DOSAGGIO ACIDI NUCLEICI

Per dosaggio di acidi nucleici si intende la determinazione

della quantità di un acido nucleico in un determinato
materiale biologico.

E' possibile dosare gli A.N. essenzialmente con tre metodiche:

1) METODO SPETTROFOTOMETRICO

2) METODO COLORIMETRICO

3) METODO FLUORIMETRICO
SPETTROFOTOMETRO E CUVETTE
 METODO SPETTROFOTOMETRICO

Il metodo spettrofotometrico sfrutta la capacità degli acidi nucleici di

assorbire la luce UV con un massimo di assorbimento ad una
lunghezza d'onda di 260 nm, lo spettro di assorbimento varia da 230
nm a 280 nm.

D.O.

230 260 290 nm

Gli A.N. hanno il massimo di assorbimento a 260 nm

1 nm 400 nm
La misurazione dell’assorbimento ottico è uno strumento importante
per l’analisi dei nucleotidi ed acidi nucleici.
La frazione della luce incidente (I°) assorbita da una soluzione ad una
data lunghezza d’onda (λ) è correlata al cammino ottico (l) ed alla
concentrazione (c) della specie assorbente.
Queste due relazioni sono combinate nella :

LEGGE DI LAMBERT e BEER

I°
Log----------- = ε l c
I I° I
Dove I ° = luce incidente
I = luce trasmessa l
e = coefficiente di estinzione molare
l = cammino ottico Quarzo per UV
Plastica per visibile
c = concentrazione
La legge presuppone che la luce incidente sia parallela e
monocromatica (di una sola lunghezza d’onda) e che le molecole di
soluto e di solvente siano orientate in modo casuale.
L’espressione log I0/I viene detta Assorbanza e indicata con A, o
Densità ottica ed indicata con D.O.

I°
Log----------- = ε l c
I
A= D.O. = ε l c
L’Assorbanza è direttamente proporzionale alla concentrazione del
soluto che sta assorbendo la luce.
Il coefficiente di estinzione molare ε varia con:
- La natura chimica del composto
- Il solvente
- La lunghezza d’onda
 A= D.O. = ε l c

C=
D.O.
εl
Se l = 1cm (di solito le cuvette hanno lati di 1 cm)
Se c = 1M
Allora D.O. ed ε hanno lo stesso valore:

D.O. = ε
Il coefficiente di estinzione molare ε rappresenta l’Assorbanza (o
densità ottica) di una soluzione a concentrazione 1M e a cammino
ottico unitario.
 M= n/V
n= g/PM
M= g/PM V
g = M PM V

Non è possibile stabilire a priori il peso molecolare di un acido nucleico

dopo la sua estrazione e purificazione.!!!!!
Ma anche se si sapesse non è possibile preparare una soluzione 1M di
un acido nucleico in quanto occorrerebbero grandi quantità.

Es.: tRNA = PM 50.000 dalton

Per fare una soluzione 1M bisognerebbe sciogliere 50.000 g in 1litro
(ovvero 50 gr in 1 ml).

Quindi non è possibile usare il coefficiente di estinzione molare (ε) nel

dosaggio degli Acidi Nucleici
Per gli acidi nucleici si usa il :

coefficiente di estinzione specifico (K)

Che sostituisce ε.
K è stato determinato sperimentalmente ed esprime l’assorbanza
di una soluzione a concentrazione 1mg/1ml alla lunghezza d’onda
di 260 nm

K = 21 (DNA nativo a doppia elica ds)

K = 23 (DNA denaturato a singola elica ss)

K = 25 RNA

Quindi (a 260 nm): c = D.O./ K

 DETERMINAZIONE PUREZZA

L'interferenza dovuta a contaminanti può essere evidenziata

mediante il calcolo dei "rapporti".
Il rapporto A260/A280 è usato per stimare la purezza degli acidi
nucleici, dal momento che le proteine assorbono a 280 nm.
Un DNA puro dovrebbe avere un rapporto di circa 1.8, mentre un
RNA puro dovrebbe dare un valore di approssimativamente 2.0.
L'assorbanza a 230 nm riflette la contaminazione del campione
dovuta a sostanze come carboidrati, fenoli, peptidi o composti
aromatici.
Per campioni puri il rapporto A260/A230 dovrebbe essere circa 2.2.
Le proteine sono comunque la principale fonte di contaminazione,
per cui dopo la lettura occorre sottrarre l’assorbimento a 280.
 METODO COLORIMETRICO

Anche il metodo colorimetrico utilizza lo spettrofotometro per la

determinazione del dosaggio.
Il metodo si basa sulla formazione di complessi colorati di
particolari sostanze in maniera specifica con il ribosio o con il
deossiribosio dello scheletro degli Acidi Nucleici.

La reazione colorimetrica è altamente specifica in quanto:

La DIFENILAMMINA (DFA) reagisce con il deossiribosio (DNA).
L’ORCINOLO reagisce con il ribosio (RNA).

Ci permette di valutare esattamente la quantità di DNA o RNA

presenti in soluzione, anche se la soluzione contiene entrambi
gli ac. Nucleici.
 DIFENILAMMINA (DFA) per il DNA

Una reazione specifica per il DNA prevede l'uso di difenilammina, che

forma un complesso di colore celeste complessandosi con il DNA.
La miscela è così composta:

- DNA.
- DIFENILAMMINA (DFA) (che viene sciolta in acido acetico).
- ACIDO PERCLORICO.
- ALDEIDE ACETICA.

Il tutto viene incubato a 37°C over night.

La densità ottica viene letta a lunghezza d'onda di 595 nm. (VISIBILE)
Dopo l’incubazione si ottiene una colorazione celeste.
 ORCINOLO per l’RNA

Per l’ RNA la reazione colorimetrica si svolge in presenza di:

- ORCINOLO
- TRICLORURO FERRICO (sciolto in acido cloridrico)

Si incuba a 40°C over night.

La densità ottica si legge a 670 nm. (VISIBILE)
Si ottiene una colorazione verde.
Per poter risalire alla concentrazione dell'acido nucleico, in
entrambi i casi, è necessario approntare un sistema di taratura
costituito da concentrazioni crescenti note di DNA o RNA.

L'intensità colorimetrica è direttamente proporzionale alla

concentrazione degli acidi nucleici.

E' possibile quindi con una retta di taratura interpolare il valore di

D.O. del campione sconosciuto per poterne determinare la sua
concentrazione.
 D.O.
595 nm

0.8

X
0.4

0.2

2 4 Y 8 conc
mg/ml

RETTA DI TARATURA
 METODO FLUORIMETRICO

In questo caso la concentrazione può essere stimata in base alla

fluorescenza emessa dall’ Etidio Bromuro.

Quantità crescenti e a concentrazione nota di acido nucleico

vengono poste su gel accanto al nostro campione a concentrazione
incognita.

Dopo la corsa elettroforetica il gel viene immerso in una soluzione di

Etidio Bromuro che si intercala tra le basi dell'acido nucleico
rendendolo fluorescente alla luce UV.
10 ng 50 ng 100 ng 300 ng 1000 ng Conc. X
 SPOT TEST
Nei casi in cui la concentrazione del DNA non è sufficiente < 250 ng/ml o quando non è
necessaria troppa precisione si preferisce un metodo rapido, chiamato spot test, basato
sulle proprietà del bromuro di etidio di intercalarsi tra le basi azotate emettendo
fluorescenza quando eccitato dalla luce ultravioletta (tra 260 e 320 nm )

Poiché l’intensità della fluorescenza è proporzionale alla massa del DNA (o RNA)
utilizzato, è possibile stimare la concentrazione del campione in esame comparandolo
con una serie di standard a concentrazione nota compresi tra 2 e 100 ng.

25ng 12,5ng piastra di agarosio all 1%

50ng
5ng contente EtBr 0,5 µg/ml
100ng
x

E’ il caso di ricordare che, sia la lettura spettrofotometrica che lo spot test,

non danno alcuna informazione sull’integrità strutturale degli acidi nucleici.
Sia acidi nucleici integri che forme degradate a vario livello, sino a singoli
nucleotidi, saranno stimate allo stesso modo. Per avere informazioni sulla
qualità del DNA o RNA, quindi, gli acidi nucleici devono essere analizzati
per elettroforesi su gel