Approfondimento radicali liberi

L’ossigeno è una molecola indispensabile per il metabolismo degli organismi aerobi,

ma allo stesso tempo il suo utilizzo porta alla formazione di specie reattive
potenzialmente tossiche, responsabili di danni a molte macromolecole biologiche e
in ultima analisi all’istaurarsi di diverse patologie nell’uomo e negli animali.
Queste specie, denominate ROS, sono il risultato delle successive riduzioni
monoelettroniche dell’ossigeno ad H2O: la riduzione di O2 con un solo elettrone
porta alla formazione di superossido (O2·-), l’aggiunta di un altro elettrone alla
formazione di perossido di idrogeno (H2O2), quella di un terzo elettrone ad un
radicale idrossilico (OH·). Possiamo distinguere i ROS in due categorie:
1. Le specie radicaliche (ad es. O2·- e OH·) che contengono uno o più elettroni spaiati
2. Le specie non radicaliche (da es. H2O2)
Normalmente all'interno delle cellule viene prodotta costantemente una certa
quantità di ROS che possono anche essere modulatori di reazioni biochimiche
fondamentali per la cellula, il problema nasce quando i sistemi cellulari di
detossificazione dei ROS non riescono a mantenere sotto controllo i livelli di queste
molecole altamente reattive.
I radicali liberi si formano nelle cellule sia in seguito alle loro reazioni metaboliche
sia in seguito a stimoli esterni (radiazioni ionizzanti, elevata tensione di ossigeno,
sostanze chimiche, farmaci, fumo, stress di vario genere).
La maggior parte delle patologie e l'invecchiamento degli esseri viventi sono causati
da processi chimici ossidativi, dovuti ad una eccessiva produzione di radicali liberi. La
presenza dei radicali liberi in organismi viventi ha normalmente conseguenze
negative, come il danneggiamento diretto o indiretto del DNA cellulare e la
modificazione strutturale delle proteine.
In condizioni normali il potenziale tossico dei radicali liberi è neutralizzato da un
complesso sistema di fattori antiossidanti che rappresenta il meccanismo fisiologico
di difesa: il rapporto tra fattori ossidanti e difese antiossidanti rappresenta il
cosiddetto "bilancio ossidativo". Lo stress ossidativo è, pertanto, l'espressione
biologica di un danno che si verifica quando i fattori pro-ossidanti (farmaci, sostanze
tossiche, radiazioni, stati infiammatori, attività fisica esacerbata, etc.) superano le
difese antiossidanti endogene (enzimi come la SOD, il coenzima Q10, la catalasi, la
perossidasi, etc.) ed esogene (antiossidanti presenti negli alimenti). Si può incorrere
in stress ossidativo sia in condizioni normali di salute sia negli stati patologici.
Lo stress ossidativo è una conseguenza di livelli particolarmente alti di ROS che
vengono generati in diversi distretti cellulari sia in condizioni fisiologiche, sia in
risposta a vari stimoli.
Origine mitocondriale
La catena di trasporto degli elettroni mitocondriale è la sorgente principale di ATP
nella cellula ed è, infatti, essenziale per la vita degli organismi eucariotici. Tuttavia,
durante questo processo metabolico, l’1-2% degli elettroni sfuggono dai complessi
proteici ed interagendo con l’O2 generano O2·-
Anche l’H2O2 può essere generata nei mitocondri e gioca un ruolo importante in
molti eventi cellulari, come ad esempio la biosintesi dell’ormone tiroideo, l’attività
microbicida dei macrofagi, ma può provocare dei danni quando reagisce con i
metalli di transizione a formare l’OH, che al contrario è molto reattivo e capace di
danneggiare irreversibilmente le macromolecole cellulari.
Altra fonte dei ROS è la NADPH ossidasi, localizzata principalmente sul plasmalemma
delle cellule fagocitiche. L’assemblaggio e l’attivazione di questo enzima, in risposta
a stimoli infiammatori, porta, infatti, alla produzione diO2.-.
La produzione di ROS può avvenire anche a livello recettoriale, ad esempio durante
la cascata di segnalazione innescata dal fattore di necrosi tumorale (TNFα):
quest’ultimo associandosi al suo recettore (TNFR1 e TNFR2) porta all’induzione
dell’apoptosi, attraverso l’incremento dei ROS. Il recettore FAS è un altro membro
della superfamiglia dei TNFR la cui attivazione, mediata dall’attacco di un ligando
specifico, induce l’apoptosi tramite l’attivazione di proteasi a cisteina. Anche in
questo caso l’apoptosi è associata ad una aumentata produzione di ROS che sembra
essere dovuta all’attivazione della NADPH ossidasi.
I ROS possono originarsi anche a livello del citocromo P450 nel reticolo
endoplasmatico o per azione della lipossigenasi, delle ciclossigenasi e della xantina
ossidasi nel citoplasma. Fonti minori sono poi alcune molecole endogene ed
esogene che producono radicali nel corso di alcune reazioni enzimatiche come, ad
esempio, nel metabolismo dell’acido arachidonico.
Oltre ai processi coinvolti nella produzione di radicali liberi fin ora citati, va ricordato
che, anche molecole esogene come xenobiotici e farmaci, sono potenziali fonti di
ROS. In particolare ricordiamo: molecole a struttura chinonica, cationi bipiridilici,
composti aromatici, antibiotici antraciclinici (adriamicina e daunomicina) e
nitroimidazoli (nitrofurantoin).
Tossicità dei ROS
Come già accennato i ROS, quando presenti ad elevate concentrazioni, per la loro
elevata instabilità chimica, sono in grado di interagire e danneggiare numerose
macromolecole (lipidi, proteine e acidi nucleici) presenti nei vari distretti cellulari.
In particolare, la reazione chimica dovuta ai radicali dell’O2 che avviene sulle
membrane cellulari è la perossidazione dei fosfolipidi. Il gruppo perossidico,
formatosi per ossidazione degli acidi grassi, è molto più idrofilico di quello originario
e tende a portarsi nella regione superficiale del doppio strato lipidico, ripiegando ad
U la catena acilica dell'acido grasso. La conseguenza principale di questa nuova
configurazione è l’aumento dell'ingombro sterico del fosfolipide con conseguente
alterazione strutturale e funzionale della membrana. I lipidi sono importanti per la
loro presenza nelle membrane che circondano ogni cellula. L’azione ossidativa a
carico dei lipidi procede con un meccanismo radicalico a catena definito
lipoperossidazione. I principali bersagli di questo fenomeno sono gli acidi grassi
poliinsaturi, che sono presenti in elevate concentrazioni nei fosfolipidi delle
membrane cellulari. La perossidazione lipidica si sviluppa attraverso tre fasi
consequenziali: iniziazione, propagazione e terminazione:
Il primo evento nell’inizio della perossidazione lipidica è l’estrazione di un idrogeno
da un gruppo metilenico bis-allilico di un acido grasso polinsaturo da parte di un
radicale ossidrile. Il radicale lipidico (L•) si riarrangia immediatamente a diene
coniugato che reagisce con l’ossigeno molecolare formando perossilradicali in
posizione +2 e -2 rispetto al carbonio da cui è stato estratto inizialmente l’idrogeno.
Questo prodotto (LOO•) è altamente reattivo e può ciclizzare e formare un
lipoperossido ciclico, da substrati quali l’acido arachidonico ed eicosapentaenoico. Il
prodotto ciclico così ottenuto può successivamente frammentarsi e dar luogo a
catene alifatiche, contenenti due gruppi carbonilici, formando composti come la
malondialdeide (MDA), una dialdeide altamente reattiva, e il 4-idrossinonenale
(HNE). Queste possono reagire con gruppi amminici liberi di proteine, fosfolipidi o
acidi nucleici formando legami covalenti stabili, tipo basi di Schiff, che inducono
alterazioni strutturali di tali molecole biologiche. I legami crociati proteina–MDA–
fosfolipide, proteina–MDA–proteina o fosfolipide–MDA–fosfolipide causano infatti
diminuzione del grado di libertà e della possibilità di movimento delle molecole
stesse, con perdita di fluidità della membrana come effetto ultimo. Una volta
terminato tutto l’ossigeno a disposizione o quando intervengono sostanze
antiossidanti che possono donare un atomo di idrogeno o un elettrone, ha luogo la
fase di terminazione, dove i radicali formatisi reagiscono per dare prodotti finali non
radicalici inattivi.
Per quanto riguarda le proteine, invece, le ossidazioni indotte dai ROS hanno come
conseguenza l’induzione della proteolisi. Vari esperimenti sono stati condotti per
dimostrare che i ROS sono in grado di alterare le caratteristiche chimico-fisiche di
una proteina: diminuzione della fluorescenza nativa, e alterazione del peso
molecolare. Anche le proteine sono un bersaglio per i radicali liberi, i cui danni
possono essere distinti in reversibili ed irreversibili; tra i primi vi è l’ossidazione dei
gruppi tiolici della metionina a solfossido, mentre tra gli irreversibili, la rottura
dell’anello dell’istidina e del triptofano e l’idrolisi del legame peptidico in presenza di
prolina. Quest’ultimo evento danneggia particolarmente il collagene, ricco di prolina
ed idrossiprolina. I gruppi SH- dei residui di cisteina delle proteine sono fra i più
esposti alle collisioni radicaliche: i radicali tiile (RS•) che si formano possono
dimerizzare o ossidarsi a RSO2, provocando danni alla struttura e alla funzionalità
delle proteine stesse. In particolare possono venire attaccate proteine con funzione
enzimatica, come la fosfofruttochinasi ed appartenenti alla catena respiratoria
mitocondriale, di importanza fondamentale per la produzione di energia per la
cellula. L’ossidazione delle proteine sembra essere inoltre responsabile, almeno in
parte, di patologie quali l’aterosclerosi, il danno da ischemia-riperfusione e
l’invecchiamento.
Nell’ambito dei danni cellulari causati dalle specie reattive dell’ossigeno, quello al
DNA è potenzialmente il più pericoloso poiché tali alterazioni sono spesso associate
a mutazioni genetiche ed allo sviluppo di cancro. È emerso inoltre un legame sempre
più evidente tra alterazioni al DNA ROS-mediate ed il processo di invecchiamento, la
patogenesi del diabete mellito e di alcune malattie a carico del fegato e ad eziologia
infiammatoria. Esempi di danni agli acidi nucleici sono, tra gli altri, la formazione di
legami intermolecolari DNA-DNA o DNA-proteine e modificazioni ossidative a carico
delle basi azotate. Le più sensibili sono le basi pirimidiniche citosina e timina le quali
possono andare incontro a saturazione o apertura dell’anello con idrossilazione di
quest’ultimo. Ciò implica la perdita dell’aromaticità e della planarità, determinando
distorsioni nella geometria del DNA. Inoltre l’ossidazione della timina può portare
alla formazione dei cosiddetti “dimeri di timina”. Una delle più frequenti alterazioni
ossidative delle basi puriniche riguarda invece l’ossidrilazione in posizione 8 della
guanosina e il distacco delle basi azotate dagli zuccheri. Se le basi danneggiate
vengono rimosse e riparate prima della divisione cellulare, non ci sarà alcun danno
permanente. Se invece il sistema di riparazione è soggetto ad errori, la generazione
successiva riceverà una molecola di DNA difettosa in cui una base azotata è
eliminata o sostituita da una base impropria.
Ruolo fisiologico dei ROS
Con l’eccezione delle cellule fagocitarie, nelle quali il ruolo dei ROS è indispensabile
nelle reazioni di difesa, classicamente i ROS vengono considerati molecole in grado
di scatenare processi di morte cellulare. Tuttavia, negli ultimi anni, è emerso che i
ROS, quando prodotti a basse concentrazioni, possono fungere da mediatori o da
secondi messaggeri. Nella cellula la trasduzione del segnale mediata dai ROS può
seguire sostanzialmente due vie: 1) la fosforilazione delle proteine; 2) il
cambiamento dello stato redox di specifiche cisteine. Quindi i ROS possono
comunicare, se non addirittura far parte, di percorsi di trasduzione del segnale
conosciuti e ben definiti. Tutto ciò potrebbe suggerire un ruolo di effettori diretti per
i ROS, per cui le interazioni con proteine bersaglio redox-sensibili si traducono in
alterazioni della struttura e della funzione. Un esempio è rappresentato dal fattore
tumorale p53 capace di indurre apoptosi in seguito a stress cellulare. È stato
dimostrato che p53 è un fattore trascrizionale la cui attività è regolata dall’ambiente
ossido-riduttivo intracellulare mediante modificazione dello stato redox di specifiche
cisteine.
Le difese antiossidanti: sistemi di difesa enzimatici e non enzimatici
Gli organismi hanno evoluto un sistema di difesa antiossidante costituito sia da
componenti enzimatiche sia da molecole non enzimatiche. Gli antiossidanti sono
elementi indispensabili per la protezione delle molecole e dei sistemi biologici
dall’insulto derivante dalle specie reattive dell’ossigeno (ROS). Sono infatti in grado
di inibire o ritardare l’ossidazione del substrato, fornendo ai radicali gli elettroni di
cui sono privi.
La difesa antiossidante enzimatica è composta da proteine in grado di rimuovere
con un’elevata efficienza catalitica i ROS: la superossido dismutasi (SOD), la catalasi
(CAT) e la glutatione perossidasi (GPx). Gli antiossidanti “non enzimatici”
comprendono varie molecole a basso peso molecolare ("scavenger") come
ascorbato, vitamina E, carotenoidi, glutatione ridotto (GSH) e metallotioneina (MT).
La superossido dismutasi è l’enzima che catalizza la reazione di dismutazione del
radicale superossido, molto tossico, ad ossigeno molecolare e perossido di idrogeno.
Come tale costituisce un fondamentale meccanismo di difesa contro lo stress
ossidativo per le cellule. Le superossido dismutasi sono una famiglia di
matalloproteine classificate in base al cofattore metallico in Cu/Zn-SOD (isoforma
citosolica), Mn-SOD (isoforma mitocondriale) e Fe-SOD (isoforma extracellulare). Le
SOD sono enzimi dimerici o tetramerici costituiti da sub unità identiche, presenti nel
citoplasma delle cellule eucariotiche e nel periplasma di quelle batteriche.
La Cu/Zn SOD: è una metallo-proteina che si trova in tutte le cellule eucariotiche ed
in alcuni procarioti. La Cu/Zn SOD riceve il rame dalla rame-chaperonina chiamata
CCS (Copper Chaperon for Superoxide) che è indispensabile per l’incorporazione del
metallo nel sito catalitico della proteina. La Cu/Zn SOD è costituita da due sub unità
identiche di 16.5 kDa, tenute insieme da interazioni idrofobiche. Il sito attivo di
ciascun monomero è formato anch’esso da anse non elicoidali e comprende un
atomo di Cu2+ e uno di Zn2+, legati a ponte dall'anello imidazolico di un'istidina. Lo
ione rame risulta essere esposto al solvente ed è situato in fondo al canale del sito
attivo, mentre lo zinco è completamente circondato dalla proteina. Nel dimero i due
siti attivi risultano trovarsi in zone opposte della molecola e sembra che essi
agiscano indipendentemente l’uno dall’altro. Mentre lo ione Zn2+ sembra avere
unicamente un ruolo strutturale, lo ione Cu2+ partecipa direttamente alla reazione
di dismutazione:
1. E-Cu2+ + O2•‾ E-Cu+ + O2
2. E-Cu+ + O2•‾ + 2H+ E-Cu2+ + H2O2
Questo meccanismo consiste di due stadi: nel primo il Cu2+ viene ridotto a Cu+ con
conseguente rottura del ponte istidinico fra Cu2+ e Zn2+ ed ossidazione di un
radicale superossido ad ossigeno. Nel secondo stadio il Cu+ cede un elettrone ad un
altro radicale superossido, per produrre, insieme a due protoni, una molecola di
H2O2. La reazione della Cu/Zn SOD con O2•‾ è molto rapida ed ha un’energia di
attivazione molto bassa. Inoltre, la formazione di H2O2 nel corso della catalisi,
collega la funzione antiossidante della Cu/Zn SOD all’attività di altri enzimi
antiossidanti quali la catalasi e la GPx.
Nella reazione catalizzata con estrema efficienza da questa famiglia di enzimi due
molecole di anione superossido producono una molecola di perossido di idrogeno e
ossigeno molecolare:
2O2• - + 2H+ → H2O2 + O2
Il prodotto finale della dismutazione dello ione superossido è l’H2O2. L’ H2O2 è una
delle molecole più abbondanti fra i ROS, implicata sia nella morte per apoptosi
caspasi-indipendente, sia in quella per necrosi. I sistemi primari di difesa contro la
tossicità dell’H2O2 sono quello della catalasi e della GPx che utilizza il ciclo redox del
glutatione. Questa è il substrato degli altri due sistemi enzimatici presi in esame: la
catalasi e la glutatione perossidasi.
La catalasi (ossidoreduttasi del perossido d’idrogeno) è un enzima costituito da
quattro sub unità proteiche, ognuna contenente ferro eme e una molecola di
NADPH. È preferenzialmente localizzata nei perossisomi, organuli che contengono
anche molti enzimi che generano con la loro attività H2O2, dove provvede alla
dismutazione dello stesso in una molecola d’acqua e ossigeno molecolare:
Catalasi-Fe(III) + 2H2O2→ Catalasi-Fe(II) + 2H2O + O2
L’enzima presiede anche alla detossificazione di altri substrati tra cui fenoli ed alcoli
attraverso una riduzione accoppiata del perossido di idrogeno:
H2O2 +R’H2 → R’ + 2H2O
La glutatione perossidasi è un enzima presente in due forme, una selenio
indipendente (glutatione –S- transferasi, GST) e una selenio dipendente (GPX)
[rip17]. Questi due enzimi differiscono per il numero di sub unità, per la natura del
selenio nel sito attivo e per il meccanismo catalitico. La glutatione perossidasi
selenio dipendente è implicata nella riduzione del perossido di idrogeno e degli
idroperossidi organici. La glutatione perossidasi selenio indipendente è, invece,
coinvolta nella riduzione di fosfolipidi idroperossidi, oltre a quella dei composti
precedentemente indicati [20]. La reazione catalizzata presenta specificità solo per il
donatore di elettroni (il GSH) mentre l’idroperossido può essere rappresentato sia
dal perossido di idrogeno sia da idroperossidi derivati dagli acidi grassi e dagli
steroidi:
ROOH + 2GSH → ROH + GSSG + H2O
e fa delle glutatione perossidasi tra gli enzimi più versatili esistenti nella cellula.
L’attività della glutatione perossidasi dipende dalla disponibilità intracellulare di
glutatione ridotto, che è a sua volta il prodotto dell’attività dell’enzima glutatione
reduttasi, il quale sfrutta il potere riducente associato allo NADPH prodotto nelle vie
metaboliche di degradazione degli zuccheri
GSSG + NADPH + H+ → 2GSSG + NADP+
I principali sistemi antiossidanti non enzimatici possono essere catalogati in due
classi principali:
1. Composti tiolici, come il glutatione (GSH) e la tioredossina (Trx), in grado di agire,
direttamente o mediante la catalisi di specifici enzimi, donando equivalenti riducenti
e formando disolfuri.
2. Molecole che possiedono strutture intrinsecamente capaci di delocalizzare la
carica positiva che si viene a formare in seguito alla reazione con il radicale, come i
tocoferoli, l’acido citrico, il β-carotene e i polifenoli.
La vitamina C (acido ascorbico) agisce da antiossidante, esercitando un’azione
protettiva nei confronti del radicale superossido, dell’idrossi radicale, dell’ossigeno
singoletto e del perossi radicale.
La vitamina E è costituita da un complesso di tocoferoli e tocotrienoli (α-, β-, γ- e δ-
tocoferolo e α-, β-, γ- e δ-tocotrienolo). In natura la forma più abbondante e di
maggiore attività è chiamata α-tocoferolo. Si tratta di un potente antiossidante
biologico legato alla membrana cellulare la cui principale funzione è quella di
protezione nei confronti del processo di perossidazione lipidica. È stato evidenziato
che esiste un’attività sinergica tra la vitamina C e la vitamina E che sembrano
minimizzare le conseguenze della perossidazione lipidica nelle lipoproteine delle
membrane cellulari.
Il glutatione (GSH) risulta presente abbondantemente nel citosol, nel nucleo e nei
mitocondri.
Il glutatione è considerato il principale sistema tampone ossidoriduttivo cellulare
appartenente alla famiglia dei tioli. Mediamente la sua concentrazione citosolica è
dell’ordine di 1-10 mM ed è di gran lunga più elevata rispetto a molti altri composti
redox attivi. Il glutatione partecipa direttamente alla neutralizzazione dei radicali
liberi, che si formano dalla perossidazione dei lipidi e mantiene gli altri antiossidanti
a basso peso molecolare, come la vitamina C ed E, nella loro forma ridotta, cioè
attiva, inoltre, attraverso il processo di coniugazione diretta, detossifica molti
xenobiotici. A livello cellulare il glutatione è sintetizzato a partire dal glutammato,
dalla glicina e dalla cisteina. Quest’ultima è il donatore del gruppo tiolico (-SH),
responsabile della sua attività biologica.
All’interno delle cellule il glutatione si può presentare: a) sotto forma ridotta (GSH);
b) sotto forma ossidata (GSSG), in cui due molecole di glutatione sono unite tra loro
da un ponte disolfuro; c) come disolfuro misto con proteine (GS-S-Prot o GS-SP o GS-
R), in cui il legame si instaura tra l’atomo di zolfo del tripeptide ed un residuo di
cisteina della proteina. La reazione di ossidazione che porta alla formazione del
GSSG è mediata dalla glutatione perossidasi (GPx) e da alcune transidrogenasi. La
riduzione del GSSG a GSH è invece catalizzata dall’enzima glutatione reduttasi
(GSSG-Red): è un enzima NAD(P)H e flavina adenina dinucleotide (FAD)-dipendente
che trasferisce elettroni dall’NADPH al glutatione ossidato, attraverso il FAD. Per le
caratteristiche chimico-fisiche e per l’elevata concentrazione, generalmente lo stato
redox di un sistema cellulare si calcola prendendo in esame il rapporto
[GSH]/[GSSG].
L’effetto protettivo del glutatione nei confronti dello stress ossidativo è dovuto al
fatto che:
Rappresenta un cofattore di diversi enzimi antiossidanti quali la glutatione
perossidasi e la glutatione transferasi;
Partecipa al trasporto di amminoacidi attraverso la membrana plasmatica;
È in grado di eliminare direttamente il radicale idrossilico e l’ossigeno singoletto;
Risulta capace di rigenerare importanti sistemi antiossidanti quali vitamina C e
vitamina E;
può ridurre il radicale tocoferolo a vitamina E direttamente o indirettamente
attraverso la riduzione del radicale semideidroascorbato ad ascorbato.
Quello rappresentato dalla tioredossina è un altro sistema redox tiolico
fondamentale nella riduzione dei ponti disolfuro tra le cisteine coinvolte nel legame
al DNA di numerosi fattori di trascrizione, ed è inoltre importante nell’espressione
genica. Le concentrazioni intracellulari della tioredossina nei mammiferi variano
approssimativamente da 1 a 10 μM e sono quindi da 100 a 1000 volte inferiori a
quelle del GSH. La tioredossina è una proteina, a basso peso molecolare (~11kDa),
che normalmente forma ponti disolfuro intra-molecolari. La riduzione della forma
ossidata (disolfuro) a quella ridotta è catalizzata dall’enzima tioredossina reduttasi
(TrxR), mentre il donatore di elettroni è l’NADPH.
Stress ossidativo e nitrosativo
Il sistema nervoso centrale è caratterizzato da un continuo flusso di ROS generato
durante le reazioni neurochimiche, inoltre, è altamente aerobico, contiene un alto
livello di substrati facilmente ossidabili (lipidi polinsaturi delle membrane cellulari)
Oltre a ciò, il sistema nervoso possiede bassi livelli di difese antiossidanti, come la
catalasi, pertanto la sopravvivenza delle cellule nervose è associata ad un delicato
equilibrio fra produzione di specie ossidanti e difesa antiossidante. Lo stress
ossidativo sopraggiunge quando questo delicato equilibrio viene alterato
dall’attivazione impropria di alcuni processi metabolici o dalla diminuzione della
difesa antiossidante e ciò può portare a neuro degenerazione che caratterizza
diverse malattie come l’AIDS, la malattia di Huntington, la malattia di Parkinson,
l’Alzheimer e la sclerosi laterale amiotrofica (SLA).
Inoltre, oltre ai ROS, il sistema nervoso centrale è a rischio ossidativo da parte
dell’ossido nitrico (NO) prodotto dall’ossido nitrico sintasi (NOS). L’NO svolge nel
sistema nervoso il ruolo di neurotrasmettitore, ma a causa della sua natura
radicalica può dare origine a specie altamente ossidanti: le specie reattive
dell’ossido nitrico (RNS). La reazione del radicale ossido nitrico (NO) con il O2-
porta alla formazione di perossinitrito (ONOO-) con una velocità di reazione che
supera la costante di dismutazione del superossido da parte della Cu/Zn SOD. Gli
RNS, allo stesso modo dei ROS, possono reagire con varie specie molecolari: il DNA, i
tioli, gli amminoacidi ed i metalli, portando per esempio alla perdita delle funzioni
enzimatiche, all’alterazione dell’integrità di membrana e alle mutazioni del DNA.
L’Ossido Nitrico è una molecola ad elevata reattività che pur essendo
potenzialmente tossica è implicata in una vasta gamma di processi fisiologici: come
la neurotrasmissione, la regolazione del sistema immunitario, la regolazione del
sistema cardio-vascolare, il rilassamento della muscolatura involontaria,
l’aggregazione piastrinica. Questi processi condividono le seguenti reazioni
biochimiche: 1) la formazione di un complesso ferro-NO nell’eme di una proteina
bersaglio allo scopo di promuovere la sua funzione; 2) la sintesi enzimatica dell’NO
da parte delle NOS. Le ossido nitrico sintasi (NOS) appartengono alla famiglia di
enzimi NADPH-dipendenti e catalizzano la sintesi dell'NO a partire da arginina e O2.
Sono state identificate tre isoforme della NOS che sono prodotte a partire da tre
geni distinti e che hanno diverse localizzazioni, regolazioni, proprietà catalitiche,
sensibilità agli inibitori. Esse presentano il 51-57 % di omologia tra le forme umane e
sono comunemente chiamate: 1) nNOS, nota anche come NOS-1, poiché identificata
per prima e situata nei tessuti neuronali; 2) iNOS, conosciuta anche come NOS-2,
essendo l’isoforma inducibile in una vasta gamma di tessuti e di cellule; 3) eNOS,
chiamata anche NOS-3, poiché è stata identificata per la prima volta nel sistema
vascolare. Queste isoforme sono state anche distinte in passato, sulla base della loro
espressione costitutiva (cNOS) o inducibile (iNOS) e della loro calcio-dipendenza
(eNOS e nNOS) o calcio-indipendenza (iNOS). Inoltre, per ciascuna isoforma, e
specialmente per l’nNOS, sono state recentemente identificate anche delle varianti
di splicing.
Tutte le isoforme della NOS hanno una struttura costituita da due domini: uno
ossigenasico contenente eme ed uno reduttasico. Per la sua attività sono richiesti
numerosi cofattori: il flusso di elettroni parte dall’NADPH e passa attraverso il FAD,
l’FMN per poi ridurre il ferro contenuto nel gruppo eme. La tetraidrobiopterina
(BH4) è un altro co-fattore utile alla reazione enzimatica si lega al dominio
ossigenasico, e favorisce la formazione della tasca del sito attivo che contiene l’eme.
La biosintesi dell’NO operata dalla NOS si articola in due passaggi successivi: il primo
consiste nell’ossidazione dell’L-arginina a L-N--idrossi-L-arginina (NHA), che utilizza
un equivalente di NADPH e di O2; nel secondo passaggio l’NHA viene convertita in
NO e L-citrullina utilizzando 0.5 equivalenti di NADPH ed una molecola di O2.
Il prodotto dell’attività delle NOS, NO, ha un ruolo importante, anche, nei processi di
morte cellulare in dipendenza della sua concentrazione. Questa sua capacità di
modulare processi che regolano la vitalità cellulare deriva dalla sua forma chimica
complessa. Infatti, l’NO può esistere in varie forme redox: l’ossido nitrico (NO·), il
nitroso (NO+), l’anione nitrossido (NO-). L’NO ha la capacità di diffondere
velocemente attraverso i mezzi acquosi e attraverso le membrane cellulari. La
chimica del nitroso è caratterizzata da reazioni di addizione o sostituzione con
molecole nucleofile. La nitrosazione nella fase acquosa può interessare i centri delle
molecole organiche contenenti –S, -N, -O e –C.
Ruolo dell’NO nell’omeostasi
Sistema immunitario
L’NO è parte integrante della risposta infiammatoria contro agenti patogeni, virus e
cellule tumorali. Nel sistema immunitario, l’NO è prodotto in vari tipi cellulari dalla
iNOS, la quale è attivata da una serie di citochine infiammatorie come TNF-α o i
lipopolisaccaridi (LPS), attraverso una regolazione di tipo trascrizionale. Nel sistema
immunitario il gene della iNOS presenta un promotore che contiene siti di legame
per il fattore di trascrizione NF-κB, il quale è in grado di avviare la trascrizione della
iNOS per azione dei macrofagi. La cascata del segnale che porta alla sintesi della
iNOS può avvenire anche in cellule non macrofagiche (cellule muscolari, cellule
epatiche, astroglia) ed è cellula-specifica. La iNOS una volta espressa, diventa
costitutivamente attiva e i suoi livelli vengono abbassati per mezzo dei sistemi
proteolitici intracellulari.
Sistema cardio-vascolare
L’NO prodotto dalla eNOS è il più importante vasodilatatore endogeno. Il
meccanismo attraverso cui si esplica la sua azione è l’attivazione della guanilato
ciclasi solubile e il conseguente accumulo della guanosina 3’5’ monofosfato (GMPc).
La eNOS può essere regolata da fattori chimici e meccanici che ne modulano sia
l’espressione, sia l’attività, sia la localizzazione cellulare. In condizioni fisiologiche, la
eNOS è regolata dalla concentrazione di Ca2+ intracellulare ed è attivata da
acetilcolina e bradichinina.
L’NO che diffonde dalle cellule endoteliali, stimolate in modo opportuno, induce il
rilassamento della muscolatura del vaso sanguigno, attraverso l’attivazione della
guanilato ciclasi: una proteina eterodimerica formata da una sub unità α e una β,
ciascuna con un gruppo eme che è in grado di legarsi all’NO formando un complesso
Fe-NO. La formazione di tale complesso induce un cambiamento conformazionale
dell’enzima tale da attivarlo e portare all’accumulo di GMPc, un noto secondo
messaggero in grado di stimolare le protein-chinasi (PKG) ed i canali ionici GMPc-
dipendenti, coinvolti nel rilassamento muscolare.
Sistema nervoso centrale
L’NO riveste un ruolo importante nel sistema nervoso centrale e la prima evidenza
che ha portato a includere l’NO come secondo messaggero, deriva dall’osservazione
che il glutammato, agendo attraverso i recettori NMDA, stimola la conversione
dell’arginina a citrullina e NO: la nNOS interagisce con il recettore del glutammato
(NMDA) attraverso la proteina PSD-95 , attivandolo e favorendo, quindi, l’entrata di
Ca2+ nel citosol, questo porta ad un aumento della produzione di NO da parte della
nNOS, che è un enzima Ca2+-dipendente. L’NO prodotto è in grado di raggiungere i
suoi target: guanilato ciclasi, lo stesso NMDA che viene attivato grazie alla S-
nitrosilazione di cisteine reattive.
L’NO, nel sistema nervoso centrale, oltre a fungere da neuromodulatore, ha anche
funzione di neurotrasmettitore. La trasmissione nitrergica media il rilassamento
della muscolatura liscia del sistema respiratorio, gastrointestinale e del tratto
urogenitale.
Quando il potenziale d’azione raggiunge le terminazioni nervose, l’entrata di Ca2+
attraverso i canali voltaggio-dipendenti porta all’attivazione dell’nNOS. Il
conseguente NO prodotto non viene immagazzinato nelle vescicole sinaptiche per
poi essere rilasciato nello spazio sinaptico, ma diffonde liberamente attraverso la
membrana plasmatica essendo idro e liposolubile. Una volta entrato nella cellula
post-sinaptica, il neurotrasmettitore può esplicare la sua funzione attraverso la
sintesi di GMPc.
Ruolo dell’NO nella morte cellulare
L’NO svolge un duplice ruolo nella modulazione del processo apoptotico: può, in
base alla sua concentrazione e al tipo cellulare, attivare o inibire il processo di
morte.
Effetto pro-apoptotico
Se prodotto ad elevate concentrazioni l’NO e i suoi derivati possono alterare le
funzioni cellulari e portare alla perdita di funzioni enzimatiche, alle mutazioni del
DNA e all’alterazioni della membrana plasmatica. Un tessuto particolarmente
sensibile all’effetto citotossico dell’NO è il sistema nervoso centrale: i ROS insieme ai
RNS sono, infatti, i responsabili della morte cellulare nelle malattie
neurodegenerative. L’induzione di apoptosi sembra essere mediata soprattutto, dai
danni al DNA che portano ad un accumulo di p53 e alla conseguente espressione di
p21 che provoca l’arresto del ciclo cellulare. Se il danno non può essere riparato, la
cellula va incontro ad apoptosi. Nel mitocondrio, inoltre, si osserva un calo della
proteina anti-apoptotica Bcl-2 ed il rilascio del citocromo c nel citosol che porta
all’attivazione della cascata di caspasi e all’esecuzione del programma di morte
cellulare. Bersaglio dell’NO può essere anche il citocromo c ossidasi: il
danneggiamento di questa via porta ad un aumento di ROS.
Effetto anti-apoptotico
L’effetto anti-apoptotico indotto dall’NO, si ottiene in presenza di basse
concentrazioni (dell’ordine dei μM). L’NO esercita gli effetti citoprotettivi attraverso
la sua diretta o indiretta interazione con il macchinario apoptotico:
Induzione delle proteine da stress. L’NO attraverso l’ossidazione del glutatione
ridotto intracellulare può cambiare i livelli di antiossidante, provocando stress
nitrosativo o ossidativo. Il calo dei livelli di glutatione stimola l’attivazione di
proteine da shock termico come HSP32 e HSP70, note proteine anti-apoptotiche.
Esse, infatti sembrano mediare l’inibizione dell’attivazione delle caspasi, attraverso il
sequestro del citocromo c espulso nel citosol.
Accumulo di GMPc. L’NO stimolando l’attività della guanilato ciclasi solubile, induce
un accumulo di GMPc che porta ad un calo della concentrazione di calcio
intracellulare, che rappresenta un segnale chiave per l’apoptosi. I meccanismi
molecolari alla base di questa inibizione coinvolgono l’attivazione di protein chinasi
e l’inibizione dell’attività delle caspasi.
Soppressione dell’attività delle caspasi. Tutte le caspasi presentano un residuo di
cisteina nel sito catalitico, essenziale per la loro attività, che può essere S-nitrosilato
dall’NO e quindi inibire l’attività di queste proteasi a cisteina.
Inibizione del rilascio di citocromo c. Assieme a Bcl-2, anche l’NO, sembra essere
coinvolto nell’inibizione del rilascio del citocromo c nel citosol. Poiché la stessa Bcl-2
è substrato delle caspasi, la S-nitrosilazione di quest’ultime previene l’inattivazione
della funzione anti-apoptotica svolta da Bcl-2 e di conseguenza il rilascio di
citocromo c nel citosol.
Regolazione delle NOS
Tra le varie isoforme della NOS, la nNOS è sicuramente la più complessa.
Innanzitutto, questa isoforma è costituita da un dominio addizionale, rispetto alle
altre isoforme, PDZ (PSD-95/Discs large/Zona occludens-1) all’N-terminale, che ne
permette il legame alla membrana plasmatica. Inoltre, esiste la possibilità di una
regolazione a livello post-trascrizionale che porta alla formazione di varianti di
splicing.
L’attività della NOS può essere controllata a livello trascrizionale, ma senza dubbio i
processi di regolazione più frequenti ed importanti sono quelli post-trascrizionali o
post-traduzionali. Questi includono: 1) la regolazione dell’attività; 2) la regolazione
della localizzazione; 3) lo splicing alternativo.
Regolazione dell’attività. L’attività delle NOS può essere regolata attraverso
interazioni proteina-proteina o da modificazioni covalenti.
La calmodulina (CaM) è stata la prima proteina ad essere identificata come fattore in
grado di modulare l’attività della NOS tramite un’interazione diretta. È proprio la
Ca2+-dipendenza per la sintesi di NO a distinguere le isoforme costitutive della NOS
(nNOS e eNOS) che richiedono una maggiore disponibilità di Ca2+, rispetto a quanto
accade per la iNOS.