TECNOLOGIA ANTISENSO

E
INTERFERENCE
 ANTISENSO

I primi lavori nel campo dell’antisenso usavano soprattutto oligonucleotidi che venivano
introdotti nelle cellule.
Oligonucleotidi antisenso di 20-25 nucleotidi erano progettati in modo che da legarsi
selettivamente con un mRNA bersaglio mediante appaiamenti di Watson e Crick.
Il duplex DNA-RNA che si forma inibisce la traduzione dell’mRNA nella proteina
corrispondente alterando la sintesi proteica, lo splicing, e/o la degradazione
dell’mRNA.
 ANTISENSO

Alcune volte il filamento di mRNA del duplex ibrido è tagliato dalla RNasi H, ma
nella maggior parte si ha l’arresto della traduzione mediata dal blocco della lettura
da parte del ribosoma (che non può scorrere su una doppia strand).
I corti oligonucleotidi antisenso hanno però uno scarso effetto di soppressione
dell’espressione genica,
genica a causa del loro trasporto inefficiente all’interno delle
cellule, e quindi a causa della scarsa quantità disponibile.
 Vettore di espressione
ANTISENSO

RNA antisenso

Per superare questo inconveniente (scarsa quantità) una alternativa valida consiste
nell’introduzione di un vettore di espressione ricombinante che codifica e
sintetizza un RNA antisenso nella cellula ospite.
L’RNA antisenso clonato in un plasmide è trascritto dall’RNA Polimerasi
cellulare e formerà quindi un duplex con l’mRNA complementare all’interno della
cellula (DS RNA).
Ciò impedirà la traduzione della proteina corrispondente.
 ANTISENSO
Vettore di espressione

RNA antisenso

Poiché è espresso DENTRO la cellula, il costrutto antisenso dura più a lungo

degli oligonucleotidi antisenso in cui i processi di introduzione sono limitanti.
In ogni caso un uso generalizzato dell’espressione di RNA antisenso era limitato
dalle basse efficienze di TRASFEZIONE.
TRASFEZIONE
RNA INTERFERENCE
L’interferenza da RNA (RNAi) è
una delle scoperte più interessanti
e innovative dell’ultimo decennio
tanto che nel 2002 la prestigiosa
rivista scientifica SCIENCE ha
indicato l’RNAi come la scoperta
più importante dell’anno.

Nel 2006 ai suoi scopritori è stato

assegnato il premio NOBEL per
la Medicina e Fisiologia.

FIRE E MELLO
 RNA INTERFERENCE

Ė una forma di “SILENZIAMENTO” genico post trascrizionale

(post-trascriptional gene silencing, PTGS) mediata da una molecola
di RNA a doppio filamento (dsRNA).

Ė quindi un processo in cui un RNA a doppia strand segnala e

induce la degradazione e l’inattivazione di un RNA messaggero
ad esso omologo.

L’RNAi sembra svolgere una funzione naturale per proteggere il

genoma dall’invasione di elementi genetici mobili (virus e
trasposoni), oltre che un insieme di funzioni per lo sviluppo
orchestrato degli organismi eucariotici.
Nel 1990 Jorgensen e colleghi pubblicarono un articolo interessante che
riportava i loro tentativi di ingegnerizzare le petunie per produrre fiori rossi o
viola più scuro.
Per raggiungere questo scopo, i ricercatori introdussero nelle piantine alcune
copie aggiuntive di un gene (calcone sintasi) noto per codificare un enzima
chiave nella colorazione dei petali (antocianina).
Sorprendentemente, molte piantine così trattate non presentavano gli attesi colori
intensi ma ottennero alcuni fiori variegati ed altri bianchi.
 COSOPPRESSIONE

Attraverso un'analisi più precisa, i ricercatori furono in grado di

scoprire che sia il gene endogeno per la calcone sintasi che il gene
esogeno (transgene) responsabili della colorazione erano stati
soppressi.

Gli studi successivi mostrarono che i livelli di mRNA endogeno per

la calcone sintasi erano ridotti di 50 volte rispetto ai livelli selvatici
in seguito alla trasformazione della pianta.

Per questo motivo, il fenomeno fu inizialmente definito come co-

soppressione dell'espressione genica: il meccanismo molecolare, in
ogni caso, rimaneva ignoto.
MACCHINARIO DELLA RNAi
- Introduzione nella cellula di dsRNA prodotto dai ricercatori o RNA virale a
doppia strand.
strand
- Nel nucleo il gene bersaglio è stato trascritto in un messaggero bersaglio.
- Introduzione nella cellula di RNA virale a doppia strand o dsRNA prodotto dai
ricercatori.
- Nel nucleo il gene bersaglio è stato trascritto in un messaggero bersaglio.
 A)
DICER
In cellula una ribonucleasi nota come DICER è coinvolta nel taglio di lunghe molecole di
RNA a doppio filamento (dsRNA) in frammenti di 21 nucleotidi (i siRNA o Short
Interfering RNA).
RNA) (1)
Il nome DICER (che in italiano potrebbe essere tradotto come generatore di cubetti),
cubetti deriva
proprio dalla sua capacità di ridurre molecole di dimensioni eterogenee in piccoli blocchi di
dimensione omogenee.
ATTIVITA’ DI DICER
B)

Le molecole di siRNA (RNA a doppio filamento di 21 nucleotidi) hanno 2

nucleotidi sporgenti all’estremità 3’ OH.
Non è ancora chiaro come siano generati, il biogenesis pathway dei
piRNA è diverso da quello sia dei miRNA che dei siRNA.
siRNA

Infatti la produzione dei piRNA è indipendente dall’enzima Dicer,

questo suggerisce che il meccanismo di biogenesi sia distinto da quello
degli small RNA canonici, come i miRNA e siRNA

Caratteristiche:
Caratteristiche

I piRNAs non hanno chiari motivi di struttura secondaria e la presenza di

una uridina in 5’ è comune a piRNAs sia nei vertebrati che negli
invertebrati.

Si pensa che ci siano centinaia di migliaia di specie diverse di piRNA nei

mammiferi.

Fino ad ora, oltre 50.000 sequenze di piRNA sono state scoperte nei topi e
più di 13.000 in D. melanogaster.
Localizzazione

I piRNAs si trovano in gruppi in tutto il genoma, e i gruppi possono

contenere da un minimo di dieci o fino a molte migliaia di piRNAs.

In D. melanogaster e vertebrati sono stati localizzati in aree prive di

geni che codificano per proteine, mentre in C. elegans sono stati
identificati tra i geni codificanti proteine.
In cellula sono stati evidenziati sia nel nucleo che nel citoplasma,
suggerendo che possono agire in entrambe queste aree e, quindi, avere
molteplici effetti.
Negli invertebrati,
invertebrati sono stati rilevati sia nella linea germinale maschile
che femminile, ma non in altri tipi cellulari.
Nei mammiferi,
mammiferi i piRNAs si trovano solo nei testicoli, con una stima di
un milione di copie per cellula negli spermatociti e negli spermatidi.
Funzioni

Come già detto la maggior parte di essi sono antisenso delle sequenze di
trasposoni,
trasposoni suggerendo che i trasposoni rappresentano il loro bersaglio.

Il silenziamento dell'RNA

I piRNA hanno un ruolo nell’inibizione dell’espressione genica attraverso

la formazione di un complesso silenziatore indotto da RNA (RISC),
RISC con le
proteine Piwi , che sono attive nelle cellule germinali e staminali.

È stato scoperto che due proteine Piwi, MIWI e MILI, MILI hanno una
significativa importanza nella spermatogenesi nei topi.

I piRNAs possono essere trasmessi dalla madre alla progenie, con effetti
epigenetici di derivazione materna.