H.P.L.C.

TECNICHE SPETTROSCOPICHE
Cromatografia liquida ad alta pressione
Si basano sullo studio dell’interazione
radiazione-materia

chimclinica2012@gmail.com
Psw: clin2012
Natura della radiazione elettromagnetica

Ondulatoria: onda elettromagnetica

Corpuscolare: treno di particelle dette quanti o fotoni

Lunghezza d’onda (l): distanza tra i massimi di due onde consecutive
Frequenza (n): n. di oscillazioni complete in un sec
C=ln
SPETTRO delle radiazioni elettromagnetiche

SPETTRO VISIBILE

780 nm 380 nm
Natura della radiazione elettromagnetica

Ondulatoria: onda elettromagnetica

Corpuscolare: treno di particelle dette quanti o fotoni

Energia dei fotoni E = h n

h è la costante di Plank

Ad una determinata n l’energia di ciascun fotone è sempre la stessa

L’assorbimento delle radiazioni nella materia è un processo

molto vario e complesso. I parametri importanti sono:
tipo e energia della radiazione incidente, natura del materiale.
Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare
Spettroscopia di assorbimento

Ciascun nucleo possiede una carica e alcuni nuclei (1H, 31P) hanno la
proprietà di ruotare su se stessi (spin).
La rotazione di una carica genera un campo magnetico.

Il protone si comporta come una calamita

 In assenza di campo magnetico In presenza di campo magnetico

Ai 2 orientamenti corrispondono
2 livelli energetici

Quando si applica una radiazione di opportuna n (risonante, 200 MHz), i nuclei

passando allo stato ad alta energia assorbono una frazione dell’energia applicata.
Risonanza Magnetica in clinica
Analizza il comportamento dei protoni nelle molecole di acqua
(80% della massa del corpo umano) quando sottoposte a campi magnetici
ad elevata intensità.

Si applicano onde radio e i nuclei passano allo stato ad alta energia.

Il segnale radio è quindi interrotto e i protoni tornano nella posizione

precedente.
Ritornando al livello energetico più basso emettono radiazioni che
vengono trasmesse a un computer e trasformati in immagini 3D.

I tessuti ricchi di H2O, le cui molecole sono più mobili danno segnale
più forte, mentre quelli delle strutture rigide, come l’osso non ne
danno affatto.
In chimica clinica si utilizzano principalmente tecniche
spettrofotometriche che utilizzano la luce UV-visibile (180-800nm)

SPETTRO VISIBILE

780 nm 380 nm
La Spettrofotometria si basa su due principi:

• alcune molecole hanno la capacità di assorbire la luce

ad una determinata l;

• La quantità di luce assorbita è proporzionale alla

quantità di sostanza presente.

I/Io = Trasmittanza (T)
 log 1/T = Assorbanza (A)

L’assorbanza è la grandezza di più immediata utilità essendo

direttamente proporzionale alla conc. molare della sostanza.
Legge di Lambert Beer

A=ecl

c = concentrazione
e = coefficiente di estinzione molare
l = cammino ottico
Perché alcune sostanze assorbono la luce
(solo a determinate l)?

Elettrone allo
stato eccitato

fotone
DE Solo se E fotone = DE = E2-E1
E = hn
Elettrone allo stato
fondamentale
Come si seleziano determinate l?

Luce è policromatica (miscuglio di radiazioni a diversa l)

Luce monocromatica
(caratterizzata da una sola l)

Disperde le radiazioni grazie alla rifrazione

Spettro a righe
Spettro a bande

Analisi quali-
quantitative
Livelli energetici e transizioni elettroniche nell’atomo di sodio
(N=11)

4p

4s
3d
4s 3s  4p 330 nm

3p
3s 3s  3p 590 nm

2p

2s

1s
Livelli energetici e transizioni elettroniche in una molecola

Sottolivelli rotazionali
Livelli elettronici
Sottolivelli vibrazionali
Perché si misura l’assorbanza al picco di assorbimento?
Fotometro o Spettrofotometro?

Un fotometro consiste di una sorgente, di un sistema di

fenditure, di filtri, di un rivelatore fotoelettrico.

Uno spettrofotometro differisce dal fotometro per il fatto che

esso contiene un più sofisticato sistema per selezionare una
ristretta e precisa gamma di radiazioni.
 Applicazioni della spettrofotometria UV-VIS
in chimica clinica

1) Proteine
2) Emoglobina e metaboliti (bilirubina)
3) Zuccheri e metaboliti (glucosio)
4) Lipidi (colesterolo, trigliceridi)
5) Ormoni
6) Enzimi (AST, ALT, CK, LDH)
Analisi delle proteine plasmatiche totali

Metodo del Biureto (colorimetrico)

Lo ione Cu2+ reagisce con i legami peptidici in soluzione alcalina

con formazione di un complesso che assorbe a 540 nm (blu).

Il reagente contiene Na,K tartrato, che complessa lo ione Cu2+ e

ne previene la precipitazione.

Misura spettrofotometrica in bicromatismo (540 -700 nm)

Interferenze: emolisi
Misure in bicromatismo

Misura a due diverse l sullo stesso campione.

Permette di evitare l’allestimento del Bianco (miscela

contenente il campione e tutti i reagenti eccetto quello
che porta alla formazione del cromoforo)
Le Proteine Plasmatiche

Insieme di macromolecole estremamente eterogeneo per

caratteristiche chimiche e funzione.

Origine prevalentemente epatica, eccetto immunoglobuline

(plasmacellule), alcune lipoproteine (intestino)

Valori sierici di riferimento: 65-83 g/l

Si dividono in 2 gruppi:

1) Albumine
2) Globuline (4 tipi principali)
Mediante tecniche di laboratorio è possibile
fornire al clinico i valori di:

• proteine totali plasmatiche

• albumina

• rapporto albumina/globuline
L’aumento di proteine totali plasmatiche (meno frequente):

per disidratazione (vomito, diarrea, eccessiva sudorazione)

La diminuzione di proteine totali plasmatiche (piu’ frequente):

Diminuita sintesi per:

- insufficiente assunzione di amminoacidi (malnutrizione, malassorbimento)
- Malattie epatiche

Aumentata perdita per danni renali (escrezione eccessiva per

malfunzionamento glomerulo)
Analisi delle proteine nelle urine

La presenza di proteine nelle urine (proteinuria) puo’

indicare un danno renale che provoca maggior
permeabilità del glomerulo renale alle proteine plasmatiche

Nei soggetti normali: 40-150 mg/24h

 Analisi delle proteine nelle urine
Metodo colorimetrico per dosaggio proteine totali
Il colorante Coomassie Brilliant Blue si lega specificatamente a residui di
arginina, triptofano, tirosina, istidina e fenilalanina. Agisce primariamente
con i residui di arginina.

Il legame del colorante alle proteine determina uno spostamento del max di
assorbimento del colorante da 465 nm (rosso) a 595 nm (blu) in soluzioni acide.

Misura spettrofotometrica in bicromatismo (595 -465 nm)

…Although the method is simple and fast, the unequal
dyebinding responses of individual proteins require
caution when applying this test to the complex mixture of
protein found in serum.
Enzimi come reagenti
Determinazione del Glucosio con metodo
spettrofotometrico
Glucosio
Glucosio + O2 + H2O acido gluconico + H2O2
ossidasi
perossidasi
H2O2 + 4-aminoantipirina + fenolo chinoneimina + H2O

Cromoforo
Colorazione rossa
Enzimi come indici di sofferenza tissutale
(ausilio diagnostico)
Determinazione della Lattico Deidrogenasi (LDH) nel sangue

LDH
Piruvato + NADH + H+  Lattato + NAD+

Solo NADH assorbe a 340 nm

LDH H4 aumenta nell’infarto del miocardio, LDH M4

aumenta nelle lesioni di tessuto muscolare o epatico
Il coenzima NAD è coinvolto nelle
reazioni catalizzate dalle deidrogenasi
 Fluorimetria

a) Rilassamento termico
DE
E = hn b) hn

ASSORBIMENTO EMISSIONE
(ECCITAZIONE)
 Spettrofotometria di fluorescenza

Sensibilità è 100-10000 volte superiore a metodi fotometrici

Maggiore specificità
Fluorimetro
 Determinazione quantitativa

L’intensità di fluorescenza è proporzionale alla

concentrazione dell’analita (in soluzione diluite)

VANTAGGI

Sensibilità è 100-10000 volte superiore a metodi fotometrici

Maggiore specificità

SVANTAGGI

Sensibilità a variazione delle condizioni sperimentali (pH, temperatura)

quenching
Studio e diagnosi di malattie congenite da alterazione del
metabolismo degli amminoacidi (fenilchetonuria)
La presenza di aspartame nel prodotto fa sì che esso
contenga una fonte di fenilanina. Pertanto, il prodotto
non è adatto a persone affette dalla malattia ereditaria
denominata fenilchetonuria.
Amminoacidopatie
Fenilchetonuria deficienza dell’enzima fenilalanina
idrossilasi (PAH)

X
Fenilalanina
transaminasi
Inibitore competitivo
per piruvato

Inibitore di enzimi
O=
della glicolisi
Barriera
Phenylpyruvate Emato-Encefalica
Citrullinemia deficienza dell’enzima argininosuccinato sintetasi

CICLO
DELL’UREA
AA vengono derivatizzati con sostanza
fluorescente per essere rivelabili
 a) Rilassamento termico
DE
E = hn b) hn

ASSORBIMENTO EMISSIONE
(ECCITAZIONE)
Processi che danno luogo ad emissione di energia radiante

Eccitazione tipi di luminescenza

Radiazione EB fotoluminescenza (fluorescenza, fosforescenza)

Reazione chimica chemiluminescenza

Reazione in sistemi biologici bioluminescenza

Luminescenza
Emissione di luce da parte di una molecola che
passa dallo eccitato allo stato fondamentale

Quando lo stato eccitato viene prodotto da una

reazione chimica, si parla di chemiluminescenza

Perossidasi

luminolo
Condizione necessaria perchè si verifichi
chemiluminescenza è che la reazione sia esoergonica in
modo che i prodotti della reazione si vengano a trovare in
stati elettronici eccitati. L'emissione si verifica poi per
fluorescenza.

Limite di rivelabilità: 10-15 M

Intervallo di linearità: 10-12 – 10-6 M

Turbidimetria e Nefelometria
Tecniche analitiche impiegate per misurare la luce diffusa.

La diffusione della luce è un fenomeno fisico che dipende dalla

concentrazione e dalla dimensione di particelle in un campione .

Rivelatore: a 180° rispetto a radiazione incidente

a 90° rispetto a raggio incidente