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Le funzioni del DNA

Replicazione

Allosintetica

Trascrizione

Sintesi di RNA
Sintesi Proteica

Auto-sintetica

mRNA
rRNA
tRNA
snRNA

Replicazione del DNA

Traduzione
Proteina

Proteine
strutturali

Enzimi

Controllo
delle attivit
metaboliche

Proteine
con funzioni
speciali

Espressione del DNA


Funzione allosintetica

snRNA

Sintesi di RNA

rRNA
mRNA
tRNA

Controllo sulla morfologia e funzione


cellulare

PROTEINE

Trascrizione

Nucleotide = Nucleoside + Gruppo Fosfato


Il nucleoside composto da una base azotata e da uno
zucchero pentoso (a 5 atomi di C):
Ribosio nell acido Ribonucleico, RNA
Deossiribosio nell acido Deossiribonucleico, DNA

Basi Azotate
Puriniche

Adenina
Guanina
Timina (solo nel DNA)

Pirimidiniche

Uracile (solo nel RNA)


Citosina

Basi Azotate e Zuccheri Pentosi


Basi Puriniche (dalla Purina)

Adenina (A)

Guanina (G)

Basi Pirimidiniche (dalla Pirimidina)

Citosina (C)

Timina (T)

Uracile (U)

Zuccheri

Ribosio

2 - deossiribosio

RNA
mRNA- RNA messaggero- viene tradotto in un polipeptide
rRNA- RNA ribosomale- viene utilizzato per la costruzione dei ribosomi
tRNA- RNA transfer- porta gli aminoacidi sul polipeptide nascente
snRNA- small nuclear RNA- piccoli RNA nucleari complessati con proteine che
mediano la maturazione degli RNA che vengono poi trasportati nel citoplasma
snoRNA-small nucleolar RNA- piccoli RNA nucleolari, svolgono parecchie funzioni
(partecipano alla biosintesi dei ribosomi, modificano il ribosio di alcuni RNA
attraverso laggiunta di gruppi metilici, partecipano allo splicing alternativo, serve
da templato per la sintesi dei telomeri
miRNA-microRNA- piccole molecole di RNA (22 nucleotidi) che controllano
lespressione di RNA messaggeri

Complementariet delle
Basi Azotate
La sequenza di basi di una catena polinucleotidica del DNA
determina la sequenza di basi nell altra catena
polinucleotidica antiparallela
3

A T A C G C T G

T A T G C G A C
5

Complementariet delle
Basi Azotate
La sequenza di basi di una catena polinucleotidica del DNA
determina la sequenza di basi in una catena polinucleotidica
nascente di RNA
3

A T A C G C T G

U A U G C G A C
5

IL DOGMA CENTRALE DELLESPRESSIONE GENICA

IL DOGMA CENTRALE DELLESPRESSIONE GENICA

RELAZIONE FUNZIONALE TRA GENI ED ENZIMI

RELAZIONE FUNZIONALE TRA GENI ED ENZIMI


Dato che ciascun mutante era deficitario di un singolo
gene, Beadle e Tatum proposero lipotesi:
UN GENE- UN ENZIMA
Secondo cui la funzione di un gene consiste nel fornire
informazioni per la produzione di uno specifico enzima

IL SEGUITO DELLA STORIA


Non tutte le proteine sono enzimi (la cheratina e l ormone insulina sono
due esempi di proteine non enzimatiche).
IPOTESI UN GENE-UNA PROTEINA
Non tutte le proteine sono formate da un singolo polipeptide, e dunque
possono essere codificate da due geni diversi, come ad esempio
l emoglobina.
IPOTESI UN GENE-UN POLIPEPTIDE

CHE COSA UN GENE?

In termini molecolari un gene pu essere definito come un segmaento di


DNA che viene espresso per ottenere un prodotto funzionale, corrispondente
o a una molecola di RNA (ad esempio RNA ribosomiale o RNA transfer) o ad
un polipeptide.

LA STRUTTURA DEI GENI EUCARIOTICI

La maggior parte dei geni eucariotici costituita da segmenti di sequenze


codificanti (ESONI) interrotti da sequenze non codificanti (INTRONI). Sia
gli esoni che gli introni vengono trascritti per ottenere un lungo trascritto
precursore. Gli introni sono quindi rimossi attraverso il meccanismo dello
splicing per formare il trascritto maturo.

IL CIRCUITO DELLESPRESSIONE GENICA

Le cellule muscolari e quelle del fegato contengono gli stessi geni; le funzioni di
queste cellule non sono determinate da differenze nei loro genomi, ma da
circuiti di espressione genica che governano lo sviluppo ed il differenziamento.

Trascrizione
Sequenze specifiche di DNA sono copiate (trascritte) in molecole di RNA. La correttezza
della trascrizione garantita dalla complementariet tra le basi del filamento di DNA e quelle
dell RNA che si forma sul suo stampo. L informazione del DNA in tal modo trascritto in
molecole di RNA, con funzioni diverse (hnRNAs, rRNAs, tRNAs, snRNAs)
Maturazione dell hnRNA (RNA nucleare eterogeneo) e formazione di mRNA
Modificazione del trascritto primario (eliminazione degli introni, aggiunta di gruppi chimici alle
estremit della molecola) e trasferimento al citoplasma dell mRNA maturo.
Traduzione
L mRNA trasporta il messaggio dal DNA ai ribosomi, dove il messaggio sar tradotto:
attraverso un codice (codice genetico), la sequenza lineare dei nucleotidi del mRNA
determiner la sequenza lineare di aminoacidi nella catena polipeptidica (struttura primaria
della proteina).

Flusso di informazione attraverso la cellula:


il dogma centrale della biologia

Lenzima principale responsabile


per la sintesi dellRNA
lRNA polimerasi

La RNA polimerasi un enzima complesso formato da diverse catene


polipeptidiche.
Lenzima completo batterico consiste di cinque diverse subunit chiamate a, b, b, w,
s.

Cooper and Hausman, La cellula. Piccin

La sequenza di DNA alla quale si lega lRNA polimerasi per


iniziare la trascrizione di un gene chiamata promotore

Queste sequenze comuni comprendono sei nucleotidi ognuna,


e sono localizzate approssimativamente a 10 e 35 basi a monte
del sito dinizio della trascrizione.
Cooper and Hausman, La cellula. Piccin

La trascrizione da parte dellRNA polimerasi di E. coli

Cooper and Hausman, La cellula. Piccin

La terminazione della trascrizione viene segnalata da una ripetizione invertita ricca bin
GC seguita da sette residui di A, tale da formare una struttura ad ansa e forcina stabile
dellRNA, causando la dissociazione dellRNA dallo stampo di DNA.

Cooper and Hausman, La cellula. Piccin

Il lattosio induce la sintesi degli enzimi coinvolti nel proprio


metabolismo

Jacob and Monod, Nobel Prize 1965

Il lattosio induce la sintesi degli enzimi coinvolti nel proprio


metabolismo

repressore

-galattosidasi

permeasi

transacetilasi

Il lattosio induce la sintesi degli enzimi coinvolti nel proprio


metabolismo

TRASCRIZIONE

5
Filamento di DNA di stampo
5
3

mRNA trascritto
3

Direzione
della trascrizione

Catena di DNA che funge


da stampo
5

Lelica del DNA viene svolta e un filamento


di DNA funge da stampo per la sintesi
dellhnRNA: i nucleosidi trifosfati man
mano si dispongono in sequenza per
complementariet con le basi del DNA.
Lenzima RNA polimerasi taglia due gruppi
fosfato da ciascun nucleoside trifosfato e
unisce il gruppo fosfato rimasto allestremit
3 della catena di mRNA in allungamento
mediante un legame covalente. Cos
lhnRNA si forma in direzione 5 - 3.
La trascrizione termina in corrispondenza di
una specifica sequenza di nucleotidi di
DNA.

Catena di RNA in allungamento


3

TRASCRIZIONE

Un promotore eucariotico

Gli enhancer (intensificatori) sono sequenze capaci di stimolare la trascrizione e possono


svolgere la loro funzione anche a grandi distanze.

Cooper and Hausman, La cellula. Piccin

I promotori dei geni trascritti dalla RNA polimerasi II contengono sequenze TATA
(TATA box) da 25 a 30 nucleotidi a monte del sito di inizio.

Cooper and Hausman, La cellula. Piccin

Laggiunta di un enhancer stimola la trascrizione anche a grande distanza ed


in entrambi gli orientamenti

Cooper and Hausman, La cellula. Piccin

Il legame di proteine regolatrici agli enhancer responsabile del controllo


dellespressione genica durante lo sviluppo ed il differenziamento, come
anche nella risposta cellulare agli ormonie ai fattori di crescita.

Cooper and Hausman, La cellula. Piccin

Cooper and Hausman, La cellula. Piccin

Le RNA polimerasi eucariotiche


Le cellule eucariotiche contengono tre distinte RNA polimerasi nucleari che
trascrivono classi distinte di geni:
RNA polimerasi I specificamente deputata alla trascrizione delle tre specie pi
grandi di RNA ribosomiale (rRNA 28S, 18S e 5.8S).
RNA polimerasi II trascrive i geni che codificano per le proteine (mRNA) ed i
microRNA (miRNA), che sono regolatori critici dellespressione genica nelle
cellule eucariotiche.
RNA polimerasi III trascrive i geni degli RNA di trasporto (tRNA) e gli RNA
ribosomiali 5S.

Cooper and Hausman, La cellula. Piccin

TRASCRIZIONE - Inizio

Il processamento dellmRNA negli eucarioti


Il processamento degli RNA messaggeri rappresenta una delle maggiori differenze tra le
cellule eucariotiche e procariotiche:
Nei batteri infatti I ribosomi hanno immediatamente accesso allmRNA e la traduzione
pu cominciare sulla catena di mRNA nascente mentre la trascrizione sta ancora
procedendo.
Negli eucarioti, lmRNA sintetizzato nel nucleo deve essere processato e trasportato nel
citoplasma prima di poter essere utilizzato come stampo per la sintesi delle proteine.

Il processamento dellmRNA negli eucarioti

Cooper & Hausman 2012

Maturazione del trascritto primario negli eucarioti

I geni eucariotici contengono sequenze (introni) di DNA non codificante, che non si
ritrovano nell mRNA maturo, all interno delle sequenze codificanti (esoni), che
saranno tradotte in sequenze di aminoacidi della proteina

Il processamento alternativo dellmRNA negli eucarioti

SOPRAVVIVENZA

MORTE CELLULARE

Erez et al., 2003

Il processamento
dellRNA di trasporto
Gli RNA di trasporto derivano dai pre-tRNA,
alcuni dei quali contengono diverse
molecole di tRNA. Il taglioallestremit 5 del
tRNA catalizzato dal ribozima Rnasi P, il
taglio allestremit 3, invece catalizzato
da una Rnasi proteica convenzionale

Cooper & Hausman 2012

Struttura del tRNA

Gli RNA di trasporto sono lunghi approssimativamente 70-80


nucleotidi ed hanno una caratteristica struttura a quadrifoglio
risultante dallappaiamento di basi complementari fra diverse regioni
della molecola
Cooper & Hausman 2012

tRNA di trasporto
Ansa 3

Estremit 3

Estremit
accettrice
di aminoacidi

Estremit 5
3
Ansa 3

Ansa 1

Ansa 1

Nucleotidi
modificati
Ansa 2
Ansa 2

Anticodone

Aggancio degli aminoacidi ai tRNA

Cooper & Hausman 2012

rRNA e RIBOSOMI
I ribosomi sono i siti della sintesi proteica.
Sono composti di proteine ed RNA ribosomiale (rRNA) e costituiti da due
subunit, una maggiore e una minore

I ribosomi si assemblano all interno del


nucleo, nell area identificata dal
nucleolo, dove gli rRNAs sintetizzati si
associano alle proteine ribosomiali per
formare Ie subunit 60S e 40S

Il processamento dellRNA ribosomiale

Cooper & Hausman 2012

Ribosomi
Organelli ribonucleoproteici

Dimensioni

Eucarioti = 80 S (60S + 40S)


Procarioti = 70 S (50S + 30S)
S = Svedberg, unit di misura della velocit di
sedimentazione

Struttura dei ribosomi

Cooper & Hausman 2012

mRNA procariotici ed eucariotici

Cooper & Hausman 2012

La sintesi delle proteine lo stadio finale dellespressione genica.


Tuttavia, la traduzione dellmRNA solo il primo passo nella
formazione di una proteina funzionante. La catena polipeptidica
deve poi ripiegarsi nella conformazione tridimensionale appropriata
e, spesso, subisce vari passaggi di maturazione prima di essere
convertita nella sua forma attiva.
Questi passaggi di maturazione, specialmente negli eucarioti, sono
strettamente connessi allo smistamento e al trasporto di diverse
proteine nelle loro destinazioni finali della cellula.

IL CODICE GENETICO
4 basi, combinate 3 a 3, formano 4x4x4 = 43 =
64 combinazioni, dette Triplette o Codoni.
Di questi 64 codoni:
3 sono segnali d arresto,
61 codificano per uno dei 20 aminoacidi esistenti.
Alcuni codoni sono sinonimi, cio codificano per lo
stesso aminoacido.
Il codice universale (vale per tutti i viventi).

La tripletta UUU codifica per la fenilalanina:


La traduzione in vitro di un RNA sintetico che consiste di uracili
ripetuti (uno stampo di poli-U) porta alla sintesi di un polipeptide
contenente solo fenilalanina.

IL CODICE GENETICO
Prima
lettera

AU
GC
TA

Seconda lettera

AU
AAA UUU
AAG UUC
AAT UUA
AAC UUG
GAA CUU
GAG CUC
GAT CUA
GAC CUG

GC
P
H
E
L
E
U

AGA UCU
AGG UCC
AGT UCA
AGC UCG

TA

S
E
R

...
...
ATT UAA Stop ATT UAA Stop
ATC UAG Stop

L
E
U

CG
DNA

RNA

CG

Aminoacidi

Terza
lettera
A
G
T
C
A
G
T
C
A
G
T
C
A
G
T
C

U
C
A
G
U
C
A
G
U
C
A
G
U
C
A
G

Il codice genetico: universale, degenerato, non


ambiguo

Il riconoscimento tra il tRNA e lo specifico


aminoacido richiede l intervento di enzimi specifici,
le aminoacil-tRNA sintetasi

TRADUZIONE
La traduzione cos0tuita da tre stadi:

Inizio
Allungamento
Terminazione

Segnali di inizio della traduzione

Cooper & Hausman 2012

Cooper & Hausman 2012

Struttura della subunit ribosomiale 50S

Cooper & Hausman 2012

Allungamento
phe

Legame
peptidico
5

fMet

val

val

phe

INIZIO DELLA TRADUZIONE

Inizio

La subunit ribosomiale minore si attacca all estremit 5 della


molecola di mRNA. La prima molecola di tRNA, che trasporta
l aminoacido modificato fMet, si inserisce nel codone d inizio AUG
sulla molecola di mRNA. La subunit ribosomiale maggiore si incastra
con il tRNA in posizione P (peptide). Il sito A (aminoacile) vuoto.

fMet

mRNA

3
5
Subunit
minore

fMet

5
3

5
Ribosoma
completo

Allungamento
phe

Legame
peptidico
5

fMet

val

val

phe

Terminazione
Fattore
trp di rilascio

Quando un ribosoma incontra un codone di terminazione, in questo caso


UGA, il polipeptide si stacca dallultimo tRNA e il tRNA si libera dal sito P. Il
sito A occupato da un fattore di rilascio, che stimola la dissociazione
delle due subunit del ribosoma.

Aminoacidi

Aminoacil
tRNA-sintetasi

Membrana
cellulare

3 5

tRNA

tRNA con
aminoacido
attaccato

DNA
Catena
polipeptidica
in crescita

3
3

5
Rib

Ribosoma

Secondo ribosoma
inserito

osoma

Primo
ribosoma
inserito

mRNA

FASE DI ALLUNGAMENTO DELLA TRADUZIONE


Il ribosoma ha tre siti di attacco per il tRNA:
1. Sito peptidilico (P)
2. Sito aminoacilico (A)
3. Sito di uscita (E)
Il ribosoma si muove di tre nucleotidi lungo
lmRNA; questo movimento trasloca il
peptidil-tRNA al sito P ed il tRNA scarico al sito
E, lasciando il sito A vuoto pronto per
ricevere laminoacido successivo.

TERMINAZIONE DELLA TRADUZIONE


Un codone di terminazione (ad esempio
UAA) nel sito A riconosciuto da un fattore di
rilascio piuttosto che da un tRNA. Il risultato
il rilascio della catena polipeptidica
completata, seguito dalla dissociazione di
tRNA e mRNAdal ribosoma.

TRADUZIONE

L mRNA per le proteine che devono essere sintetizzate nel RER contiene
una sequenza peptidica segnale che blocca l attivit del ribosoma sino a
che questo non si unisce a recettori specifici del RER