; quindi inizialmente si pensava che fosse questo il gene coinvolto nella delezione, poi si è scoperto
che non era importante tanto il gene del retinoblastoma, ma lo erano dei geni che codificavano per dei
microRNA (in particolare miR-15 e miR-16) che mappavano in quella regione cromosomica che era deleta
in pazienti affetti da leucemia linfatica cronica; si è sospettato quindi che la delezione di questi geni potesse,
anche se non si trattava di geni codificanti proteine, contribuire alla leucemogenesi, e si è cercato di capire
per quale motivo la delezione del microRNA 15 e del microRNA 16 potesse favorire la leucemogenesi, e in
particolare lo sviluppo di leucemia linfatica cronica; si è poi scoperto che questi microRNA controllano
l’espressione, mediante il meccanismo di appaiamento delle basi, di alcuni oncogeni noti, come Bcl2
(un’importante proteina antiapoptotica) e Myc (un’importante proteina che stimola la proliferazione
cellulare). Questi microRNA, fisiologicamente, si appaiano con gli RNA messaggeri di Bcl2 e di Myc e ne
bloccano l’espressione; pertanto la loro rimozione, nei pazienti con leucemia linfatica cronica che presentano
la delezione di questa particolare regione del cromosoma 13, fa venire meno questo circuito regolatorio e,
indirettamente, attiva l’espressione di oncogeni con funzione antiapoptotica o con funzione pro-mitogenica, e
questo contribuisce alla leucemogenesi.
Sebbene il meccanismo con cui i microRNA partecipano alla leucemogenesi sia particolare, cioè coinvolga
protagonisti diversi (quali appunto i microRNA), esso è importante anche in altre neoplasie; inoltre,
nonostante questo meccanismo è un po’ particolare, insiste comunque sui due geni, Bcl2 e Myc, che sono

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coinvolti anche in altri tipi di leucemie e di linfomi: quindi, con un meccanismo particolare, nella leucemia
linfatica cronica vengono colpiti, in ogni caso, alcuni geni chiave della linfomagenesi.

Linfomi
Nei linfomi, spesso ci troviamo di fronte ad un meccanismo un po’ più semplice di attivazione oncogenica,
che è quello della fusione tra geni delle immunoglobuline e oncogeni. Questo meccanismo è comune a
linfomi quali il linfoma di Burkitt, il linfoma diffuso a grandi cellule B e il linfoma follicolare; quello che
cambia sono invece i geni protagonisti di questo riarrangiamento.

Linfoma di Burkitt
Il linfoma di Burkitt non è un linfoma molto
frequente (costituisce il 2% circa dei linfomi), ma
presenta un quadro patogenetico e eziologico
caratteristico.
È una patologia che coinvolge i piccoli linfociti B
dei centri germinativi in fase di maturazione;
spesso si ha un quadro istopatologico particolare,
chiamato ‘quadro a cielo stellato’, in quanto
ritroviamo un tappeto di linfociti neoplastici,
intervallato da grosse cellule stromali
(probabilmente dei macrofagi reattivi).
Si tratta di una lesione solida, che colpisce
soprattutto i bambini e i giovani adulti; spesso
determina la formazione di una massa
mandibolare o addominale, e infiltrazione
midollare.
Distinguiamo tre forme di linfoma di Burkitt:
forma endemica localizzata nell’Africa equatoriale; è il più comune tumore maligno infantile in
quest’area, e i bambini affetti da questa patologia spesso presentano malaria cronica, che si ipotizza
determini una ridotta resistenza al virus di Epstein-Barr (nel 95% dei linfomi di Burkitt endemici, le
cellule neoplastiche presentano il genoma di EBV);
forma sporadica conosciuta anche come forma non africana; le cellule tumorali hanno un aspetto
simile alle cellule cancerose del linfoma endemico; in questi casi, la positività al genoma di EBV è
di circa il 20%;
forma associata a immunodeficienza è generalmente associata all’HIV o alla terapia
immunosoppressiva post-trapianto.
Il nome di questo linfoma deriva dal fatto che esso fu scoperto da un medico che lavorava in Uganda, il
dottor Burkitt.

Meccanismo patogenetico il linfoma di Burkitt è un

utile modello che esemplifica il meccanismo della
linfomagenesi indotta dalla fusione dei geni delle
immunoglobuline.
Praticamente in tutti i linfomi di Burkitt si riscontra la
presenza di un riarrangiamento dei geni o delle catene
pesanti delle immunoglobuline (più frequentemente) e
quindi del cromosoma 14, oppure, meno frequentemente,
dei geni delle catene leggere κ (in questo caso è coinvolto
il cromosoma 2) o delle catene leggere λ (in quest’altro
caso è coinvolto il cromosoma 22).
Le diverse traslocazioni sono alternative, nel senso che
non si trovano tutte nello stesso caso, ma in un singolo
caso di linfoma di Burkitt è presente un’unica
traslocazione, mentre in casi diversi troviamo
traslocazioni diverse. In ogni caso, nel 100% dei pazienti
con linfoma di Burkitt, un gene che codifica per una catena delle immunoglobuline riarrangia sempre con lo

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stesso cromosoma partner, che è il cromosoma 8, e sul cromosoma 8 il gene coinvolto da questa
traslocazione è costantemente il gene Myc; pertanto questa è una hallmark del linfoma di Burkitt.
La traslocazione più classica è quella 8;14, che coinvolge il gene che controlla la sintesi delle catene pesanti
delle immunoglobuline, situato sul cromosoma 14, e il gene Myc, presente sul braccio lungo del cromosoma
8. La traslocazione 8;14 del linfoma di Burkitt sposta il gene Myc (normalmente situato sul cromosoma 8)
sul cromosoma 14, adiacente (ma senza fusione delle parti codificanti) al gene che controlla la sintesi delle
catene pesanti delle immunoglobuline; non c’è dunque fusione delle porzioni codificanti delle proteine,
quindi in questo caso non si forma una proteina chimerica (come accade ad esempio per BCR-ABL), ma è un
caso il cui i geni partner semplicemente si giustappongono, quindi scaturisce un gene chimerico, ma non una
proteina chimerica, in quanto non è presente fusione delle porzioni codificanti.
L’alterazione funzionale non è data dal cambio della sequenza amminoacidica della proteina Myc, bensì da
un cambio della sua regolazione; come conseguenza di questa traslocazione, la proteina Myc viene
posizionata vicino al promotore trascrizionale del gene delle catene pesanti delle immunoglobuline; questo
promotore trascrizionale nei linfociti B, il cui compito è appunto esprimere i geni delle immunoglobuline, è
fortemente attivo. Ciò determina che la proteina Myc normale, senza che abbia subito un cambio della sua
sequenza amminoacidica, venga massicciamente deregolata e fortemente sovra-espressa; un aumento della
trascrizione di Myc in una cellula favorisce la trasformazione neoplastica.
Non sorprende che il gene Myc, un potente oncogene coinvolto in molte neoplasie, sia sovra-espresso;
troviamo però questa particolare lesione genetica solo nel linfoma, in quanto soltanto nel linfoma (e nello
specifico in quello che parte dai linfociti B) questo tipo di traslocazione è oncogenica: infatti innanzitutto è
piuttosto improbabile che questa traslocazione avvenga in altri tipi cellulari, in quanto i geni delle Ig
riarrangiano solo nei linfociti B, mentre le altre cellule non lo fanno e quindi manca la predisposizione a
questa alterazione genetica; inoltre, anche se si verificasse questa traslocazione, essa non determina
deregolazione dell’oncogene Myc, in quanto il promotore delle Ig nelle cellule diverse dai linfociti B non è
attivo.

Myc era un gene già noto in quanto, come molti oncogeni, è stato scoperto studiando dei retrovirus; in
particolare Myc (v-Myc) era l’oncogene di un retrovirus acuto aviario, il quale causava una forma di
neoplasia emopoietica (che è stata chiamata mielocitomatosi, da qui l’acronimo Myc); oltre ad essere stato
scoperto in quanto presente in alcuni retrovirus acuti, si era inoltre evidenziato che questo gene era il sito di
integrazione di un retrovirus cronico, sempre aviario. I retrovirus acuti sono retrovirus che possiedono un
oncogene, mentre i retrovirus cronici sono retrovirus che non hanno l’oncogene, ma attivano gli oncogeni
per mutagenesi inserzionale, poiché si vanno a inserire nel genoma delle cellule bersaglio; nel caso di Myc, il
retrovirus cronico si inserisce al 5’-terminale del gene Myc, e posizionando in prossimità del gene Myc il suo
promotore trascrizionale (le sequenze LTR) determina nella cellula infettata alti livelli di espressione di Myc.
Lo studio di questi retrovirus aviari, che non sono coinvolti nelle malattie umane, avevano evidenziato non
solo che Myc era un potenziale oncogene, ma in che modo poteva diventare un oncogene, cioè tramite
l’accostamento di un promotore forte: il retrovirus cronico lo fa posizionando accanto le LTR, mentre il
linfoma di Burkitt lo fa traslocando i cromosomi.
Myc normalmente è un gene attentamente regolato; ad esempio, la sua trascrizione è regolata dai fattori di
crescita, tramite la via classica di trasduzione del segnale dei fattori di crescita, il che ci suggerisce che esso è
un gene che normalmente viene attivato quando la cellula è sollecitata a proliferare; si tratta quindi di un
gene coinvolto nel controllo positivo della proliferazione cellulare. È noto che in molte cellule diverse
diversi fattori di crescita, anche i recettori per ormoni nucleari, sono in grado di attivare l’espressione di
Myc; Myc è dunque una proteina che normalmente risponde ai segnali mitogenici, quindi presumibilmente è
coinvolta nei pathway mitogenici, e lo fa in quanto fattore trascrizionale: Myc è una proteina che sta nel
nucleo e che lega il DNA su particolari sequenze di consenso, per esempio a livello dei promotori dei geni
bersaglio; queste sequenze consenso si chiamano E-box, e sono costituite da una sequenza palindromica
(CACGTG).
Myc funziona da fattore trascrizionale in quanto lega, eterodimerizzando, con una proteina della stessa
famiglia chiamata Max; il dimero Myc-Max lega l’E-box e stimola la trascrizione genica. Quindi Myc è
trascritto quando la cellula è stimolata a crescere, e una volta trascritto e prodotto dimerizza con Max e si
posiziona sull’E-box, formando un sistema che è un potente pathway oncogenico in quanto è in grado di
stimolare:

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 • la trascrizione di geni che sostengono la proliferazione cellulare, come i geni necessari per l’entrata
in S (geni per la ciclina D), ma pure geni per le cicline e altre proteine che sono attive in fase S e in
fase M (cicline E, A e B, ma anche CDK4, E2F). Quindi è un potente fattore mitogenico;
• la trascrizione del gene della telomerasi; quindi Myc può anche essere definito un oncogene
immortalizzante, secondo una vecchia classificazione degli oncogeni, in quanto agevola le cellule a
scappare dal fenomeno della senescenza;
• l’angiogenesi tumorale.
Stimolando fortemente la proliferazione cellulare, Myc è in grado di favorire l’accumulo di danni a carico
del DNA; contemporaneamente però, essendo un oncogene immortalizzante (poiché attiva l’espressione
della telomerasi), blocca anche la risposta fisiologica delle cellule all’eccesso di stimolo proliferativo, cioè la
senescenza replicativa: quindi questo oncogene è in grado di stimolare la proliferazione e di togliere i
meccanismi di difesa della cellula dall’eccesso di proliferazione. Myc è dunque un potente oncogene, e
quindi nel linfoma di Burkitt, quando è traslocato sotto il controllo del promotore dei geni delle
immunoglobuline (in particolare quelli delle catene pesanti), gli alti livelli di Myc sono in grado di favorire
la trasformazione neoplastica.

Traslocazioni cromosomiche in altri NHL nel linfoma di Burkitt abbiamo la traslocazione del gene Myc,
che finisce sotto il controllo del promotore delle catene (generalmente quelle pesanti) delle
immunoglobuline; questo meccanismo generale di traslocazione, che si ritrova nel caso del linfoma di
Burkitt (un linfoma poco frequente), lo ritroviamo, ma con protagonisti differenti, anche in altri tipi di
neoplasie delle cellule B, quali il linfoma diffuso a grandi cellule B, il linfoma follicolare e la neoplasia
plasmacellulare (mieloma multiplo).
Il gene delle catene pesanti delle immunoglobuline coinvolto è sempre lo stesso, quindi il cromosoma 14 è
sempre presente in queste traslocazioni; ragionevolmente, il meccanismo comune è dunque sempre lo stesso,
cioè si posizionano geni trasformanti sotto il controllo di un promotore forte nelle cellule B. La differenza
consiste nel fatto che nel linfoma di Burkitt il gene traslocato è Myc (localizzato sul cromosoma 8), mentre
nel caso del linfoma diffuso a grandi cellule B il cromosoma coinvolto (insieme al 14) è il cromosoma 3, e il
gene implicato è dato da Bcl6 (un regolatore della trascrizione); nel linfoma follicolare il cromosoma partner
è il 18, e il gene interessato è Bcl2; inoltre, in una certa quota di casi di mieloma multiplo, il cromosoma
coinvolto è l’11 e il gene implicato è quello della ciclina D. Quindi il linfoma di Burkitt, una rara neoplasia

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frequente soprattutto in Africa, ha rappresentato un modello per capire la patogenesi molecolare di linfomi
più frequenti che hanno un analogo meccanismo patogenetico; la differenza fenotipica tra questi linfomi è
legata al gene specifico coinvolto, la cui espressione viene attivata da queste traslocazioni.
Riassumendo, le traslocazioni cromosomiche nei linfomi non-Hodgkin sono:
IgH-Myc (8;14) (a volte 2,22) linfoma di Burkitt: stimolo mitogenico + EBV;
IgH-Bcl6 (3;14) linfoma diffuso a grandi cellule B (DLBCL): blocco del differenziamento;
IgH-Bcl2 (18;14) linfoma follicolare: blocco apoptosi;
IgH-ciclina D1 (11;14) mieloma multiplo: stimolo mitogenico.

Fisiopatologia 27/03/13 Santoro

La maggior parte delle neoplasie che interessano il sistema linfoide parte ragionevolmente dal linfociti B nei
centri germinativi, ossia i linfociti B che stanno eseguendo la maturazione delle immunoglobuline, in base
anche al contatto con l’antigene, e quindi sono sottoposti alla selezione clonale operata dall’antigene: a
questo stadio le cellule B stanno applicando i meccanismi dell’ipermutazione somatica della porzione
variabile delle immunoglobuline e lo switch di classe, eventi che consentono di diventare linfociti maturi,
cioè che producono immunoglobuline.
Fanno eccezione a questo schema generale le leucemie linfoidi; la leucemia linfatica acuta parte infatti da
cellule B midollari, che sono ancora immature, mentre la cronica risulta meno inquadrabile: probabilmente
infatti esistono diversi sottotipi di leucemia linfatica cronica; in alcuni casi le cellule neoplastiche hanno
caratteristiche fenotipiche che le accomunano alla leucemia acuta, mentre in altri casi presentano
caratteristiche fenotipiche che le assimilano ai linfomi, tanto che ci può essere la possibilità di evoluzione
della forma cronica in linfoma, oppure di forme miste tra leucemia linfatica cronica e linfoma.
La lesione molecolare tipica del linfoma di Burkitt, un linfoma raro e non molto frequente, costituisce il
prototipo di lesioni genetiche presenti anche negli altri tipi di linfoma che conosciamo e nel mieloma; nel
linfoma di Burkitt infatti la lesione molecolare iniziante (in quanto la troviamo sostanzialmente nel 100% dei
casi) è una traslocazione cromosomica o sue varianti, che congiunge i geni che codificano per le
immunoglobuline (nella maggior parte dei casi le catene pensati delle Ig) con un oncogene; non si realizza
però una fusione del porzioni codificanti, ma semplicemente una giustapposizione delle due unità
trascrizionali, cioè quella dei gene delle Ig e quella dell’oncogene Myc: questo fa si che il gene Myc venga
posto sotto il controllo di un promotore trascrizionale e di enhancer trascrizionali particolarmente attivi nei
linfociti B, vale a dire quelli delle Ig; quindi Myc, che è un potente oncogene, viene iperespresso.
Un’alterazione quantitativa dell’espressione di Myc, nel senso di un aumento, contribuisce sicuramente alla
patogenesi del linfoma di Burkitt; tuttavia è abbastanza singolare notare come questo meccanismo
assomiglia molto a quello che usano alcuni retrovirus oncogeni acuti o cronici, che non sono per niente

98
coinvolti con il linfoma di Burkitt, per attivare Myc: anche questi retrovirus posizionano un forte promotore
trascrizionale, in questo caso dato dalle LTR, in prossimità del gene Myc. Quindi già modelli sperimentali di
cancerogenesi virale sottolineavano come Myc fosse un oncogene, e come potesse essere attivato tramite
l’accostamento ad un forte promotore trascrizione.

Negli altri linfomi, il meccanismo generale è analogo, mentre quello che cambia è l’oncogene che troviamo
posizionato accanto al promotore; non si tratta più del gene Myc, ma di Bcl6 nella traslocazione 14;3 del
linfoma diffuso a grandi cellule B, del gene Bcl2 nella traslocazione 18;14 del linfoma follicolare, ed infine
del gene per la ciclica D1 nella traslocazione 11;14 che troviamo associata ad alcuni casi di mieloma
multiplo: dunque è sempre coinvolto il cromosoma 14, e nello specifico il sito su cui mappano le catene
pesanti delle immunoglobuline; quello che cambia però è il partner di fusione, e quindi l’oncogene, che è
localizzato sul cromosoma partner.

L’acronimo Bcl sta proprio per ‘B Cell Linfoma’, ad indicare l’identificazione di questi geni grazie a queste
patologie, in quanto sono stati scoperti proprio in queste traslocazioni cromosomiche e numerati in base
all’ordine di scoperta; la ciclica D1 in realtà è stata inizialmente definita come Bcl1, poiché è stato il primo
gene di cui si è identificato il coinvolgimento in un linfoma B-cellulare, ma è distinta da Blc2 e Bcl6, i quali
essi stessi tra l’altro sono diversi fra di loro. Il prodotto proteico di questi geni ha sostanzialmente funzioni
diverse:
Bcl6 blocco nel differenziamento;
Bcl2 blocco dell’apoptosi;
ciclica D1 stimolo mitogenico.
Quindi, anche se il meccanismo comune è sempre lo stesso, è ragionevole che il fenotipo del linfoma sia
influenzato dalla diversa natura delle proteine codificate dai vari oncogeni coinvolti, comunemente attivati in
maniera quantitativa: in alcuni casi prevale il blocco del differenziamento, in altri la sopravvivenza eccessiva
dei linfociti B in fase di maturazione e in altri casi il superamento del punto di restrizione del passaggio G1-S

Linfoma follicolare
Il linfoma follicolare rappresenta una fetta significativa dei
linfomi NH (circa il 20%).
Questo linfoma è caratterizzato istologicamente dalla
presenza di linfociti B maturi, cioè dei linfociti post-centro
germinativo, in parte dei linfonodi; naturalmente le cellule
neoplastiche possono infiltrare anche altri organi linfatici,
quali milza, fegato o addirittura midollo. Si tratta di una
neoplasia piuttosto indolente, poco aggressiva, anche se in
qualche caso può evolvere in forme più aggressive, come il
linfoma diffuso a grandi cellule B.

Praticamente in tutti casi del linfoma follicolare troviamo

la traslocazione cromosomica reciproca tra i bracci lunghi
del cromosoma 14 e dei cromosoma 18 t(14;18); questa
porta l’oncogene Bcl2 (normalmente situato sul
cromosoma 18) sul cromosoma 14, giustapponendolo al promotore trascrizionale dei geni delle catene
pesanti delle Ig; di conseguenza, nel linfoma follicolare si realizzano alti livelli di espressione di Bcl2.
Questa traslocazione cromosomica determina un linfoma lento e indolente probabilmente per la natura
dell’oncogene coinvolto; Bcl2 è infatti una proteina antiapoptotica: essa controlla a livello della membrana
mitocondriale interna il rilascio del citocromo c, e quindi la formazione del complesso con Apaf e con la
caspasi (apoptosoma) all’interno del citosol nel pathway intrinseco dell’apoptosi; dunque è ragionevole
pensare che la conseguenza dell’iperespressione di Bcl2 sia un rallentamento della morte cellulare dei
linfociti B all’interno del centro germinativo. Quindi non si tratta di una malattia neoplastica in cui troviamo
un forte impulso a proliferare o un blocco nel differenziamento, ma i linfociti semplicemente non muoiono a
causa della resistenza all’apoptosi.

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Linfoma diffuso a grandi cellule B (DLBCL)
Il DLBLC è un linfoma frequente, addirittura più
frequente del linfoma follicolare (costituisce circa il 30%
dei casi di linfoma NH).
Istologicamente si nota che queste cellule soni lievemente
più indifferenziate: le cellule neoplastiche appaiono
grandi, con cromatina dispersa e nucleoli prominenti.
Anche in questo caso possono esserci infiltrazioni di
organi linfatici, spesso quelli associati alle mucose, ad
esempio le placche di Peyer del tratto gastrointestinale.
È un linfoma aggressivo, e questo correla con il fenotipo
cellulare: infatti in genere un maggiore grado di anaplasia
è indice di una maggiore aggressività clinica della
malattia stessa; questo particolare fenotipo è sostenuto
dal particolare gene coinvolto nella traslocazione cromosomica, vale a dire Blc6.

Patogenesi la lesione molecolare caratteristica del linfoma diffuso a grandi cellule B è la traslocazione
cromosomica tra cromosoma 3 e cromosoma 14, t(14;3).
In questo caso il gene Bcl coinvolto è Bcl6, il quale è un gene che regola la trascrizione di una proteina
nucleare con motivi zink-finger che funge da repressore trascrizionale, e dunque blocca la trascrizione dei
geni su cui si ‘siede’, mediante il rimodellando della cromatina (richiama sulla cromatina delle istone-
deacetilasi): i geni bloccati sono geni differenzianti, e dunque questa proteina induce un anti-
differenziamento terminale, e nel contempo essa blocca anche geni che mediano la risposta al danno al DNA
(ad esempio p53, ATM, CHK1, p21, etc.).

100
Fisiologicamente Bcl6 è normalmente espresso dai linfociti B nei centri germinativi, mentre i linfociti stanno
maturando e non devono andare ancora incontro a differenziamento cellulare, e soprattutto non devono avere
una robusta di risposta al danno (altrimenti non riuscirebbero a riarrangiare le immunoglobuline); ciò
consente ai linfociti di attuare questa fase transizionale e di maturare le Ig. Però quando i linfociti escono dal
centro germinativo, fisiologicamente si dovrebbe spegnere l’espressione di Bcl6 affinché i linfociti diventino
plasmacellule.
Nel DLBCL invece viene mantenuta elevata l’espressione di Bcl6, e quindi questo mancato differenziamento
e questa mancata risposta cellulare al danno del DNA è mantenuta patologicamente anche nel linfocita che
invece dovrebbe maturare; il linfocita pertanto non può più maturare poiché presenta questo repressore
trascrizionale attivo, e si avvia a diventare una cellula linfomatosa.
Come in ogni neoplasia aggressiva, la lesione neoplastica iniziante è accompagnata da ulteriori lesioni
genetiche che cooperano con essa; infatti oltre al blocco nel differenziamento dobbiamo avere anche uno
stimolo proliferativo: in associazione all’iperespressione di Bcl6 spesso ci sono mutazioni attivanti del
sistema trasduzionale incentrato su NFkB.

Mieloma multiplo (MM)

Il mieloma multiplo è una neoplasia le cui cellule coinvolte sono le plasmacellule, cioè i linfociti B maturi
che hanno eseguito tutta la fase di maturazione delle Ig; infatti la caratteristica laboratoristica tipica del
mieloma multiplo è la presenza nel sangue dei pazienti di un picco monoclonale di γ-globuline (situazione
differente dalla generalizzata risposta immune con una produzione di molte Ig diverse) legato al fatto che ad
essere colpita dalla lesione genetica che determina la trasformazione neoplastica è un clone plasmacellulare.
Questa iperproduzione monoclonale di γ-globuline contribuisce inoltre al quadro clinico della malattia, in
quanto abbiamo un eccesso di catene leggere rispetto alle catene pesanti (κ o λ a seconda del tipo di
plasmacellula) che vengono liberate nelle urine provocando proteinuria di Bence-Jones.

Quadro clinico il mieloma multiplo costituisce il circa 15% di tutte le neoplasie linfoidi.
Caratteristica dei pazienti con mieloma multiplo è una tetrade sintomatologica peculiare, chiamata CRAB:
calcio;
rene;
anemia;
ossa (bone).
Sostanzialmente infatti i problemi dei soggetti affetti riguardano proprio queste componenti, in particolar
modo le ossa; se osserviamo immagini radiografiche di strutture ossee, ad esempio del cranio, possiamo
notare lesioni osteolitiche, legate al fatto che ci sono plasmacellule che infiltrano il midollo e distruggono
l’osso, oltre ad attivare gli osteoclasti in seguito ad aumentata produzione della citochina RANKL, un
membro della superfamiglia del TNF; ovviamente il problema osseo non è legato solamente al cranio ma a

101
tutto lo scheletro.
L’anemia è dovuta alla sofferenza della produzione midollare fisiologica, sempre a causa dell’infiltrazione
delle plasmacellule.
Inoltre abbiamo un aumento del calcio nel sangue; infatti c’è una forte liberazione di questo elemento in
seguito alla degradazione dell’idrossiapatite da parte degli osteoclasti.
I danni renali sono legati sia alla calcemia sia alla proteinuria di Bence-Jones; quest’ultima è legata
all’eccesso di proteine che vengono secrete dalle cellule neoplastiche. In particolare, la causa più comune di
insufficienza renale provocata dal mieloma multiplo è dato dall’effetto dannoso delle catene leggere delle Ig
verso il tubulo renale.

Questa patologia neoplastica non è molto aggressiva, ma col tempo nella fase centrale può evolvere e
diventare una leucemia plasmacellulare, cioè le cellule non rimangono nel midollo ma vengono a localizzarsi
nel sangue; pertanto il mieloma multiplo, come accade ad esempio anche per la leucemia melodie cronica,
possiede più stadi evolutivi.
Conosciamo un paio di stadi evolutivi del mieloma multiplo: esso infatti può diventare una leucemia
plasmacellulare, che corrisponde allo stadio finale, in cui abbiamo la presenza di plasmacellule nel sangue in
una percentuale superiore al 15%, e inoltre la prognosi è molto severa; il mieloma multiplo però può essere a
sua volta preceduto in alcuni casi da una condizione eterogenea definita come gammopatia monoclonale di
significato incerto, o MGUS (dall’acronimo di Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance).
La MGUS è una condizione patologica caratterizzata dalla proliferazione di un clone plasmacellulare, con
secrezione nel plasma di componente γ-monoclonale in un contesto non riconducibile al mieloma multiplo;
questa condizione è piuttosto frequente, e si riscontra prevalentemente nelle persone anziane (il 3% dei
soggetti sopra i 60 anni presentano MGUS), ma può essere presente anche nei soggetti più giovani (circa
l’1% dei ventenni presenta MGUS). La MGUS si distingue dal mieloma multiplo in quanto l’infiltrato
midollare di plasmacellule è inferiore al 10%, non ci son segni di lesioni ossee, anemia, ipercalcemia e
insufficienza renale legata alla secrezione di γ globuline, e inoltre mancano evidenze di un’altra patologia
proliferativa dei linfociti B.

Piuttosto frequentemente quindi le analisi ematologiche mostrano un picco monoclonale di γ globuline,

senza però avere un quadro conclamato di neoplasia; è molto probabile che questa condizione benigna di
‘incertezza’ del quadro del paziente sia mantenuta durante la vita del soggetto, senza però causare danno.
Però in una piccola percentuale di pazienti (l’1% dei casi di MGUS all’anno) può verificarsi che la
gammopatia monoclonale si qualifichi con il significato di una condizione pre-neoplastica, e evolva
effettivamente in un mieloma multiplo.

Storia naturale delle neoplasie midollari plasmacellulari:

cellule B post-centro germinativo
MGUS
mieloma asintomatico
mieloma (CRAB)
leucemia plasmacellulare.
Il mieloma multiplo ricorda dunque in un certo senso la leucemia mieloide cronica, in quanto presenta una
fase di espansione di cellule differenziate e poi una fase successiva di evoluzione leucemica, e inoltre può
essere preceduta dalla MGUS; la MGUS, così come la fase di esordio del mieloma multiplo, presenta un
quadro asintomatico, cioè senza la comparsa dei sintomi CRAB, e pertanto quando viene rilevata la MGUS
essa individua la persona come potenziale soggetto a rischio, e si consiglia di effettuare il test elettroforetico
una volta ogni 6 mesi, per identificare precocemente un’eventuale evoluzione verso il mieloma multiplo.
Il mieloma multiplo rappresenta dunque un esempio di cancerogenesi multi-step; infatti abbiamo la
progressiva aggiunta di varie lesioni genetiche che completano l’evoluzione maligna di queste cellule.
Alcune di queste lesioni che portano al mieloma non sono state ancora ben caratterizzate; invece uno dei
tumori di cui sappiamo meglio il tipo di lesioni genetiche che portano avanti la progressione neoplastica è il
carcinoma del colon.

Patogenesi tra le lesioni più precoci nel MM ci sono le traslocazioni, di cui la più frequente è la
traslocazione cromosomica reciproca tra il cromosoma 14 e il cromosoma 11 t(14;11), che giustappone il
gene della ciclina D1 con il gene delle catene pesanti delle Ig.

102
Ragionevolmente, in seguito a questo riarrangiamento, in una frazione di casi (circa 1/5) il clone
plasmacellulare va incontro a proliferazione autonoma e comincia a produrre Ig in maniera eccessiva;
inizialmente abbiamo una gammopatia di significato incerto, quindi il clone neoplasico infiltra il midollo per
poi progredire ulteriormente.
Nelle fasi iniziali del mieloma dunque troviamo mutazioni che stimolano la proliferazione, quale appunto la
traslocazione IgH-CycD1; l’importanza dello stimolo proliferativo è confermata dal fatto che in una piccola
parte dei pazienti, anziché essere coinvolto il gene della ciclina D1, è coinvolto un altro gene, vale a dire il
recettore tirosino-chinasico del FGF (FGFR), che viene iperespresso in seguito anch’esso a traslocazione
cromosomica con il gene delle catene pesanti delle Ig, e attiva in maniera impropria la proliferazione
cellulare.
In seguito, a tali lesioni cromosomiche iniziali che producono uno stimolo proliferativo inappropriato si
aggiungono mutazioni a carico di altri oncogeni o oncosoppressori, che ne aumentano l’aggressività:
possiamo avere traslocazioni IgH-Myc, mutazioni attivanti RAS o NFkB, oppure mutazioni inattivanti p53 e
RB.

Terapia il MM è una patologia piuttosto difficile da curare, in quanto è refrattaria alla chemioterapia
classica. Uno dei farmaci che sta avendo risposta migliore, associato comunque a chemioterapia, è un
farmaco che sfrutta una caratteristica fenotipica delle cellule neoplastiche del mieloma, cioè l’eccesso di
produzione di Ig, a vantaggio della terapia: quando c’è un’eccessiva sintesi proteica, le cellule devono
confrontarsi con essa e quindi sono sottoposte a stress e a selezione selettiva; per gestire l’aumentata
produzione di Ig monoclonali improprie, le cellule le devono smaltire efficacemente attraverso il sistema del
proteasoma, che quindi deve essere ben attivo per non determinare sofferenza cellulare a causa dell’eccesso
di sintesi proteica. Il farmaco dunque blocca il proteasoma (manovra molto aggressiva anche per le altre
cellule) .
Il Bortezomib, un inibitore del proteasoma, sfrutta proprio questo meccanismo per indurre stress da eccessiva
sintesi proteica nelle cellule neoplastiche del mieloma multiplo.

Linfoma di Hodgkin
Nelle classificazioni dei linfomi, si utilizza il linfoma di
Hodgkin per definire due categorie: linfoma non-Hodgkin
(NHL) e linfoma Hodgkin (HL); i linfomi studiati fino ad
adesso, vale a dire il linfoma di Burkitt, il linfoma
follicolare e il DLBCL appartengono alla categoria dei
linfomi non-Hodgkin.
Il linfoma di Hodgkin fu scoperto dal patologo inglese
Thomas Hodgkin, da cui ha appunto preso il nome; si tratta
di un linfoma poco frequente, la cui incidenza annuale è di
circa 1 persona su 25.000.
Questo linfoma è molto caratteristico dal punto vista sia
clinico che istologico; la caratteristica istologica

103
fondamentale è la presenza nel tessuto tumorale di scarse cellule neoplastiche e di un fortissimo infiltrato
infiammatorio. Le cellule di Reed-Sternberg, che costituiscono le cellule neoplastica del linfoma, sono date
da linfociti B aberranti che partono dal centro germinativo ma che non vengono eliminati correttamente: le
cellule RS molto probabilmente sono andate incontro a riarrangiamenti non produttivi e, per qualche lesione
genetica, non vanno incontro ad apoptosi. Con ogni probabilità, le caratteristiche cellule reattive si
accumulano in risposta a citochine secrete dalle cellule di Reed-Sternberg. Il nucleo di queste cellule è
plurilobato, con caratteristica forma a ‘pop corn’, mentre i nucleoli sono ben evidenti e circondati da un
alone bianco.

Il linfoma di Hodgkin ha una caratteristica evoluzione clinica, in quanto coinvolge in modo sequenziale
stazioni linfatiche adiacenti ed è caratterizzato dalla comparsa di sintomi sistemici con l’avanzare della
patologia; l’infiltrazione tumorale può coinvolgere anche gli altri organi, quali la milza, il fegato e il midollo.
Si tratta di una malattia con alta frequenza di guarigione, e risponde piuttosto bene alla terapia.
Nonostante si conosca questa patologia da più di un secolo, non abbiamo però una conoscenza dettagliata;
spesso nelle cellule neoplastiche rileviamo la positività al virus Epstein-Barr (50% dei casi), per cui si
immagina che gli antigeni prodotti dal virus possano contribuire, tramite un’amplificata trasduzione del
segnale (in particolar modo quello di NFkB) alla abnorme proliferazione dei linfociti B nei centri
germinativi: questi linfociti B del centro germinativo con riarrangiamenti sfavorevoli delle Ig sfuggono
all’apoptosi, spesso grazie all’oncoproteina LMP1 di EBV. Il ruolo del pathway di NFkB è confermato dal
fatto che nei casi in cui manca il virus di EB, ritroviamo mutazione attivanti di NFkB, che veicolano l’azione
svolta da LMP1.

Fisiopatologia 06/03/13 Vecchio

Leucemia a cellule T dell’adulto

Nell’ambito delle malattie neoplastiche del sangue (e quindi delle cosiddette leucemie) rientra una patologia
abbastanza particolare, la leucemia a cellule T dell’adulto, detta anche ATL (Adult T-cell
leukemia/lymphoma). Si tratta di una forma di leucemia rara, soprattutto nell’emisfero occidentale, ma
estremamente frequente in alcune zone del mondo, in particolare nelle isole meridionali del Giappone (anche
se non solo in questa zona, però è da qui che è partita l’osservazione di questa particolare forma di leucemia).
Si tratta di una leucemia particolare che studiamo non tanto per la sua frequenza nelle nostre zone (essendo
infatti relativamente rara), ma soprattutto perché è una delle poche neoplasie umane associate a virus in cui si
conoscono con notevole dettaglio i meccanismi molecolari dell’insorgenza, in quanto sono strettamente
legati all’espressione del genoma virale.
Questa malattia è stata scoperta intorno alla metà degli anni ‘70 (‘75-‘77) in Giappone; agli inizi degli anni
‘80 (‘81-‘82) un ricercatore americano di nome Robert Gallo ha isolato una particella retrovirale, a cui è
stato dato il nome di HTLV-1, da ‘Human T cell leukemia virus’, cioè virus della leucemia a cellule T
umana. Questo isolamento è stato confermato in Giappone, ed è importante dal punto di vista storico perché
è il primo retrovirus umano (e per adesso è ancora l’unico) legato ad una neoplasia umana.
HTLV-1 ha dei virus che gli sono correlati; in particolare ci sono due tipi di virus correlati, uno chiamato
STLV-1, che è l'analogo di HTLV-1 nelle scimmie, e un altro che si chiama BLV (Bovine Leukosis Virus) che
è un virus della leucemia a cellule B del bovino. Questi tre virus sono intimamente correlati, essendo molto
simili, dal punto di vista strutturale, l’uno all’altro; è stato isolato anche un altro virus umano, HTLV-2, che
però non è stato associato con nessuna malattia umana, neoplastica o non neoplastica.

HTLV-1 ed STLV-1 sono molto vicini in quanto sono tutti e due causa di leucemie a cellule T nell’uomo e
nei primati, rispettivamente. Per quanto riguarda l’origine di HTLV-1, si pensa che in realtà esso sia derivato
proprio da SLTV-1; è possibile che circa 50.000 anni fa ci siano stati dei passaggi dalla scimmia all’uomo, e
quindi successivamente si siano sviluppati vari ceppi anche nella specie umana. Recentemente sono stati
rilevati dei sottotipi di HTLV-1, denominati HTLV-3 e HTLV-4, isolati da individui africani cacciatori di
carne.
Si tratta di retrovirus che presentano particolari caratteristiche, per le quali vengono anche detti virus
transattivanti. I retrovirus si distinguono in acuti e cronici; i retrovirus acuti, come SRV, sono dei virus che
hanno acquisito un gene cellulare, un oncogene modificato, il quale è causa diretta della neoplasia. I
retrovirus transattivanti invece non hanno acquisito dei geni cellulari, quindi sono dei virus che posseggono

104
soltanto un genoma con geni propriamente virali; sono dei virus che assomigliano alla categoria dei virus
cronici, cioè dei virus i quali non hanno acquisito degli oncogeni, ma sono capaci comunque di provocare dei
fenomeni neoplastici, con meccanismi abbastanza complessi. I virus transattivanti assomigliano di più ai
virus cronici nel senso che, come i virus cronici, sono capaci di replicarsi autonomamente, non hanno
bisogno dei virus helper e provocano delle malattie ematopoietiche monoclonali; la leucemia a cellule T
dell’adulto è infatti una tipica malattia monoclonale, cioè che deriva da un clone soltanto di cellule
trasformate. A differenza dei virus cronici però, questi virus si comportano come virus trasformanti acuti,
cioè hanno la capacità di trasformare sia le cellule in vitro sia di provocare fenomeni neoplastici in vivo,
senza aver bisogno di integrarsi in un sito specifico per provocare la patologia tumorale; sono quindi una
categoria di retrovirus completamente a sé stante rispetto a quelli acuti e cronici.
La caratteristica più tipica di questi retrovirus è quella di codificare una proteina, il cui nome è Tax (di cui
esistono varie forme a seconda del virus considerato), a cui si attribuiscono la maggior parte delle capacità di
trasformazione dei virus transattivanti: questo tipo di attivazione da parte di una proteina anziché da parte di
una zona regolatoria del DNA (come accade nel caso dei retrovirus cronici) è chiamata attivazione in trans, e
queste proteine virali sono chiamate transattivatori.

Genoma di HTLV-1
Il genoma di HTLV-1 comprende tutta una parte
che è simile a quella dei retrovirus semplici, vale
a dire i geni che codificano per proteine virali che
vanno sotto il nome di gag e pol. Anche il gene
env è molto simile all’omologa regione presente
nei retrovirus cronici, in quanto codifica le
proteine dell’envelope virale, cioè le
glicoproteine di membrana; fino a qui dunque la
situazione è del tutto simile ai retrovirus classici.
Però abbiamo una zona del genoma indicata
come pX, che è una zona che codifica per
proteine che invece non sono codificate dai
retrovirus classici; da questa zona infatti,
attraverso meccanismi di splicing alternativo,
vengono codificate varie proteine, fra cui la più
importante è Tax, anche se sicuramente le altre
proteine svolgono un ruolo accessorio importante
nell’infezione e nella trasformazione neoplastica
dovute a questo virus.

Le altre caratteristiche del genoma virale sono:

come in tutti gli altri retrovirus, il provirus – cioè il virus che sotto forma di DNA si inserisce nel
genoma delle cellule – contiene due elementi, le LTR al 5’ e al 3’, che sono importanti elementi
regolatori del virus. L’elemento LTR al 5’ nelle cellule della leucemia a cellule T dell’adulto molto
spesso è deleto, cioè viene a mancare e non si trova più, oppure è metilato e dunque silenziato, in
quanto la metilazione è uno dei principali meccanismi di silenziamento dell’espressione genica. La
LTR al 3’ del genoma, invece, è sempre invariabilmente conservata in tutte le cellule ATL;
il gene Tax va incontro frequentemente a mutazioni e alterazioni geniche, e questa è un altro
elemento importante nella patogenesi della leucemia;
infine, una caratteristica veramente unica di questo virus, e che non è posseduta da nessun altro
provirus, è che il filamento negativo del DNA provirale (cioè il filamento antisenso) a partire dalla
sua estremità 3’ codifica per una piccola proteina, che va sotto il nome di HBZ, perché è una proteina
che possiede dei domini leucine zipper, che sono dei domini importanti in quanto in grado di legarsi
a regioni specifiche del DNA: HBZ sta infatti per HTLV-1 Basic leucine Zipper factor.

Leucemia a cellule T dell’adulto

L’ATL è una leucemia monoclonale delle cellule T, e si manifesta frequentemente anche con alterazioni
cutanee. Il virus è endemico in molte aree geografiche, fra cui il sud del Giappone, dove è stato descritto per
la prima volta, e anche in altre zone, come nell'America Centrale e nei Caraibi; questo stesso virus è anche

105
causa di un’altra malattia totalmente non correlata alla leucemia, che si chiama paraparesi spastica tropicale
o mielopatia associata ad HTLV-1, una sindrome neurologica che è una malattia simile alla sclerosi multipla
(malattia invece relativamente frequente nella specie umana).
Fortunatamente, la frequenza con cui il virus provoca malattia è relativamente bassa e varia tra il 2-5%, nel
senso che tra il 2-5% degli individui che sono venuti a contatto con il virus HTLV-1 sviluppa la malattia.
Il virus ha varie modalità di trasmissione: una delle più importanti è quella attraverso il latte materno; negli
adulti invece il virus si trasmette con meccanismi molto simili a quelli con cui si trasmette il virus dell’HIV,
ovvero attraverso rapporti sessuali e sangue contaminato. Il virus è relativamente poco frequente nelle
nostre zone, però è molto frequente nei tossicodipendenti, quindi ha la possibilità di espandersi anche nelle
zone dell’Europa occidentale e negli Stati Uniti.
Ha un periodo di latenza molto lungo, che può andare da 20 fino a 40 anni e più.
Infine, esistono molte evidenze che fanno ritenere che il virus in realtà sia collegato in maniera diretta
all’insorgenza della malattia.

La malattia si manifesta in questo modo: inizialmente abbiamo una situazione preleucemica (e questo
succede anche con le leucemie più comuni) a cui fa seguito la leucemia conclamata.
La preleucemia dell’ATL (pre-ATL) consiste in una linfocitosi cronica con alterazioni dei linfociti; però già
in questa fase si può isolare il DNA provirale dalle cellule linfatiche che sono state colpite. A questo stadio,
si tratta di una malattia ancora oligoclonale, cioè ancora non è diventata una malattia monoclonale;
viceversa, nell’ATL conclamata siamo in presenza di un solo clone dominante di cellule maligne in cui è
integrato il retrovirus.
Per quanto riguarda il fenotipo delle cellule T leucemiche, esse appartengono al sottotipo delle cellule T-
helper attivate, perché risultano positive a marcatori quali CD3, CD4 e CD25, mentre sono CD8-; quindi,
sono delle cellule che hanno un fenotipo ben caratterizzato.
Si tratta di una leucemia a cellule T che ha localizzazione molto frequentemente nella cute, per cui spesso è
possibile osservare noduli presenti sulla cute dell’addome e sul torace, dati proprio dalle cellule T
leucemiche che infiltrano la cute; la malattia è caratterizzata anche da altre sintomatologie come linfo-
adenopatia, epato-splenomegalia e ipercalcemia.
La caratteristica tipica delle cellule T leucemiche è che si presentano sotto forma di cellule a fiore (cellule
plurilobate); un’altra caratteristica è la presenza di un’intensa eosinofilia nel sangue circolante.

Modalità di trasmissione per tutti i casi di trasmissione, cellule infettate dal virus devono essere trasmesse
dall’individuo infetto, in quanto HTLV-1 viene trasmesso attraverso un contatto cellula-cellula.
La modalità di trasmissione non è quella della particella virale che infetta la cellula, cioè quella classica in
cui c’è bisogno di un recettore per il virione, ma avviene da una cellula infettata a una cellula sana, attraverso
quelle che vanno sotto il nome di sinapsi virologiche, che si formano all’interfaccia tra due cellule: due
cellule, una che è infettata dal virus e che ha il virus integrato nel suo genoma, e l’altra che non ha il virus,
vengono in contatto fra di loro; attraverso un centro organizzativo microtubulare (MTOC) che si localizza
alla giunzione cellula-cellula, si forma una sorta di canale (la sinapsi virologica) attraverso il quale passa il
materiale retrovirale, in particolare l’RNA genomico, che contiene i geni virali.
La modalità di infezione è la seguente: abbiamo una cellula infettata, che possiede anche il genoma integrato
sotto forma di HTLV-1 provirus nel proprio nucleo; la cellula non infettata viene a contatto con la cellula
infettata, quindi si forma (attraverso delle molecole di adesione presenti sulle due cellule) il complesso
cellula-cellula e si forma la sinapsi virologica, attraverso la quale passa il materiale virale, che poi verrà (con
il meccanismo della trascrizione inversa) integrato nel genoma della cellula ospite.

106
Tax
La proteina Tax riveste il ruolo principale nel processo di leucemogenesi; essa agisce come un
transattivatore, o attivatore in trans.
Esiste la possibilità di attivare in cis il genoma delle cellule dei mammiferi, cioè ci sono delle porzioni
regolatorie nel DNA che regolano la trascrizione dei geni; la transattivazione consiste invece in un
meccanismo di attivazione in trans, cioè questa volta è una proteina, e non l’elemento regolatore del DNA,
ad attivare la trascrizione genica, andandosi a legare in alcune zone importanti del DNA. La zona più
importante cui si lega questa proteina Tax è la LTR al 5’, perché è questa la zona fondamentale per la
trascrizione del DNA virale.
La proteina Tax però non ha solo la capacità di transattivare il genoma del proprio virus, ma ha anche
capacità promiscue, cioè è in grado di legarsi pure ad altri promotori cellulari, e quindi funziona da attivatore
in trans di molti altri geni; la trascrizione di parecchi altri geni cellulari viene quindi attivata da questa
proteina.
La proteina Tax è una proteina fosforilata che ha una localizzazione prevalentemente nucleare, ma ha anche
una localizzazione citoplasmatica, dove svolge funzioni estremamente importanti; nella zona di sinapsi
virologica c’è una concentrazione della proteina Tax, perché probabilmente svolge una funzione anche nella
trasmissione dell’infezione da una cellula all’altra.

Tax svolge un ruolo preponderante nello sviluppo della leucemia a cellule T dell'adulto.
Innanzitutto, un’osservazione abbastanza interessante è che non in tutte le leucemie ATL si trova la presenza
di Tax nelle cellule infettate e trasformate, ma soltanto nel 40% di esse; c’è quindi un 60% di leucemie ATL
in cui Tax non è espressa. Questo significa che Tax non è importante tanto per il mantenimento dello stato
trasformato, ma è invece importante per l’inizio della trasformazione cellulare.
Esistono dei meccanismi con cui Tax viene silenziato:
innanzitutto, molto frequentemente il gene che codifica la proteina Tax va incontro a mutazioni
(mutazioni puntiformi, inserzioni, delezioni, etc.). Quindi possono venire danneggiate sequenze
importanti del gene, e pertanto la proteina non può essere espressa;
il silenziamento della trascrizione virale attraverso la metilazione del provirus;
la delezione del 5’ LTR del provirus; senza la LTR al 5’ del provirus, tutti i geni virali che sono a
valle del 5’ (fra cui, ovviamente, anche la proteina Tax) non possono essere espressi.

107
Quindi con questi tre meccanismi il gene Tax viene silenziato e la proteina non viene espressa; dunque in
alcune cellule c’è il silenziamento dell’espressione di Tax. Tax è necessaria subito dopo l’infezione per
iniziare la trasformazione neoplastica, ma probabilmente non è richiesta per il mantenimento dello stato
trasformato.
Le cellule che posseggono Tax sono ovviamente riconosciute dal sistema immunitario dell’ospite; infatti i
linfociti T citotossici tendono ad eliminare le cellule che contengono il virus; in particolare, le cellule
tendono a spegnere l’espressione di Tax in quanto è la proteina più immunogenicamente attiva, e quindi
quella che farebbe riconoscere più facilmente le cellule che posseggono il virus al loro interno. C’è quindi un
meccanismo di controllo da parte dell’ospite che tende a eliminare le cellule ATL che contengono Tax, e di
conseguenza vengono selezionate e rimangono soltanto le cellule ATL che non esprimono Tax, ma che
esprimono, invece, altre proteine virali, in particolare la proteina HBZ.
Tax è importante per l’inizio dello stato trasformato, agendo tramite diversi meccanismi.
Per trasformare le cellule Tax agisce sostanzialmente a tre livelli:
1. agisce a livello della sopravvivenza cellulare, favorendola, e inibendo l'apoptosi;
2. favorisce la progressione del ciclo cellulare, quindi fa entrare le cellule in ciclo;
3. provoca aneuploidia, che è una caratteristica tipica e frequente nelle cellule neoplastiche.

Sopravvivenza cellulare e inibizione apoptosi Tax promuove la sopravvivenza attraverso due vie in
particolare, vale a dire l’attivazione della via di AKT e l’attivazione della via di NfκB, una proteina che è un
importante attivatore della trascrizione di tantissimi geni, soprattutto correlati con l’infiammazione e con la
proliferazione cellulare.
Tax dunque determina l’attivazione della proteina NFκB e della proteina Akt:
il meccanismo con cui Tax favorisce l’attivazione di NFκB è attraverso l’aumento della
fosforilazione di un complesso, IκBα, importante per inibire l’attività di NFκB (quest’ultimo è
costituito dalle due subunità RELA e p50). NFκB è segregato nel citoplasma, e non può entrare nel
nucleo perché legato appunto a questo complesso IκBα. Attraverso l’interazione di Tax con alcune
proteine (IKKα, β e γ) si ha la fosforilazione della proteina IκBα e il rilascio di NFκB, che può
entrare a questo punto nel nucleo e andare a esercitare la sua funzione di trascrizione di geni
importanti per l’infiammazione e per la sopravvivenza cellulare;
l’altra via è quella di AKT; Tax è presente prevalentemente nel nucleo, in quanto è una fosfoproteina
nucleare, ma svolge delle funzioni importanti anche nel citoplasma; una di queste è appunto la sua
azione su NFκB; un’altra è quella di legarsi e stimolare la proteina PI3K, che è il principale
attivatore della proteina AKT. PI3K agisce fosforilando su residui specifici di serina la proteina
AKT; una volta che la proteina AKT è stata fosforilata, questa può esercitare la sua azione
molteplice sul ciclo cellulare, sulla sopravvivenza cellulare e sulla crescita cellulare.
Quindi, attraverso queste due vie, la proteina Tax esercita un’azione importante sulla sopravvivenza e
sull’inibizione dell'apoptosi.

Proliferazione cellulare la proteina Tax non agisce soltanto a livello della sopravvivenza, ma anche
favorendo l’entrata in ciclo delle cellule, quindi favorendo direttamente la proliferazione cellulare.

108
Tax provoca questo fenomeno attraverso tre meccanismi:
aumentando le cicline del gruppo D;
attivando le chinasi dipendenti da ciclina CDK4 e CDK6, provocando l’iperfosforilazione e
inattivazione della proteina RB;
infine la proteina Tax non ha solamente una funzione di attivatore della trascrizione, ma ha anche la
capacità di inattivare la trascrizione di alcuni geni; quindi, mentre attiva la trascrizione di questi geni,
inattiva la trascrizione degli inibitori delle CDK.
Quindi attraverso questi tre meccanismi Tax favorisce la proliferazione cellulare.

Aneuplodia Tax favorisce l’aneuploidia con un

meccanismo abbastanza complesso.
L’aneuploidia origina in realtà dalla formazione di
mitosi multipolari. Quando una cellula si divide, c’è
un polo dove converge il cosiddetto fuso mitotico,
da cui origina poi la formazione dei fusi polari e dei
nuclei; Tax ha la capacità di interagire con delle
proteine quali TAXBP2 e RANBP1, le quali
controllano la formazione dei poli. L’inibizione
esercitata dalla proteina Tax su queste due proteine
determina la formazione di più centrosomi, e quindi
favorisce l’aneuploidia, tramite la formazione di più
fusi mitotici.
Inoltre, un altro meccanismo attraverso cui funziona
Tax è quello di legarsi a una proteina chiamata
MAD1, una proteina importante nello spindle mitotic
checkpoint (SAC), che sottende alla fedeltà della
segregazione cromosomica. Quindi, Tax si lega a
MAD1 impedendone la funzione e provocando
l’emergenza di cellule aneuploidi, cioè che
posseggono un numero inferiore o maggiore di
cromosomi rispetto al numero di cromosomi
caratteristico della specie.
Ultima azione di Tax, anche questa molto
importante, è quella di provocare alterazioni del
riparo del DNA, agendo direttamente su proteine del
riparo e impedendone la funzione, e bloccando la
funzione di p53 (una proteina molto frequentemente
inattivata, mutata o inespressa nelle neoplasie
umane). Queste azioni che si esercita sul riparo del
DNA sono azioni ulteriori molto importanti che
favoriscono la comparsa del clone neoplastico
emergente.

HBZ
L’azione di HTLV-1 è dovuta fondamentalmente a Tax, ma questa non è l’unica proteina virale importante
nella patogenesi dell’ATL. Infatti la porzione del genoma di HTLV-1 trascritta sul filamento negativo del
genoma codifica HBZ e un RNA messaggero specifico.
HBZ è una proteina che svolge delle azioni importanti: essa inibisce la transattivazione mediata da Tax della
trascrizione virale, cioè blocca l’azione principale di Tax. Oltre all’azione della proteina, c’è addirittura
un’azione esercitata dall’mRNA di HBZ, che è importante in quanto di per sé è capace di promuovere la
proliferazione delle cellule infette.
L’azione fondamentale di Tax è quella di legarsi ad importanti attivatori della trascrizione fra cui, ad
esempio, CREB2; la proteina HBZ ha un’azione opposta, cioè ha la capacità di bloccare la transattivazione
esercitata dalla proteina Tax eterodimerizzando con delle altre proteine, tra cui JUN e CREB2, e impedendo
che la proteina Tax con il suo complesso si attacchi sulla LTR del 5’ e favorisca la trascrizione del genoma

109
virale. L’RNA di HBZ invece esercita direttamente un’azione promuovente la crescita attraverso la
promozione della proliferazione delle cellule infettate.

Riassumendo, possiamo dire che questo è lo schema generale della storia naturale dell’infezione da HTLV-1:
è importante che tutto parta da una cellula infettata, la quale è essa stessa tramite dell’infezione; molto
raramente infatti l’infezione avviene da una particella virale a una cellula, così come invece succede nella
maggior parte delle infezioni da virus. Il clone che è stato infettato viene amplificato attraverso vari
meccanismi di aumento della proliferazione cellulare, e soprattutto sotto l’azione esercitata dalla proteina
Tax.
I linfociti T citotossici esercitano un’azione importante eliminando i cloni cellulari che esprimono Tax, per
cui si assiste a una proliferazione clonale che è prima oligoclonale e poi monoclonale, con l’emergenza delle
cellule T infettate da HTLV-1 in cui è conservata l’espressione della proteina HBZ.

In conclusione:
HTLV-1 è un retrovirus che infetta circa 20 milioni di persone nel mondo;
è il primo retrovirus scoperto come causa di neoplasia umana (ATL);
l’infettività di HTLV-1 è associata alle cellule ed è mediata dalle sinapsi virologiche; in genere le
particelle virali non sono infettive;
HTLV-1, a differenza dei retrovirus comuni, non utilizza la strategia della cattura di un oncogene
cellulare per esercitare la sua oncogenicità; la sua oncoproteina virale è già contenuta nel genoma del
virus ed è la proteina Tax: questa proteina è necessaria per l’inizio ma non per il mantenimento della
trasformazione cellulare;
Tax trasforma le cellule attraverso i vari meccanismi, incluso l’instabilità cromosomica,
l’amplificazione dei centrosomi, l’abrogazione del riparo del DNA, l’attivazione delle CDK e delle
vie di trasmissione del segnale di NFkB e AKT, e infine il silenziamento di p53;

110
 il mantenimento della trasformazione ATL richiede la funzione di una nuova proteina e di un
mRNA, chiamata HBZ.

Fisiopatologia 11/03/13 Vecchio

Virus di Epstein-Barr

Il virus di Epstein-Barr (EBV) è un tipico virus della famiglia degli herpesvirus: abbiamo un nucleo centrale
costituito dal DNA genomico, circondato dal nucleocaspide, dal tegumento e infine dall’envelope; la
patologia più comune con cui esso è correlato è la mononucleosi infettiva.

Epidemiologia per quanto riguarda l’epidemiologia di questo virus, si tratta di un virus erpetico
estremamente diffuso nella popolazione mondiale, anche se la probabilità di infettarsi con questo virus è
differente a seconda se si tratti di popolazioni in via di sviluppo o meno:
nel caso dei paesi in via di sviluppo, l’infezione è molto precoce (bambini di 3-6 anni) e a questa età,
quasi il 100% dei bambini ha avuto contatti con questo virus. Dopo contatto con il virus, si può avere
un’infezione silente o una malattia non grave, lieve;
anche nelle popolazioni sviluppate la maggior parte della popolazione viene infettata, con la
differenza che il processo di infezione è rimandato a un’età maggiore (10-30 anni). Anche nelle
popolazioni occidentali si può verificare un infezione silente ma, nella maggior parte dei casi, la
manifestazione più frequente è la mononucleosi infettiva, una malattia non grave in cui l’espansione
linfocitaria dei linfociti B (i bersagli di questi virus) viene limitata da una risposta T citotossica
molto efficace (cioè i linfociti T tendono a sopraffare i linfociti B) e così, molto frequentemente, nel
sangue circolante di queste persone affette abbiamo una situazione che assomiglia vagamente a una
leucemia. Ecco perché quando è stata osservata per la prima volta la mononucleosi infettiva è stata
descritta come una ‘leucemia che regrediva’; in realtà fortunatamente non si tratta di leucemia, ma di
risposta dei linfociti T citotossici alla iperproliferazione dei linfociti B infettati, e ciò la fa somigliare
ad una malattia di tipo leucemico. La mononucleosi è anche detta ‘malattia del bacio’ perché uno dei
mezzi principali di trasmissione di questo virus è la saliva.

Nelle persone che vengono infettate, si formano due tipi di anticorpi:

anticorpi contro gli antigeni del capside virale (VCA), cioè gli antigeni presenti all’esterno dei
virioni, che sono quelli che persistono di più e che si trovano dopo un certo tempo dall’infezione;
poi ci sono gli anticorpi contro gli antigeni precoci (early antigen, EA), che si sviluppano
precocemente dopo l’infezione.
Questi anticorpi si trovano nell’85% degli individui normali, e ciò significa che l’85% della popolazione è
già venuta in contatto (solitamente nell’infanzia o nell’adolescenza) con questo virus, ed ha prodotto questi
anticorpi che permangono praticamente per tutta la vita; questi anticorpi si trovano, invece, nel 100% degli
individui affetti da linfoma di Burkitt (Burkitt era un chirurgo inglese che per la prima volta descrisse questo
tumore in Uganda, nel 1958).

EBV è un virus che infetta i linfociti B. Il bersaglio è costituito dai linfociti B in quanto essi contengono sulla
loro membrana un antigene, detto CD21 (CR2) che è il recettore per EBV; in particolare questo recettore
CD21 interagisce con gp350 (glicoproteina di 359 kDa) che si trova su EBV. CD21 non è l’unico recettore
per EBV presente sulle cellule B: vi è anche un corecettore, costituito dall’MHC II (complesso maggiore di
istocompatibilità di classe II), il quale lega anch’esso una glicoproteina presente sulla membrana di EBV,
detta gp42, dal peso molecolare di 42 kDa. Le cellule B infettate in modo latente costituiscono il serbatoio
primario di EBV nell’organismo.
EBV non infetta solo cellule B, ma anche cellule epiteliali, anche se il meccanismo di infezione è meno
chiaro, poiché queste cellule non posseggono questi recettori che sono invece peculiari dei linfociti B; dopo
l’infezione delle cellule epiteliali, si verifica un’attiva replicazione che conduce alla lisi e alla morte delle
cellule stesse. Più di cento geni possono essere espressi durante l’attiva replicazione virale, mentre
generalmente solo 11 sono espressi durante la fase di latenza del virus.

EBV ha una capacità unica: prendendo in vitro cellule B resting, cioè che sono a riposo e non proliferano, se
esse sono messe a contatto con EBV diventano cellule immortalizzate che proliferano in maniera indefinita.

111
Sono disponibili nei laboratori una serie di linee cellulari immortalizzate da EBV, dette linee cellulari
linfoblastoidi (LCLs), così chiamate perché assomigliano proprio a dei linfoblasti; le LCLs sono costituite
appunto da cellule trasformate in vitro da EBV e permanentemente infettate in maniera latente da questo
virus. Questo ci permette di studiare cosa succede in vitro con il virus di Epstein-Barr e, in più, tale sistema
rappresenta un modello fondamentale che dimostra il potenziale linfomagenico del virus.
Le linee cellulari linfoblastoidi presentano un’elevata espressione di markers di attivazione linfocitaria, quali
CD23, CD30, CD39, CD70, e di molecole di adesione, come le lymphocyte-function-associated antigens
LFA-1 e LFA-3, e ICAM-1; tali marcatori sono generalmente assenti nelle cellule B a riposo, ma sono
espressi ad alti livelli quando le cellule sono stimolate da stimoli antigenici, il che indica che
l’immortalizzazione indotta da EBV può essere provocata dalle stesse vie che inducono la proliferazione di
cellule B normali.

Struttura e genoma di EBV

EBV appartiene alla famiglia degli herpesvirus, ed è formato, come tutti i virus erpetici, da una parte interna
dove c’è il DNA a doppio filamento lineare con intorno le proteine del nucleocapside e poi l’envelope
(pericapside); lo spazio compreso tra il nucleocapside e l’envelope è detto tegumento. Quando il virus entra
nella cellula, il DNA circolarizza in forma episomiale e si replica come un episoma.
Il genoma di EBV codifica per numerosi prodotti virali; in particolare, abbiamo gli antigeni precoci (EA) che
sono definiti anche latenti, vale a dire proteine che vengono prodotte quando il virus che ha infettato le
cellule linfocitarie resta latente all’interno di esse.
Ogni cellula infettata in maniera latente contiene copie multiple extracromosomiali dell’episoma virale, ed
esprime in maniera costitutiva un numero limitato di prodotti di geni virali, le cosiddette proteine ‘latenti’
virali.

Antigeni precoci abbiamo diversi antigeni latenti:

sei antigeni nucleari, cioè proteine che si trovano nel nucleo delle cellule infettate, chiamate:
♦ EBNA-1 (Epstein-Barr nuclear antigen-1);
♦ EBNA-2;
♦ EBNA-3°A;
♦ EBNA-3B;
♦ EBNA-3C;
♦ LP;
in più, esistono tre proteine di membrana che sono trascritte in altre regioni del genoma, cioè:
♦ LMP-1;
♦ LMP-2°;
♦ LMP-2B.
Queste sono gli antigeni precoci o proteine latenti che hanno un ruolo molto importante nelle fasi di latenza e
di trasformazione virale; ci sono inoltre due zone del genoma, EBER-1 e EBER-2, che sono trascritte come
RNA ma non vengono tradotte in proteine in quanto non posseggono la poliadenilazione, caratteristica degli
RNA trascritti nelle cellule eucariotiche.
Riassumendo, abbiamo quindi sei antigeni virali nucleari e tre proteine che si localizzano sulla membrana
delle cellule infettate; questi antigeni stati visti e scoperti nelle cellule linfoblastoidi.
Le proteine EBNA-2, EBNA-3C ed LMP-1 sono capaci di indurre alterazioni fenotipiche simili alle LCLs
anche se espresse individualmente, e questo significa che esse sono essenziali nel processo di
immortalizzazione.
A seguito dell’infezione virale, l’espressione delle proteine virali fa si che venga attivato un programma di
trascrizione di proteine cellulari molto importanti nell’immortalizzazione delle cellule.

Analizziamo adesso singolarmente cosa fanno questi antigeni:

EBNA-1 è un antigene espresso in tutte le cellule infettate dal virus, e la sua azione principale è agire
nel mantenimento della replicazione del genoma episomale di EBV andandosi a legare ad ORiP
(cioè l’origine di replicazione) e attivando la replicazione del DNA. In più, questa proteina può
anche interagire con i promotori delle proteine virali, contribuendo alla trascrizione di queste

112
porzioni del genoma virale, contribuendo alla regolazione trascrizionale degli antigeni EBNA,
incluso lo stesso EBNA-1;
EBNA-2 è molto importante nella trasformazione cellulare, in quanto, un virus senza EBNA-2 non è
più capace di trasformare le cellule. Il meccanismo principale con cui esso trasforma le cellule è il
seguente: EBNA-2 si lega alla proteina RBP-Jk (Jk Recobination Binding Protein), che si trova
legata ad un complesso che inattiva la trascrizione di alcuni geni cellulari. EBNA-2 legandosi a
RBP-Jk può spiazzare questo complesso, attivando quindi la trascrizione a valle di tutti i geni che
sono normalmente repressi da questo complesso; RBP-Jk attiva la trascrizione di CD-23 (marker di
attivazione linfocitaria) nonché di geni chiave di EBV, LMP-1 ed LMP2A;
Nell’ambito di questo meccanismo, la proteina EBNA-1 svolge un ruolo positivo, cooperando con
EBNA-2 nell’attivare la trascrizione, mentre invece EBNA-3A, 3B e 3C agiscono in maniera
opposta, cioè tendono a favorire lo stato di repressione della trascrizione.

113
LMP-1 è la principale proteina trasformante, insieme con EBNA-2, e funziona come un classico
oncogene. Se il genoma del virus con LMP-1 viene messo in topi transgenici, essi sviluppano dei
linfomi di tipo B; inoltre essa, a contatto con dei fibroblasti, causa la loro trasformazione in vitro, e
queste cellule se iniettate in topi nudi causeranno dei tumori. LMP-1 inoltre favorisce la
proliferazione delle cellule B.
Questo è il meccanismo di azione molecolare: LMP-1 si comporta come un membro della famiglia
dei TNF-receptor; i TNF-R sono recettori di membrana attivati da alcuni ligandi e, in seguito a
questo legame, attivano un signaling all’interno della cellula che porta la cellula stessa a mettere in

114
moto un programma di proliferazione. LMP-1 si comporta come un TNF-receptor, che però
trasmette il segnale anche in assenza di ligandi; essa infatti è una proteina di membrana attiva in
maniera costitutiva. Nello specifico, dal punto di vista funzionale LMP-1 assomiglia alla proteina
CD-40, che è appunto un membro dei TNF-R, e può addirittura sostituire parzialmente CD-40,
dando i segnali di proliferazione e di differenziazione alle cellule B.
LMP-1 possiede una piccola porzione N-terminale all’interno del citoplasma, ha sei loop all’interno
della membrana ed ha una lunga coda C-terminale all’interno del citoplasma, che è la porzione
importante per attivare il signaling all’interno della cellula.
Tra gli effetti più importanti di questa proteina, che si inserisce nella membrana delle cellule
linfoblastoidi, vi è quello di attivare il programma di NFkB (quindi anche EBV attiva il programma
che fa aumentare le proteine NFkB, così come il virus HTLV-1).

LMP-2A e LMP-2B: mentre LMP-1 è essenziale per la trasformazione di cellule linfoblastoidi, LMP-
2A e LMP-2B non lo sono; queste due proteine però possono favorire la proliferazione di cellule B
in assenza del segnale del B cell-receptor (BCR). In più, LMP-2A può trasformare le cellule
epiteliali, aumentandone la motilità; ciò è importante anche in vivo nell’induzione di tumori. Le due
proteine sono simili, e si localizzano sulla membrana delle cellule linfoblastoidi; hanno una corta
parte C-terminale all’interno del citoplasma (di 17 aa), possiedono 12 loop transmembrana e poi una
lunga coda N-terminale di circa 200 aa, che è la parte importante per attivare vie di signaling
all’interno della cellula trasformata.

115
Strategie utilizzate da EBV
il DNA virale deve essere mantenuto nelle cellule:
EBV stabilisce un’infezione latente nei linfociti B;
i linfociti B si replicano, quindi EBV deve trasmettersi alla progenie (infatti EBV si trova sia
allo stato episomico che integrato nel DNA della cellula ospite);
la cellula trasformata non deve essere eliminata dal sistema immunitario:
la cellula infettata deve esprimere un numero limitato di geni (anche se il DNA di EBV può
codificare circa 100 prodotti proteici);
l’infezione latente di cellule B comporta l’espressione di 11-12 proteine (quest’espressione
limitata previene la replicazione virale con morte cellulare e diminuisce le capacità del
sistema immune di riconoscere e distruggere una cellula infettata);
ruolo importante delle proteine virus-specifiche:
le proteine codificate da alcuni virus a DNA transattivano l’espressione di geni importanti
per iniziare o mantenere la trasformazione neoplastica;
parecchie proteine di EBV interagiscono con proteine cellulari per attivare la trascrizione di
geni cellulari o per attivare vie di trasduzione del segnale nelle cellule.

Finora abbiamo parlato di trasformazione di cellule linfoblastiche in vitro; ciò è molto importante perché ci
permette di riprodurre in laboratorio dei fenomeni che avvengono in vivo, ma è comunque necessario cercare
di studiare il fenomeno direttamente in vivo, anche se ciò non è sempre possibile. Per quanto riguarda le
infezioni di EBV in vivo, sappiamo che il bersaglio di questo virus sono le cellule B, che vengono infettate in
maniera latente e rappresentano quindi il serbatoio del virus. L’EBV, così come tutti gli herpesvirus, rimane
per tutta la vita nell’organismo infettato, nella maggior parte dei casi in forma episomiale.
Il genoma del virus è piuttosto grande, quindi codifica per parecchie proteine. Quando un virus penetra
all’interno di una cellula, produce dunque diverse proteine, che però attivano un meccanismo di risposta da
parte dell’ospite; l’ospite, quanto maggiore è la quantità di proteine prodotte, tanto più reagisce con una
risposta citotossica. Non è quindi nell’interesse del virus di produrre molte proteine; se lo facesse, la cellula
che lo ospita morirebbe e si avrebbe un’infezione di tipo litico.

116
Produrre dunque molte proteine non è la maniera più efficace per potersi nascondere dalle difese
dell’organismo; per fare ciò il virus deve invece diventare latente, e per diventare latente deve esprimere solo
il programma di latenza, quindi deve esprimere una quantità relativamente bassa di proteine, in modo da
limitare il riconoscimento di cellule infettate da parte dei linfociti T citotossici; in base all’espressione delle
proteine virali e all’espressione dei marcatori di superficie cellulari, sono stati identificati tre programmi di
latenza virale (programma di latenza I, II e III).
Dunque nelle infezioni da EBV il problema non è tanto che i linfociti T citotossici non intervengono, quanto
che essi, anche se intervengono, lo fanno in maniera limitata e meno efficace.

Questo è quello che presumibilmente accade in vivo quando EBV entra nel nostro organismo: l’infezione si
contrae perlopiù per via salivare, quindi le prime cellule che entrano in contatto col virus sono quelle
epiteliali della mucosa orale, anche se non sappiamo ancora bene come vengano infettate; in ogni modo, il
virus si replica nelle cellule epiteliali provocandone la lisi con produzione di progenie virale. Il virus è quindi
replicato e si propaga andando a finire nei linfociti B presenti nella mucosa orale; a questo punto ci sono due
possibili ipotesi, che probabilmente si verificano entrambe:
1. i virioni possono essere infettare cellule B naive, cioè le cellule B che non hanno mai avuto contatti
con l’antigene; queste, in seguito all’infezione, attuano il cosiddetto ‘programma di latenza-III’
(caratterizzato dalla trascrizione di tutte e nove le proteine della latenza), in cui le cellule proliferano
in maniera simile a quello delle cellule linfoblastoidi e passano nei centri germinativi, e da qui al
serbatoio delle cellule B della memoria;
2. altra possibilità è che EBV infetti non solo cellule naive, ma anche le stesse cellule della memoria
presenti nella mucosa orale; queste cellule, per definizione, sono già presenti nel pool della memoria.

117
Quando sono infettate in maniera latente, sia le cellule naive che le cellule della memoria non sono
responsive
ponsive alla risposta delle cellule T citotossiche, cioè non vengono eliminate da esse.
L’attuazione del programma di latenza è la maniera in cui EBV, che si trova nelle cellule della memoria,
esprime in maniera limitata gli antigeni virali e può essere conservato
conservato per un periodo indefinito di tempo. Il
virus in questo stadio però non è inattivo, ma può slatentizzare: le cellule della memoria infatti possono
ripassare nei centri germinativi e svilupparsi fino alla completa differenziazione in plasmacellula; la
plasmacellula quindi può andare incontro al programma di lisi cellulare, in quanto il virus si replica e
provoca la lisi della membrana cellulare, rilasciando particelle virali infettive. Il virione dunque può di nuovo
raggiungere le cellule al di sottoo della mucosa epiteliale, e dare origine a nuova infezione delle cellule della
mucosa epiteliale; così si replica il ciclo di infezione delle cellule B della memoria o delle B naive. In questo
modo, il virus può latentizzare e slatentizzare, cioè ridiventare
ridiventare attivo e infettare cellule sia della linea B che
della linea epiteliale, e dar luogo a nuove infezioni virali.
Dunque, la sequenza di eventi che accadono nell’ospite immunocompetente sono: infezione primaria per via
orale, generalmente asintomatica (che (che però se avviene nell’adolescenza spesso causa la mononucleosi
infettiva, una la malattia autolimitante); l’infezione può coinvolgere le cellule epiteliali della mucosa
orofaringea. Successivamente le cellule B (sia naive, che della memoria) sono infettateinfetta in maniera latente;
l’immunosorveglianza delle cellule T è essenziale nel controllo dell’infezione persistente da EBV.

Malattie neoplastiche associate a EBV

Il virus EBV, oltre alla mononucleosi infettiva, può provocare malattie neoplastiche in vivo nell’uomo.
n
Esistono tre tipi di linfomi associati a EBV:
linfoma negli individui immunosoppressi;
linfoma di Hodgkin;
linfoma di Burkitt.

Linfomi in individui immunosoppressi i più studiati sono quelli nei pazienti che hanno ricevuto un
trapianto; frequentemente
entemente infatti in individui sottoposti a trapianto d’organo, e dunque a pesante terapia
immunosoppressiva per evitare il rigetto, si possono avere delle neoplasie. Le neoplasie più comuni che si
sviluppano sono i linfomi di tipo B, che sono EBV positivi,
positivi, in quanto esprimono proprio i tipici antigeni
virali che sono importanti per la trasformazione (EBNA-2
(EBNA e LMP-1). 1). Questi linfomi generalmente si
sviluppano nelle fasi precoci dopo il trapianto (solitamente nel primo anno dall’operazione), quando cioè
l’immunosoppressione
munosoppressione è più forte, e possono dar luogo a lesioni monoclonali o policlonali.
Questi linfomi si sviluppano perché i linfociti B esprimono il programma di latenza-III
latenza di EBV, durante il
quale queste cellule non sono sensibili alla risposta dei linfociti
lin T citotossici.

Linfoma di Hodgkin la caratteristica peculiare di questo linfoma

è la presenza di cellule di Hodgkin-Reed-Sternberg
Hodgkin (HRS), cioè
grosse cellule multinucleate che si trovano spesso nei centri
germinativi in proporzione piuttosto ridotta
r rispetto all’infiltrato di
cellule non maligne; queste cellule multinucleate sono molto
probabilmente le cellule maligne del linfoma. Circa il 40% dei
linfomi di Hodgkin che si sviluppano nel mondo occidentale sono
positivi per qualche antigene di EBVBV (mentre nei paesi in via di
sviluppo la percentuale è maggiore), però nel 60% dei casi non
ritroviamo EBV. Questo ha fatto pensare che in realtà EBV non
abbia un ruolo eziologico diretto, bensì ‘passeggero’. Tuttavia,
EBV è presente nelle cellule HRS che ch esprimono gli antigeni di
EBV, quali EBNA-1, LMP-11 ed LMP-2, LMP attuando il cosiddetto
programma di latenza II. Le cellule HRS presentano una forte attivazione del fattore NFkB.
Fortunatamente, esistono delle terapie piuttosto efficaci per questo tumore, che
che ha una buona probabilità di
sopravvivenza (l’85% dei casi circa).

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Linfoma di Burkitt è un linfoma che si trova in forma endemica soprattutto nei bambini di Africa, Nuova
Guinea e Uganda, ed EBV è quasi sempre presente in questo tipo di linfoma endemico. Il linfoma di Burkitt
è poi presente anche in altri paesi, quali Brasile e il Nord America, con un’incidenza intermedia, e in questo
caso nell’85% dei casi EBV è presente. Inoltre si può presentare anche nei paesi sviluppati in modo
sporadico e con bassa incidenza, ma in questo caso solo il 15% presenta positività per EBV. Questo linfoma
si può sviluppare anche nei portatori di HIV, nel 30-40% dei casi.
La forma più comune con cui si sviluppa il linfoma di Burkitt endemico è un tumore alla mascella, mentre
nei soggetti affetti da AIDS generalmente si manifesta come tumore ai linfonodi. Tutti i linfomi di Burkitt
presentano una traslocazione del gene c-Myc, un oncogene, con il locus delle catene delle Ig; ci sono tre
traslocazioni possibili del gene c-Myc, la più frequente è
quella che coinvolge il cromosoma 8 e il cromosoma 14.
Comunque, in tutti i casi, c-Myc (che si trova nel braccio
lungo del cromosoma 8) viene a portarsi sotto il controllo del
locus delle catene pesanti o di uno dei loci delle catene
leggere delle immunoglobuline, e questa traslocazione
rappresenta il fattore chiave della patogenesi del linfoma di
Burkitt.
Il fenotipo delle cellule dei linfomi di Burkitt è molto simile
a quello dei linfoblasti presenti nei centri germinativi, e la
presenza di mutazioni nei geni delle immunoglobuline delle
cellule tumorali favorisce l’ipotesi che queste mutazioni
nascano nei centri germinativi, e che la traslocazione di c-
Myc probabilmente sia il risultato di un errore
dell’ipermutazione fisiologica dei geni delle
immunoglobuline.
La cosa certa è che qualsiasi teoria postulata sull’origine del
linfoma deve tener conto che questo tumore è associato con
la malaria e con l’HIV, un fattore immunosoppressivo molto
importante, per cui è probabile che l’immunosoppressione giochi un ruolo considerevole nella patogenesi del
linfoma di Burkitt; in entrambi i casi, questi agenti possono agire come stimoli cronici del sistema cellulare e
provocare un’esagerata attività dei centri germinativi; questo può aumenta la possibilità di traslocazione di c-
Myc. Se osserviamo la distribuzione della malaria e del linfoma di Burkitt in Africa, notiamo che c’è
un’evidente sovrapposizione delle zone in cui entrambe le patologie sono endemiche.
Fortunatamente anche questo tumore è ben curabile con la chemioterapia.

La proteina Myc è un fattore di trascrizione che attiva l’espressione di un gran numero di geni legandosi alle
sequenze consenso (Enhancer Box sequences, E-boxes) e utilizzando istone acetiltransferasi (HAT); può
però anche agire come un repressore trascrizionale. Myc è attivato da diversi segnali mitogeni, quali la via di
segnalazione WNT, di Sonic Hedgehog (SHH) e il fattore di crescita dell’epidermide (EGF, attraverso la via
MAPK/ERK); modificando l’espressione dei suoi geni bersaglio, l’attivazione di Myc ha numerosi effetti
biologici: ha la capacità di guidare la proliferazione cellulare (sopraregola le cicline, sottoregola p21) ma
gioca anche un ruolo importante per quanto riguarda la regolazione della crescita cellulare (sopraregola
l’RNA ribosomiale e le proteine), l’apoptosi (sottoregola Bcl-2), la differenziazione e l’autorinnovamento
delle cellule staminali. Myc è un protooncogene molto forte, e si trova spesso sovraespresso in molti tipi di
neoplasie maligne.

Carcinoma naso-faringeo 1 oltre ai linfomi, esistono anche altre patologie neoplastiche associate ad EBV.
Infatti l’infezione di cellule epiteliali da parte di EBV può comportare lo sviluppo del carcinoma naso-
faringeo, un sottotipo di adenocarcinoma gastrico e di alcuni carcinomi di ghiandole salivari.
Il carcinoma naso-faringeo 1 è particolarmente frequente nelle aree della Cina e nel Sud-Est asiatico, dove
l’incidenza raggiunge un picco di 20-30 casi per 100.000 abitanti; inoltre l’incidenza è elevata negli individui
di origine cinese (particolarmente nei maschi cantonesi).
Oltre alla predisposizione genetica di queste popolazioni, possono intervenire anche co-fattori ambientali,
come l’alimentazione (ad esempio il consumo di pesce essiccato e salato, che contiene nitrosammine,
composti organici contenenti un gruppo nitroso ad azione cancerogena).

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L’espressione di geni latenti di EBV nel carcinoma naso-faringeo 1 è ristretta a EBNA-1, LMP2A ed
LMP2B.

Possiamo quindi riassumere le caratteristiche di EBV:

- l’nfezione da EBV è implicata nell’insorgenza di neoplasie linfoidi ed epiteliali;
- i geni latenti di EBV provocano trasformazione di cellule B in vitro;
- EBV sfrutta la differenziazione cellulare delle cellule B in cellule B della memoria per persistere nel
pool di cellule B nell’ospite immunocompetente;
- pazienti immunosoppressi (come i soggetti con AIDS o che hanno ricevuto un trapianto) sono a rischio
di subire la trasformazione neoplastica delle cellule B;
- altre neoplasie associate ad EBV mostrano forme più ristrette di espressione dei geni latenti, il che
riflette una patogenesi più complessa che coinvolge co-fattori aggiuntivi; cioè non tutti i geni che si
esprimono nelle cellule dei linfoblastomi sono espresse nei linfomi;
- approcci farmacologici ed immunoterapeutici sono stati sviluppati per trattare o prevenire i tumori
associati ad EBV, per cui queste neoplasie sono abbastanza efficacemente curabili.

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