I PERICOLI DEL DOGMA:

I GENI ESPRIMONO SE STESSI COME PROTEINE

MA LA COMPLESSITA’ DI UNA SPECIE CORRISPONDE CON IL NUMERO DEI GENI
NEL SUO GENOMA?

VV
 DNA codificante: ≈ 2% 3x109 basi (introni+ DNA intergenico)

IL NOSTRO GENOMA:

“in un certo qual modo assomiglia al vostro garage/camera da letto/frigorifero/vita: altamente

individualista, ma mal tenuto; poca evidenza di organizzazione; molte cianfrusaglie accumulate
(chiamate da non iniziati “spazzatura”); praticamente non viene mai scartato niente ed i pochi
articoli chiaramente di valore sparsi in giro indiscriminatamente, senza cura.

Gallagher & Dennis (2001)

AL CONTRARIO, LA QUANTITA’ DI DNA NON CODIFICANTE AUMENTA
CON LA COMPLESSITA’

National Human Genome Research Institute

1194 SEGMENTI GENOMICI ALTAMENTE CONSERVATI

20% DNA codificante 70% DNA intronico DNA intergenico

proteine
DNA NON CODIFICANTE PROTEINE
 IL GENOMA NASCOSTO

DNA codificante

RNA
RNA (RNA-only genes)
Proteine

X
GENE UNITA’ TRASCRIZIONALE = qualunque segmento di DNA che
viene trascritto a RNA

GENI RNA-ONLY

PSEUDOGENI RIBOSWITCHES DNA DELL’ELICA INTRONI

COMPLEMENTARE

RNA interference
 PSEUDOGENI

Il caso di makorin1-p1

Topo transgenico per sex-lethal (gene dello sviluppo sessuale in drosophila)

Costruzione di una genoteca genomica e screening con una sonda omologa a sex-lethal
per individuare il punto di inserzione

Sex-lethal inserito all’interno

di makorin1-p1
 -Knock-out di makorin1-P1 impedisce l’espressione del gene makorin1

-Makorin1-p1: copia accorciata del gene Makorin1 (gene ancestrale a funzione ignota)

-Nel topo esistono molti pseudogeni di makorin1, ma nessuno produce proteine

-lo pseudogene controlla l’espressione del gene “vero”, di cui simula la sequenza,
anche se collocato su un diverso cromosoma. Come?

Hp1: meccanismo RNA-mediato:

l’RNA pseudogenico compete
con il genico come substrato per
una RNAsi

Hp2: meccanismo DNA-mediato:

elementi regolatori dello pseudogene
competono per repressori della
trascrizione
 GENI RNA-only CHE GUIDANO LA FUNZIONE DI PROTEINE

Displasia metafisaria senza ipotricosi

Mappatura della patologia in una regione del cromosoma 9: nessuna mutazione nei
10 geni codificanti proteine presenti

2001. Mutazione puntiforme del gene RNA-only RMRP

RMRP: l’RNA trascritto assume una conformazione tridimensionale mediante la quale

si lega ad una proteina per formare un enzima attivo nel mitocondrio
I RIBOSWITCH
 LA SCOPERTA DELL’RNA INTERFERENCE (RNAi)

TG: Calcone sintasi: enzima

per la sintesi delle antocianine

L’espressione del transgene

spegneva anche l’espressione
del gene endogeno:
CO-SOPPRESSIONE

E’ MEDIATA DA UN INTERMEDIO A
dsRNA
IL SILENZIAMENTO GENICO OPERATO DA dsRNA E’ STATO SCOPERTO NEI NEMATODI

I DNA e gli RNA

ANTISENSO
L’esperimento di Guo e
Kemphues (1995)

Antisense RNA
RNA sintetizzato in vitro RNA Senso (Controllo)

Iniettato nelle gonadi del verme

to the wor

Antisense RNA RNA Senso (Controllo)

dsRNA
mG AAAAAAAAA A mG AAAAAAAAA
Par-1 mRNA RNAm di Par-1

Mortalità embrionale Mortalità embrionale

???

Surprisingly, injection of in vitro synthesized sense RNA

from the cDNA ZC22 also induced par-7 phenotypes
at a high frequency among the progeny of injected worms.
It is not clear what accounts for this effect.
(Guo et al, Cell. 1995)
Hp) La degradazione indotta da dsRNA può essere dovuta ad meccanismo cellulare di difesa da virus a RNA
o da eventi di trasposizione indesiderati.

VIE DI SOMMINISTRAZIONE DI dsRNA NEL C.elegans

3 Il verme viene inzuppato in una soluzione contenente dsRNA

Potent and aspecific genetic interference by double-stranded RNA in C.elegans
Fire et al, Nature, 1998

dsRNA (GFP) introdotto embrioni

oralmente

-Il dsRNA è fino a 100 volte più potente del ssRNA

-Il silenziamento viene trasmesso nella linea germinale anche per alcune generazioni

- Il silenziamento può diffondere da tessuto a tessuto

 IN CHE MODO SI PU0’ GENERARE dsRNA?

Introducing chalcone
Synthase transgenes

IL CASO DELLA CO-SOPPRESSIONE

PROBLEMI NELL’INTEGRAZIONE DEL TRANSGENE

Riconoscimento dell’RNAm transgenico

RNApol-RNA-dipendente

asRNA dsRNA

sRNA

Accumulo di difetti nella processazionedell’RNAm?

Marcatura della cromatina del transgene prima dell’integrazione?
 IL dsRNA SI FORMA ANCHE PER MECCANISMI NATURALI

DNA DELL’ELICA COMPLEMENTARE

RNA ANTISENSO

CompuGen: almeno 1600 geni umani hanno un corrispondente sull’altra elica che
può essere trascritto in RNAas
 La comparazione con l’espressione genica di C.elegans resistenti all’RNAi porta all’isolamento
dei geni coinvolti nell’RNAi

Il confronto dei geni individuati con altri organismi indica che tutti i meccanismi di silenziamento
hanno in comune un meccanismo di base, che ha la propria origine in un ancestrale progenitore
comune a funghi, piante ed animali.
 DICER

1) Dicer riconosce e lega dsRNA e lo processa in siRNA

Regione RNAsi III-simile

Dominio per il legame a dsRNA
RNA elicasi

siRNA (short interfering RNA)

• Lunghi circa 21-26nt

• Gruppo fosfato in 5’ e OH in 3’
• 2-3nt sporgenti in 3’
• Prodotti di Dicer
 SILENZIAMENTO DEL GENE PER METILAZIONE
DELLA CROMATINA
RITS

oppure

Modificazione della cromatina (metilazione delle C)

Eterocromatizzazione e SILENZIAMENTO GENICO

2) Si forma un complesso multiproteico inattivo

(siRNA/proteine)

3) Il complesso diventa attivo

(RISC = RNA-induced silencing complex)

• E’ coinvolta attività elicasica

• L’incorporazione del siRNA antisenso
attiva RISC

4) IL COMPLESSO USA L’RNAas PER INDIVIDUARE

L’RNAm OMOLOGO

SILENZIAMENTO PER TAGLIO DELL’RNAm 5) RISC taglia l’RNAm silenziamento

IL SILENZIAMENTO PUO’ DUNQUE ESSERE A PIU’ LIVELLI: IL siRNA INDUCE, SIA DISTRUZIONE
DELL’RNAm, SIA INATTIVAZIONE DEL GENE SPECIFICO
Come si spiega che pochissime molecole di dsRNA sono sufficienti per indurre -in C.elegans e nelle
piante- un RNAi completo, sostenuto nel tempo e propagato nelle generazioni e nei tessuti?

• RNA-dependent RNA Polymerase (RdRP)

• LA PCR DEGRADATIVA
 I miRNA (micro-RNA)

-Derivano da introni che hanno

subito splicing o da altro DNA non
codificante, singolo o organizzato
in tandem, e strettamente
clusterizzato.

-Sono meno omologhi al loro RNAm bersaglio rispetto ai siRNA

-I pri-mi-RNA vengono tagliati a pre-mi-RNA da DROSHA, una

RNA-pol di tipo III

-Vengono ulteriormente processati da Dicer a mi-RNA di 21bp con 5’-P

e 3’-OH sporgente

-Bloccano la traduzione anche senza distruzione dell’RNAm, che rimane

associato ai ribosomi

Taglio dell’RNAm Blocco della traduzione

 3 modi per effettuare l’RNAi

Quali sono le funzioni dei miRNA?

>>
250 100

Cluster miR-290/-295: mantenimento della totipotenza

delle ES nel topo
-L’appaiamento impreciso tra i miRNA e l’RNAm bersaglio
suggerisce che ciascun miRNA possa legarsi ad un ampio
spettro di diversi RNAm: enorme potenziale di regolazione

-Pochissimi dei geni bersaglio dei miRNA identificati negli

insetti corrispondono a quelli degli ortologhi miRNA dei
vertebrati, sebbene la loro sequenza (e quindi quella della
sequenza del sito complementare) si sia conservata
attraverso grandi distanze filogenetiche: flessibilità evolutiva
 L’ RNAi COME METODICA PER IL SILENZIAMENTO DELL’ESPRESSIONE DI
GENI SPECIFICI NEI MAMMIFERI

Distruzione di RNAm aspecifici

PKR (Protein cinasi dsRNA-dipendente)
dsRNA lunghi Blocco generalizzato della sintesi
proteica
Produzione di interferoni

TUTTAVIA….

-I componenti della via dell’RNAi sono conservati anche nei mammiferi

-dsRNA lunghi possono innescare risposte gene-specifiche quando vengono

introdotti in cellule embrionali di mammifero (risposta antivirale aspecifica
al dsRNA non è prevalente)

?
Risposta difensiva
sequenza-aspecifica
X RISPOSTA AL dsRNA RNAi sequenza-specifico

dsRNA PIÙ PICCOLI DI 30bp INDUCONO RNAi SENZA ATTIVAZIONE DI PKR

 I siRNA e gli shRNA (short hairpin RNA)

siRNA da sintesi in vitro Gli shRNA sono codificati

possono essere introdotti da vettori di espressione
(siRNA)
nelle cellule attraverso a DNA che vengono trasfettati.
qualunque delle convenzionali Possono avere promotori inducibili
metodiche di trasfezione

La maggiore efficacia dell’uno o dell’altro dsRNA varia da caso a caso

 siRNA shRNA

-facile reperibilità -effetto repressivo sostenuto nel tempo

-alta efficienza di entrata (possibilità di integrazione nel cromosoma)
-massima concentrazione del silenziatore genico -trasmissibilià alle cellule figlie
-vettori di espressione siRNA propagabili
indefinitamente

-effetto transiente (diluizione durante le

divisioni cellulari.
Assenza di meccanismi propagativi e amplificativi
nelle cellule di Mammifero)
-resistenza di certi tipi cellulari alla trasfezione -ancora troppo preliminari le conoscenze che
-alterazione della fisiologia cellulare consentono di disegnare shRNA molto efficienti
dovuta alla trasfezione stessa

PROSPETTIVE TERAPEUTICHE DELL’RNAi

Proteine virali e/o
proteine cellulari
Terapia antivirale necessarie per il ciclo
del virus (es: HIV,
epatite C)

Oncogeni, fattori di
Terapia anticancro crescita, proteine anti-
apoptotiche

Patologie su base genetica

 IL TOPO KNOCK-OUT

Permette di studiare l’impatto di un gene endogeno sullo sviluppo e sul metabolismo

di un organismo superiore, attraverso la sua soppressione. Permette di ottenere
modelli animali per la compresione delle malattie umane

E’ ESSENZIALE PILOTARE LA REGIONE DOVE INSERIRE LA CASSETTA DI ESPRESSIONE

MEDIANTE GENE-TARGETING
Knock-out-/- di HIF1α
α
Assenza di vascolarizzazione della regione neurale
e scarsa vascolarizzazione dei somiti.
Visualizzazione delle cellule endoteliali con un marcatore
per CD31