Retrovirus!

Classicazione:! La famiglia Retroviridae viene tradizionalmente suddivisa in 3 sottofamiglie! Basandosi sulla patogenicit:! ! Oncovirus che causano trasformazione cellulare in vitro e in vivo! ! Spumavirus che causano effetti citopatici in vitro ma non ancora associati ad alcuna patologia! ! Lentivirus che inducono lentamente progressive compromissioni del sistema immunitario e neurologiche ! ! Recentemente sottodivisi in 7 generi, molto diffusi nel regno animale, con tropismo per diversi tessuti e associati a patologie talvolta molto diverse! Isolati e caratterizzati due retrovirus patogeni per luomo:! HIV human immunodeciency virus (un lentivirus): due sierotipi HIV-1 e HIV-2! HTLV human T Lymphotropic virus (un oncovirus): due sierotipi HTLV-1 e HTLV-2!

Ultima classicazione taxonomica della famiglia dei Retrovirus !

Genus

Example isolates

Comments
exogenous, oncogene-containing endogenous, benign exogenous, cause B-lymphoma, and other diseases exogenous, causes T-cell lymphoma, immunodeficiency and other diseases exogenous, oncogene-containing endogenous and exogenous, causes mostly mammary carcinoma exogenous, unknown pathogenicity exogenous, causes T-cell lymphoma and neurological disorders

Avian-leukosis-sarcoma (s) Rous sarcoma virus (RSV) Rous associated virus 0 Rous associated virus 1 to 50 Mammalian C-type (s) Feline leukemia virus

Simian sarcoma virus B-Type viruses (s) D-Type viruses (s) HTLV-BLV viruses (c) Lentiviruses (c) Mouse mammary tumor virus Mason-Pfizer monkey virus Human T-cell leukemia virus (HTLV)-1 and -2 Equine infectious virus (EIAV)

exogenous, causes autoimmune hemolytic anemia Visna/maedi virus causes encephalopathy and lung disease in sheep Caprine arthritis-encephalitis virus causes encephalopathy and (CAEV) immune deficiency Bovine immunodeficiency virus (BIV) causes lymphadenopathy and neurological disorders Feline immunodeficiency virus (FIV) causes immune deficiency Simian immunodeficiency virus (SIV) Human immunodeficiency virus (HIV)-1 and -2 causes immune deficiency and encephalopathy causes immune deficiency and encephalopathy exogenous, apparently benign exogenous, apparently benign

Spumaviruses (c)

Simian foamy virus (SFV) Human foamy virus

Table 1.1 Retroviruses Genera. (s) Indicate simple and (c) complex retroviruses.

Retrovirus!

Caratteristica:! Il virione, grossolanamente sferico, con diametro di 100-120 nm, contiene due catene identiche di RNA genomico ss a polarit positiva, un enzima DNA polimerasi RNA dipendente, la trascrittasi inversa, che retrotrascive lRNA virale in DNA, che viene poi integrato nel genoma della cellula ospite a opera dellintegrasi virale.! ! Tutti presentano 3 geni: gag, pol, env!

Human endogenous retroviruses (I)!

!Around 8% of the human genome is derived from sequences with similarity to infectious retroviruses, which can be easily recognized because all infectious retroviruses contain at least all three genes, including gag, pol and env as well as long terminal repeats (LTRs).! !These sequences, human endogenous retroviruses (HERVs), represent the remnants of ancestral retroviral infections that became xed in the germline DNA. ! !Subsequent retrotransposition events amplied these elements to a high load within genome, during early Old World primate radiation.!

STRUTTURA DEI RETROVIRUS

- Membrana lipidica - Involucro (ENVELOPE) glicoproteico - CORE virale interno costituito da diverse proteine - RNA virale a singola elica (circa 10 kb) in due copie identiche tra loro - Trascrittasi inversa - Altre proteine funzionali e regolatorie virali.

TRASCRITTASI INVERSA (RT/RNAseH) Enzima virale essenziale per la replicazione con 3 funzioni: -DNA-Polimerasi RNA-Dipendente -DNA-Polimerasi DNA-Dipendente (simile alle DNA-Polimerasi cellulari). -RNAsi H (simile alle RNAsi cellulari). Circa 30 molecole per virione. DNA-polimerasi ad alta percentuale di errore (1000/10000 volte superiore alla DNA-Polimerasi cellulari). Ci spiega, almeno in parte, la frequente insorgenza di mutanti. Leggendo il filamento di RNA-transfer (primer) costruisce un filamento di DNA virale (Minus Strand analogo allRNA virale) utilizzando le basi puriniche e pirimidiniche trifosforilate dagli enzimi cellulari. Per la sua peculiarit il principale bersaglio dei farmaci anti-HIV. Lalta percentuale di errori rende le particelle virali antigenicamente disomogenee, e ci rende conto della difficolt di identificare vaccini efficaci contro i diversi ceppi virali. !

CICLO REPLICATIVO DEI RETROVIRUS - Adesione e penetrazione nella cellula

- UNCOATING e liberazione del genoma virale nel citoplasma. - Retrotrascrizione (via RT) del genoma a RNA singola elica in DNA a doppia elica. - Digestione (via RNAsi H) dellRNA genomico-virale. - Circolarizzazione del DNA virale e penetrazione nel nucleo. - Integrazione (via integrasi) nel DNA cellulare random. - Stato di quiescienza (durata variabile). - Trascrizione di RNA messaggero dal DNA virale. -!Scissione enzimatica (via proteasi virali) delle poliproteine in proteine mature. - Glicosilazione delle proteine. -!Assemblaggio delle proteine con lRNA virale genomico neoformato. -!Formazione di particelle virali complete. -!Fuoriuscita della cellula con meccanismo di BUDDING. !

Schema del ciclo replicativo dei retrovirus

Relazioni logenetiche allinterno della famiglia dei Retrovirus !

Electron micrographs of representative virion particles. The diameters of all the particles are approximately 100 nm.!
Panel A: Type A particles. Intracisternal A particles in the endoplasmic reticulum. Panel B: Betaretrovirus. Mouse mammary tumor virus (MMTV), type B morphology (top, intracytoplasmic particles; middle, budding particles; bottom, mature extracellular particles). Panel C: Gammaretrovirus. Murine leukemia virus (MLV) type C morphology (top, budding; bottom, mature extracellular particles). Panel D: Alpharetrovirus. Avian leukosis virus, type C morphology (top, budding; bottom, mature extracellular particles). Panel E: Betaretrovirus. Mason Pfizer monkey virus (MPMV), type D morphology (top, intracytoplasmic A-type particles; middle, budding; bottom, mature extracellular particles). Panel F: Deltaretrovirus. Bovine leukemia virus (BLV) (top, budding; bottom, mature extracellular particles). Panel G: Lentivirus. Bovine immunodeficiency virus (top, budding; bottom, mature extracellular particles). Panel H: Spumavirus. Bovine syncytial virus (top, intracytoplasmic particles; middle, budding; bottom, mature extracellular particles). Panel I: Betaretrovirus. Mouse mammary tumor virus, type B morphology, visualized by negative staining with phosphotungstic acid. Panel J: Gammaretrovirus, visualized as pseudoreplica stained with uranyl acetate. Panel K: Lentivirus. Purified cone-shaped cores of equine infectious anemia virus (top, cores visualized by shadow casting technique; bottom, cores visualized by negative staining with phosphotungstic acid). Panel L: Budding retroviral particles visualized by scanning electron microscopy. (Micrographs are courtesy of Dr. Matthew Gonda and reproduced from ref. 708, with permission.)

Strutture schematiche di RNA e DNA dei retrovirus durante il ciclo replicativo

!Reverse transcription of the RNA soon after infection involves the duplication and translocation of u5 and u3 sequence blocks, and it results in the formation of a double-stranded DNA molecule containing two terminal LTRs.! !The integration of the DNA genome occurs at the terminal sequences, establishing a provirus that is collinear with the preintegrative DNA. ! !The forward transcription of the provirus is initiated at the U3/R border in the provirus; the resulting RNAs are cleaved and polyadenylated at the r/u5 border, recreating a viral RNA genome (bottom) identical to the infecting RNA.! !

Modello di retrotrascrizione ad opera della RT

PBS! Primer binding site! Innesco per la RT e 3del tRNA lisina! Per la sintesi di DNA -! PPT! Poypurine tract! Innesco per la RT per la sintesi del DNA +!

DNA -!

DNA +!

Integrazione del DNA virale nel DNA della cellula ospite con formazione del provirus integrato
The precursor for the formation of the provirus is a linear double-stranded DNA containing two LTRs (boxes) and with inverted repeat sequences at the termini.!

Sequenza arbitraria nel DNA cellulare!

Integrazione del DNA virale nel DNA della cellula ospite !

The full-length linear DNA (top) is processed by the viral integrase by the endonucleolytic removal of dinucleotides at the 3 termini. The resulting DNA is then used in a strand transfer reaction in which the 3 OH ends make staggered breaks in the two strands of the target site DNA. The resulting gapped intermediate is presumably repaired by host enzymes.! !

Esempi di cleavaggio dei polipeptidi Gag-Pol nei diversi retrovirus!

Proteine mature funzionali presenti nel virione

HIV !
Agente eziologico della sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS) 1981- Descrizione della sindrome in uomini omosessuali! caratterizzata da ! ! infezioni opportunistiche! ! Sarcoma di Kaposi! ! Linfomi e altri tumori! ! 1983- Isolamento dellHIV-1 1985- Sequenziamento del genoma 1987- Isolamento dell HIV-2!

HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS (HIV): The causative agent of acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) 28 years 2009

10 years

SIVcpz (Simian Immunodeciency Virus of chimpazees) immediate precursor of HIV-1! The circumstances leading to the cross-species transfer cpz-human are still unknown!

HIV-1 !
!

*M (major ) with 9 pure subtypes: A, B, C, D, F, G, H, J, K ! Groups! *O (outlier)! > 40 major circolating recombinant forms (CRFs)! ! *N (non M-non O) ! Variation between clades 20-30% ! Variation intra-clade 10-15% !
Wainberg M.A!

HIV-1 !
!

*M (major ) with 9 pure subtypes: A, B, C, D, F, G, H, J, K ! Groups! *O (outlier)! > 40 major circolating recombinant forms (CRFs)! ! *N (non M-non O) & *P (from gorillas)! !
Wainberg M.A!

Plantier et al, Nature Medicine, 2009

Non-B subtypes account! for 88% of HIV infections !

Osmanov et al., 2002!

Phylogenetic relationship between HIV subtypes

HIV-1 subtypes differ in disease progression!

Kanki et al., 1999. J Infect Dis!

!HIV-1!

! retrovirus caratterizzato da un genoma alquanto complesso se paragonato a quello degli altri retrovirus: 9 geni diversi.! ! - ciclo replicativo e relativamente complesso. ! ! - Ha effetto citopatico, ossia uccide, di norma, le cellule che infetta. Leffetto citopatico, tuttavia, richiede alcuni giorni prima di manifestarsi (alcuni virus, es. a RNA, richiedono solo poche ore).! ! - Il suo ciclo replicativo nei linfociti CD4 infettati e tanto piu rapido quanto piu i linfociti sono attivati.!

GAG

POL

ENV

vpr
p15 Vpr

gp120 SU gp41 TM

p17 MA p24 CA p7 NC

ssRNA
p66/51 RT p32 IN p10 PR

Fig. 1.2 HIV-1 mature virion structure. Modified from WebPath resource collection (Klatt, 2000). Typical lentivirus particles are spherical, about 80-110 nm in diameter, and cons ist of a lipid bilayer membrane surrounding a conical core. The two identical single-stranded RNA (ssRNA) molecules, of about 9.2kB each, are associated with the nucleocapsid proteins p7gag (NC). They are packed into the core along with virally encoded enzymes: reverse transcriptase (RT), integrase (IN), and protease (PR). P24gag comprises the inner part of the core, the capsid (CA). The p17gag protein constitutes the matrix (MA) which is located between the nucleocapsid and the virion envelope. The viral envelope is produced by the cellular plasma membrane and contains the protruding viral Env glycoproteins: gp120 surface glycoprotein (SU) and gp41 transmembrane protein (TM). A mong the accessory proteins encoded by HIV-1, certainly Vpr and perhaps Nef and Vif are packaged into virions, although the precise location have not yet been elucidated. Neither the other accessory protein Vpu nor the regulatory proteins Tat and Rev have been detected in virion particles.

LTR (long terminal repeat): Sequenze laterali del genoma di HIV che controllano e attivano la replicazione virale, attraverso una ne regolazione dellespressione dei geni dell'HIV, e una interazione con i geni e le proteine della cellula ospite.! ! Geni codicanti per proteine strutturali! ! ! ! !! GAG = Gene codicante per le proteine di struttura: p17 matrice, p24 capside, p7 nucleocapside! ! POL= Gene codicante per gli enzimi:! - Transcrittasi inversa: DNA polimerasi RNA dipendente, sintetizza DNA da RNA e DNA ! (genera errori:priva di attivit di correzione di bozze)-Ribonucleasi H: degrada RNA di ! ibridi RNA/DNA! - Integrasi : integra il DNA virale nel genoma della cellula ospite (provirus)! - Proteasi: scinde in modo specico le poliproteine virali Gag/Gag-Pol in proteine mature ! e funzionali del virus! ! ENV = Gene codicante per le proteine dellenvelope:! - gp 120 : Glicoproteina che lega il recettore CD4 sulla supercie cellulare, e permette linizio del ciclo replicativo. Tramite il legame gp120-CD4 si formano sincizi cellula-cellula! !- gp 41 : Glicoproteina che regola lancoraggio e la fusione del virus con la ! !membrana cellulare!

! Geni codicanti per proteine regolatrici! ! TAT : Proteina essenziale RNA-binding che incrementa la trascrizione e la produzione di mRNA virale e quindi la sintesi delle proteine virali.! ! REV : Proteina essenziale RNA-binding che incrementa la stabilit e la fuoriuscita nucleare dell'RNA virale contenente introni, favorendo la produzione delle proteine virali tardive.! ! Geni codicanti per proteine accessorie! ! NEF : Proteina che regola linfettivita virale. Ceppi virali privi di nef non sono infettanti.! Aumenta la replicazione virale; coinvolta nella diminuzione di espressione di CD4 e MHC I sulla supercie delle cellule infette. Ruolo nella patogenesi.! ! VIF : Proteina che incrementa l'infettivit virale (APOBEC).! ! VPR : Proteina che incrementa linfezione virale e/o la replicazione (import nucleare del PIC, attivazione della trascrizione virale, blocco ciclo cellulare G2, induzione di apoptosi) ruolo nellinfezione dei macrofagi.! ! VPU : Proteina che incrementa la produzione di particelle virali e degradazione del CD4.! !

HIV!

HIV - Life History!

Entry into the cell T4 (CD4+) cells are major target

Human HeLa Cell

Human HeLa Cell transfected with CD4 antigen

NOT INFECTED

INFECTED

HIV - Life History!

HIV

chemokine
CD4 CD4 CCR5 CCR5 CD4

Mutant CCR5

macrophage

HIV INGRESSO VIRALE

Main steps of virus replication

Recognition and binding: Env Fusion and entry: Env

chemokine receptor

! Uncoating!

! ! !
Nucleus

! ! Nuclear translocation of PIC: ! Vpr, MA!

Reverse transcription: RT

Viral ssRNA

Viral dsDNA

Singly spliced mRNA (4kb)

! Transcriptional ! activation:! Tat! ! ! ! ! mRNA Export:! mRNA Export! Rev!

Provirus Unspliced mRNA (9kb) Fully spliced mRNA (2kb)

Integration: IN

! ! Late Phase: ! ! ! !!
Gag Pol Env Vif Vpr Vpu

Genomic RNA

!! Translation! ! assembly:! ! Capsid Vif, Vpu!

Tat Rev Nef

Early Phase:

! !

Cell membrane

Budding: Vpu Maturation: PR

! ! !

Ciclo di replicazione !
!

sulla supercie cellulare ! - Legame di gp120 con il recettore cellulare CD4 in congiunzione con un recettore per le chemochine: CXCR4 (virus linfocitotropi), CCR5 (virus monocitotropi)! ! - Fusione dell'envelope virale (gp41) con la membrana cellulare.! ! - Entrata del virus nella cellula.! ! ! ! ! nel citoplasma! -!Uncoating (scapsidamento) dell'RNA virale (tramite la fusione con i lisosomi).! ! -!Costituzione del Provirus, DNA bicatenario del corredo genetico virale, da parte della trascrittasi inversa virale! -!retrotrascizione di DNA con formazione di un ibrido RNA-DNA, ! -!degradazione dell'RNA da Rnasi H, ! -!sintesi di un secondo lamento di DNA.! ! - Entrata del DNA virale nel nucleo.! ! ! ! !nel nucleo ! integrazione (pi o meno abbondante) nel DNA cellulare durante la duplicazione della cellula mediata dall'integrasi virale!
!

- (LATENZA).!

!
!

nel nucleo!

- Attivazione con trascrizione del provirus in RNAm virale da parte di RNA polimerasi cellulare. ! ! !Fase precoce: espressione di Tat, Rev e Nef (nel citoplasma)!
!

Tat e Rev entrano nel nucleo! Tat trans-attiva la trascrizione virale! Rev media la fuoriuscita di RNAm virale contenente introni (RNA genomico e RNA codicante proteine strutturali) ! ! ! ! nel citoplasma!
!

!Fase tardiva: espressione di Gag, Pol, Env,Vif, Vpr, Vpu (Rev-dipendente)!

!

- Traslazione (sintesi proteica) nei ribosomi e sintesi di poliproteine virali immature.!

!

- Modicazione delle proteine (glicosilazione, miristilazione).!

!

- Assemblamento delle componenti virali sotto la membrana citoplasmatica.!

!

- Fuoriuscita della particella virale dalla cellula tramite gemmazione ("budding")!

!

- Maturazione delle proteine virali tramite la proteasi di HIV!

!

- Reinfezione di nuove cellule tramite contatto cellula-cellula (durante il budding) o contatto cellula-virus libero.!

Ciclo di replicazione di HIV e target 2 Entry inhibitors farmacologici! 3 Integrase !

Maraviroc Vicriviroc
1." 2.! 3.! 4." 5." 6.! 7.! 8.! 9." Binding & fusion" Entry" Uncoating" Reverse transcription! Integration" Transcription" Translation" Assembly & budding" Maturation!

inhibitors (INIs)"
RAL,EVG,GSK572

!9 Protease inhibitors (PIs)" SQV,IDV, RTV,NFV, APV,LPV, ATV,TPV, DRV

1 Fusion inhibitor (FIs)" T20

!8 Nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NRTIs)" AZT, ddI, ddC, d4T, 3TC, ABC, TDF, FTC

!4 Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs)" EFV, NVP, DLV, ETV

HIV and AIDS!

Inexorable decline of CD4+ T4 cells!

Why do all of the T4 cells disappear?

At early stages of infection only 1 in 10,000 cells is infected Late 1 in 40

Of great importance to therapeutic strategy

HIV LISI CELLULARE

HIV SYNCYTIA

HIV LISI MEDIATA DAI CTL

Why do all CD8+ killer cells disappear?!

At a late stage of HIV infection, the cytotoxic T cells disappear very rapidly These cells do not have CD4 antigen They are not infected by HIV There is a correlation of control of virus and presence of CD8+ cells HIV subtypes present in late infection cause mass apoptosis of CD8+ cells Cytotoxic T cells do have CXCR4 co-receptor. HIV binds but does not enter cells Signal from binding prompts mass suicide of CD8+/CXCR4+ cells

CD8 cell "

(no CD4 antigen) !

Macrophage !
chemokine !
CXCR4 !

gp120 !

HIV !

G protein signal !

Binding to CXCR4 results in expression of TNFalpha receptor II !

Binding to CXCR4 results in expression of TNF-alpha on the cell surface !

Apoptosis of T cells !

CD8 cell !

Macrophage !

CXCR4 !

Death !

CD8 T cell apoptotic bodies ! Macrophage ingests CD8 cell apoptotic bodies !

Immune responses against HIV!

HIV

Macrophages may be infected by two routes!

gp120 CD4

HIV gp120 binds to macrophage CD4 antigen Virus is opsonized by anti gp120 antibodies which bind to macrophage Fc receptors - an enhancing antibody

Fc receptor Anti-gp120

HIV

Cytokine networks that regulate human immunodeciency virus (HIV) replication. !

3 Typical cytopathic effect of human immunodeciency virus (HIV)-1 in cell culture; syncytium" formation with multinucleated giant cells is shown in a culture of CD4+ T cells.!

Chemochine e recettori specifci per lentrata e linibizione dellentrata di HIV!

Dal 2007 un farmaco inibitore di CCR5 entrato in uso nella pratica clinica!

Stato di latenza di HIV in cellule T prima dellintegrazione e dopo lintegrazione genomica

CARATTERISTICHE DI HIV
- E un virus scarsamente resistente allambiente esterno (in paragone ad altri virus, come il virus dellepatite B). - Sopravvive per poco tempo (ore o giorni, a seconda della temperatura, umidita, ecc) in ambiente esterno. - E inattivato rapidamente da: - Calore (56C per 10 minuti) - Perossido di idrogeno - Ipoclorito di sodio al 10% - Alcool etilico 40% - Paraformaldeide - Raggi ultravioletti

EPIDEMIOLOGIA DI HIV
Tempo di latenza per la sieroconversione (dal momento del contatto con il virus): 6 settimane (media) Tempo di latenza dalla sieroconversione alla malattia (senza terapia): 2 mesi ! 15 e piuanni. La sieroconversione definitiva, con leccezione di alcuni bambini di madre sieropositiva Numero di sieropositivi che andranno incontro alla malattia (in assenza di terapia) = >80 % Tutti i siero positivi, anche se asintomatici, sono portatori del virus , e quindi potenzialmente infettanti.

VIE DI TRASMISSIONE DELLA MALATTIA!

!

- Antigeni di HIV, o anche particelle virali complete, sono riscontrabili praticamente in tutti i uidi e secrezioni dellorganismo. Tuttavia, HIV e infettante solo in alcuni di essi:!
!

! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !

! ! ! !- Sangue ! ! !- Liquido seminale ! !- Secrezione vaginale !- Latte materno ! !- Saliva ! ! !- Lacrime! ! !- Sudore ! ! !- Urine ! ! !- Liquor cerebrospinale !- Fluido alveoli polmonari

!Infettivita! !++++! !++++! !+++! !+! !? (probabilmente -)! !? (probabilmente -)! !-! !? (probabilmente -)! !?! ?!

! - Derivati del sangue che:! !Trasmettono il virus !- Sangue intero ! !- Cellule ematiche ! !- Plasma ! ! - Fattori della coagulazione
!

!Non trasmettono il virus (in linea di massima)! !- Immunoglobuline! !- Albumina! !- Alcune frazioni plasmatiche! !- Fattori della coagulazione di sintesi !

Non stato segnalato nessun caso di infezione tramite punture di insetti, o legata alla condivisione di oggetti potenzialmente infetti (posate, bicchieri, lenzuola, ecc.)!

TRASMISSIONE EMATICA E PARENTERALE DI HIV! !! - Circa l80% degli emoliaci trattati con fattori della coagulazione estratti dal sangue sono sieropositivi per HIV.!
!

- La percentuale di tossicodipendenti sieropositivi non e nota con sicurezza, ma si ritiene che superi il 50%.!
!

- Politrasfusi hanno un rischio attuale di infezione molto modesto (inferiore a 1 sacca su 100.000 trasfuse).!
!

- Linfezione del ricevente e piu probabile se il donatore di sangue infetto e anche sintomatico.!
!

- Rischio di trasmissione da organo da sieropositivo (circa il 100%)!

!

- In nessun caso il donatore di sangue puo infettarsi.!

!

- Dose minima infettante di virus: non nota.!

!

- In caso di contaminazione parenterale (puntura accidentale), il rischio di infezione (sieroconversione) e largamente inferiore all1%, confrontato con quello da virus dellepatite B (superiore al 12%). La possibilita di acquisire il virus per puntura accidentale e comunque maggiore se la quantita di sangue inoculato era notevole, e se la ferita era profonda!

TRASMISSIONE PERINATALE DI HIV! ! - Rischio globale di infezione del bambino da madre sieropositiva (portatrice del virus): circa il 30-40% (in assenza di terapia)!
!

- Vie di infezione del bambino :! - Intrauterina (intorno alla 12-16 settimana, tramite la placenta)! - Durante il parto (contatto sangue materno-sangue fetale, ingestione di uidi infetti)! - Allattamento !
!

- Tutti i bambini di madri sieropositive sono a loro volta sieropositivi, in quanto hanno nel sangue gli anticorpi anti-HIV materni.!
!

- Falsi sieropositivi: Il titolo anticorpale cala con il tempo, per scomparire tra il secondo e il diciottesimo mese dopo la nascita. Sono tutte IgG. E impossibile isolare il virus dal sangue. Bambini non infettati!
!

- Veri sieropositivi: Il titolo anticorpale resta invariato o addirittura aumenta. Sono presenti, nelle prime settimane, IgM. E possibile isolare il virus dal sangue. Bambini infettati! ! - Il decorso della malattia nei bambini portatori del virus e solitamente pi rapido che nell'adulto. In alcuni casi, fortunatamente, e possibile arrivare alla pubert ancora in fase asintomatica.!

I soggetti infettati perdono progressivamente negli anni gran parte del loro patrimonio di Linfociti helper e diventano suscettibili a numerose infezioni "opportunistiche", " specialmente fungine (candidosi, aspergillosi, criptococcosi), protozoarie (toxoplasmosi, pneumocistosi) e virali (infezione da Herpes e Cytomegalovirus); " anche la suscettibilit a particolari tipi di tumori (sarcoma di Kaposi, linfoma non-Hodgkin) notevolmente aumentata.!

HIV, AIDS and Pneumocystis carinii

With giemsa stain intracystic bodies of Pneumocystis carinii in lung are seen in this cytologic preparation from a bronchoalveolar lavage

dissemination to extrapulmonary sites, Pneumocystis carinii tends to produce foci with prominent calcification, as seen in the kidney here grossly.

HIV and AIDS"

an infectious agent Kaposis Sarcoma"
!

HIV and AIDS!

Candida infections are common with AIDS, but most often appear as oral thrush, which is a nuisance but not life-threatening. Disseminated infections are uncommon, but here is a rare Candida pneumonia, which resembles a bacterial bronchopneumonia.

AIDS Statistics
Approximately 8500 new HIV infections occur daily around the world Over 90% of these are in developing countries 1000 are in children less than 15 years of age. Worldwide ! Current estimates are that in 2007, 33.2 million people have HIV infection

USA
As of June 2000, 753,907Americans reported with AIDS. At least 438,795 of them have died.

Sub-Saharan Africa
! About 1 million new cases of AIDS per year ! 22.5 million people with HIV infection ! Several countries in sub-Saharan Africa report infection rates of 20-25%

South and East Asia

! In south and east Asia there are more than 200,000 new cases per year and 7.3 million people with HIV

The cellular and immunological picture - The course of the disease

Perdita di CD4+T4 cellule helper Malattia con CD4+ < 250 cells/ mm3

Malattia avanzata
Perdita di CD4+T4 e CD8+cellule killer

Natural history of human immunodeciency virus (HIV) infection. !

HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS PATOGENESI Perdita T cellule CD4+ Corso: 8-10 anni Corso pi lungo per lHIV-2 Infezione primaria 107 particelle virali/ml sintomi di tipo inluenzale risoluzione in poche settimane controllo attraverso immunit umorale e cellulare plateau: 103-105 copie RNA/ml >105 copie RNA/ml ! progressone rapida sviluppo di disfunzione immunitaria e infezioni opportunistiche

Prima fase! PRIMA FASE

!

- Vie di entrata di HIV nellorganismo: - Sangue (tossicodipendenti, trasfusi, ecc) - Organi genitali (contatti omo- eterosessuali) - Retto (contatti omosessuali) - Cute (punture accidentali, ferite, ecc) - Mucose (contaminazioni, ecc) - Organi (trapianti) - Infezione delle cellule locoregionali - Macrofagi - Cellule dendritiche - Linfociti CD4 helper Fase clinicamente latente: puo durare da un minimo di 4-6 settimane a solitamente non piu di 6 mesi. - Rapida e abbondante replicazione virale produzione anticorpale contro HIV assente : soggetto infettato ma sieronegativo (periodo finestra).

Seconda fase!
! ! Fase acuta o infezione primaria! ! Sintomi aspecici (simil mononucleosici o similinuenzali)! Comparsa di anticorpi anti HIV (sieropositivit)! Carica virale elevatissima (oltre un milione di copie di RNA virale/ml)! Deplezione abbondante di CD4! Risoluzione in poche settimane! Controllo attraverso immunit cellulare e umorale! Plateau: 103-105 copie RNA/ml! !se > 105 copie RNA/ml -> progressione rapida! !

Terza fase
Periodo asintomatico Latenza clinica. Da pochi mesi a 15 anni Assenza di segni clinici della malattia. Replicazione virale continua e abbondante : circa 10 miliardi di particelle/die prodotte ed eliminate ogni giorno Carica virale: 10.000-100.000 copie RNA/ml Deplezione linfocitaria: Un miliardo di linfociti CD4 uccisi ogni giorno, controbilanciati dalla neoproduzione di linfociti da parte del timo Alterazione dei linfonodi ! t 1/2 virioni = 6 ore ! t 1/2 cellule = 2 giorni !

Quarta fase
Fase sintomatica Carica virale ancor pi elevata: oltre 100.000 copie RNA/ml 50% dei casi varianti virali pi citopatiche Fino a 1 milione di diverse varianti virali genetiche - Linfociti CD4 < 300/mmc Comparsa dei primi sintomi: candida, herpes, deperimento organico, primi segni di alterazioni neurologiche. -!Linfociti CD4 < 200/mmc Comparsa di infezioni da germi opportunisti (pneumocystis carinii, cytomegalovirus, micobatteri atipici, toxoplasma, ecc) - tumori rapidamente letali (linfomi, carcinomi) - sarcoma di Kaposi - AIDS-dementia complex

Fattori che possono influenzare l'evoluzione della malattia (accelerandone il decorso): - Defedamento - Immunocompromissione - Inoculo ripetuto nel tempo di HIV - Inoculo massivo (anche se unico) di HIV - Attivazione linfocitaria: - Da antigeni - Da patogeni opportunisti o meno : CMV, HBV, HCV, HSV - Allogenica : Liquido seminale, sangue !

HIV and AIDS!

Good correlation between number of HIV particles measured by PCR and progression to disease

Viral load predicts survival time

CD4 cell count is not a good predictor of progression to disease

NEW guidelines

On December 1, the U.S. Department of Health and Human Services (DHHS) updated its guidelines for antiretroviral therapy (ART) for HIV positive adults and adolescents. In keeping with recent research, the revision calls for earlier treatment: ART is now recommended for people with 350-500 cells/mm3, and half the expert panel favored treatment even for those with more than 500 cells/mm3.

Polymorphism population!
RT has a high error rate 1:2,000-10,000! ! HIV genome 9749 nucleotides! ! Therefore EVERY new virus has at least one mutation!! Every possible single mutation arises daily! ! The viral population in an infected person is highly heterogeneous!

vaccine problem

Population Polymorphism!
! Initial infecting virus is macrophage-tropic (has CCR5 as co-

receptor) ! These are non-syncytium-inducing strains (Note: most vaccines have been made against syncytiuminducing T4 cell tropic strains) ! As virus mutates, it changes subtypes of cells that it infects as the ability to bind different co-receptors changes

Population Polymorphism!
Early in infection:
! Macrophage-tropic ! Non-syncytium-inducing ! Slowly replicating

Late in infection
!T4 cell tropic ! Syncytium-inducing ! High titer virus

What is Tropism?!
!!

Tropism refers to the affinity of a virus, or the preferred pathway a virus uses to enter a certain cell type. Specifically for the HIV-1 virus, the type of tropism refers to which co-receptor the patients virus uses to enter the cells.

!!

HIV entry
3) Conformational change 1) HIV near to target cell gp120-co-receptor binding

2) Binding between CD4 receptor and viral gp120

4) membrane fusion

Co-receptor Is Required for Viral Entry

! The chemokine receptors CXCR4 and CCR5 are members of the G protein-coupled receptor superfamily and have been identied as the principal co-receptors for HIV-1.!
CCR5 CCR5
CXCR-4 CXCR4

Basic
G

T E

S R T Y Q

R V S S A

P E

CCR5 = CXCR4

E I S V G L-

COOH 352

Q A M Q V T T E L M G T C H C N I P I I Y F A E V G 303- K L L V F F Y R N F Q K A I H K R F C K C F Q Q E A C S I
277-

Q Y D M - NH2 S V S P N Y Y T I Y D I S E L P Q F G Q C S Q Y W I K F P Y K N F V W D F G F N Q N H E K G E F A T S Q Q L K Q A M S I A H Q F T A C C Y A S T L T 31- R Y -89 102- Q R -168 K -197 N -258 L L P L H T I L P A L F V L Y S L F P W G L T I G I L G I V I L L T V F Y L P L Y N V F V L L S P I F I F L F A L P W A F F G G F V L F D L G S M V F L V G F V V A S I Y M N A I F F T C V I I V W L L I I Y M I L N L I S V G S T I V L L T I F L I Y I L T L L I V I 67- I 219- K N -57 D -125 146- V R -235 R G T V C D F A Y L K T T L R L R M L K S V R H A R T C V R N V R E K K H A Acidic A V F A L K

N N C

S S N R L D

T Y I S I G E M - NH 2 DS N Y YD S MK T D E G E E M GS IK Q GC P C I E DL W ER F E F E PN V F Y L N E W G Y V N F L N A N V D A A I T F R D E F N V V L D R Q F S F N H A C C Y V F S K K -282 I Q -202 39D -97 110- K D -262 N -176 F W P L AV A HI IS FA IIS VIH YS FFI VGM GII FPW ATG I I T L T Y IDP I L Y Y L IV FFA TFL LVN LTL GLP WPL F CCH VGI DLL SYS PLA IIV FCA G A V L F N L I S V GLN ILL VGW CYS LIA L LPI I V L H F A Y V I C I L Y RY I V II FLA MLV TVT L S V G Y -65 75- K A G 154- K 224- S K -239 308D -133 K E R Q K L A QHA D F A S Y Cytoplasmic K L A T L K T L L S K K M L R S L H A G R S V ST R S K I K LS SK G H Q R K VH K G RG AT N S Q RP I K L S G H S S S S ES F ET VS = Predicted G-protein binding domains S H S S -352

Ser/Thr rich

!!The

tropism is based upon the presence of selected aminoacids in gp120 (within V3 loop, but not only). They can confer greater affinity to CCR5 or CXCR4.

16 V3 loop residues are associated with co-receptor usage

CXCR4 usage is strongly associated with the presence of mutations S11R and H13Y

Residues in red are determinant for the co-receptor choice.

Sing et al., 2006

Chemochine e recettori specifci per lentrata e linibizione dellentrata di HIV!

Dal 2007 maraviroc (inibitore CCR5) entrato in uso nella pratica clinica!

HIV co-receptor usage R5 Virus

!They use only CCR5 co-receptor !They are predominant at trasmission and in early stages of infection

X4 Virus
! They use only CXCR4 co-receptor ! They emerge in late stages of infection

!They are associated with a more rapid decline of CD4+ T cell and disease progression

Dual tropic Virus

!They use either CCR5 or CXCR4

Viral mixed tropic population

Which is the prevalence of co-receptor usage?

CELLULE BERSAGLIO DI HIV

HIV infetta soprattutto cellule del sistema immunitario (cellule dendritiche, macrofagi, linfociti T) e cellule endoteliali. Causa effetti citopatici nelle cellule permissive: come sincizi, morte cellulare per apoptosi o necrosi. - Macrofagi (incluse le cellule microgliali del sistema nervoso centrale) e linfociti CD4 sono il principale bersaglio di HIV in vivo. La loro infezione e in grado di spiegare praticamente tutte le alterazioni causate dal virus nei pazienti. - Altre cellule potenzialmente infettabili da HIV : - Tutte le cellule umane aventi il recettore virale (CD4) sulla membrana Ma anche cellule CD4- come cellule del SNC (astrociti, oligodendrociti)

Alterazioni immunologiche indotte da HIV: - Deplezione lenta e progressiva di linfociti CD4 (cellule chiave per lattivazione di corrette risposte immuni dellorganismo) per uccisione diretta, formazione di sincizi, mediata da cellule killer, da morte programmata, ecc - Produzione elevata di immunoglobuline non specifiche per nessun agente patogeno (risposta immune non efficace) - Alterazione della funzione dei linfociti killer (mancata risposta a infezioni virali e a tumori) - Disfunzione dei macrofagi, con mancato inizio della risposta immune per alterata presentazione dellantigene, ridotta fagocitosi dei microorganismi (p.es. a livello polmonare) Alterazioni neurologiche indotte da HIV - Disfunzione e morte neuronale per produzione e rilascio, da parte dei macrofagi cerebrali infettati, di sostanze tossiche cellulari e virali.

Anti-HIV Strategies!
! Education Sexually transmitted Not highly infectious ! Chemotherapy Mutation selection but Suppress replication No capacity for mutation Resistance

HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS DIAGNOSI Test sierologici ! antigeni o anticorpi Ricerca diretta ! virus o sequenze genomiche virali Test sierologici Anticorpi rilevabili dalle 6-12 settimane dallinfezione e presenti in tutti i pazienti entro i 6 mesi Campioni positivi sono rivalutati con test di conferma Anticorpi contro p17, p24, p55 precoci e diminuiscono Anticorpi contro gp160 e gp120 pi tardivi e persistenti Positivit di un numero variabile di bande - ELISA e Western blot specificit intorno al 100%

Test per la rilevazione di antigeni ELISA per p24 Infezione primaria prima sieroconversione, neonati Screening trasfusioni Coltura virale in vitro Plasma o PBMC - Sensibilit : 95% Ricerca sequenze nucleotidiche DNA provirale nei PBMC

RNA virale nel siero o plasma

Gene gag o pol - Sensibilit del 99% solo se almeno 10 copie genomiche virali presenti

HIV Infection: " Critical points in a Diagnostic Laboratory!

! Early infection diagnosis (adults and children)! ! Conrmation of seropositivity! ! HIV-RNA & HIV-DNA quantication and monitoring! ! Variability of HIV! ! Drug-resistance and tropism !

Fasi nestra nellinfezione da HIV!

PROFILO CLASSICO DI SIEROCONVERSIONE

Tempi per la rilevazione dei marcatori diagnostici

Marcatore

RNA virale Antigene p24 DNA provirale Anticorpi

Finestra 11 per gg. Ab 1-25 = gg. 21 giorni

16 gg. 16 gg. 21 gg. 3-30 gg. 3-30 gg. 9-34 gg

Tempo medio per la rilevabilit

Intervallo di confidenza (95%)

Le generazioni dei test anti-HIV!

! Prima generazione (marzo 1985, Abbott HTLV-III EIA): formato indiretto, lisato virale! ! Seconda generazione (1987): formato indiretto, Ag ricombinanti/peptidi aumento sensibilit e specicit! ! Terza generazione (1994): formato diretto (sandwich), Fase solida rivestita di Ag ricombinanti/peptidi, migliore sensibilit in sieroconversione (IgM, IgA, IgG)!

! Quarta generazione (1999): rilevazione simultanea di anticorpi e antigene gag p24, ulteriore riduzione della fase finestra

Infezione da HIV: chiusura del periodo nestra con i diversi test sierologici e molecolari" " " HIV-RNA (plasma) " " Ag p24 "
three assays: EIA 4 generazione VIDAS Ultra, VIDAS Quick, and ARCHITECT)" detected infection before the p24 specic assay (Coulter)" and less than 3 days afterNAT" EIA 3 generazione "
EIA 2 generazione

EIA 1 generazione

10

20

30

40

50

60

70

80

Giorni dopo l'esposizione

da: B. Weber, Expert Rev Mol Diagn 2006; 63 (3): 399-411

La conferma: Western blot!

Caratterizzazione con saggio di conferma Western Blot
gp160 gp120

Criteri di positivit 1) CDC: 2 bande tra p24, gp41, gp120/160

Camp. Ente CRITERIO 1 2 3 4

p65 p55 gp41 p32 p24

2) WHO: almeno 2 bande env FDA p24, p32 e gp41 e/o gp120/160
CDC p24 e gp41 e/o gp120/160 3) ARC: 1 gag, 1 pol, 1 env WHO gp41 e gp120/160 Infezione recente?

p18

4) Mah (Africa): gp160, p31

CAMP.

Diagnosis of Acute HIV infection

Negative/Indeterminate + HIV antibody test

Detectable RNA

If diagnosis is made by HIV RNA testing, confirmatory serologic testing should be performed subsequently