Spettroscopia molecolare

Prof. Lorenzo Stella

Settore F, livello 1 (chimica fisica), stanza 4
06-7259-4463
stella@stc.uniroma2.it
 Programma
• Spettroscopia di emissione
• Spettroscopia risolta nel tempo
– Tempi di vita di fluorescenza
– Anisotropia risolta nel tempo
– Assorbimento transiente
• Spettroscopia con luce polarizzata
– Dicroismo lineare
– Anisotropia di fluorescenza
– Dicroismo circolare
• Spettroscopia di singola molecola
– Microscopia di fluorescenza
– Spettroscopia di singola molecola
– Spettroscopia di correlazione della fluorescenza
• Elementi di strumentazione
– Laser
– Monocromatori
– Rivelatori
• Esperienze di laboratorio.
Wiley 2012 Springer 2006 CRC Press 2014
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 Programma
• Spettroscopia di emissione
• Spettroscopia risolta nel tempo
– Tempi di vita di fluorescenza
– Anisotropia risolta nel tempo
– Assorbimento transiente
• Spettroscopia con luce polarizzata
– Dicroismo lineare
– Anisotropia di fluorescenza
– Dicroismo circolare
• Spettroscopia di singola molecola
– Microscopia di fluorescenza
– Spettroscopia di singola molecola
– Spettroscopia a correlazione della fluorescenza
• Elementi di strumentazione
– Lasers
– Monocromatori
– Rivelatori
• Esperienze di laboratorio.
 Table of contents
• Introduction
• Elementary molecular orbital theory
• Light absorption and excited-state deactivation
• Excited states: physical and chemical properties
• From molecules to supramolecular systems
• Quenching and sensitization processes in molecular and supramolecular
species
• Molecular organic photochemistry
• Photochemistry and photophysics of metal complexes
• Interconversion of light and chemical energy by bimolecular redox processes
• Light-powered molecular devices and machines
• Natural and artificial photosynthesis
• Experimental techniques
• Light control of biologically relevant processes
• Technological applications of photochemistry and photophysics
• Green (photo)chemistry
• Research frontiers

Wiley 2014
472 pp.
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University Science Books 2008 Wiley 2009
350 pp. 564 pp.
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 Part One Basic Methods in Biophysical Chemistry 11
1 Basic Optical Principles 13
2 Optical Properties of Biomolecules 41
3 Basic Fluorescence Techniques 61
4 Chiroptical and Scattering Methods 105
5 Magnetic Resonance Techniques 121
6 Mass Spectrometry 149
Part Two Advanced Methods in Biophysical Chemistry 167
7 Fluorescence Microscopy 169
8 Super-Resolution Fluorescence Microscopy 183
9 Single-Biomolecule Techniques 203
10 Ultrafast- and Nonlinear Spectroscopy 257
11 DNA Sequencing and Next-Generation Sequencing Methods 285
12 Special Techniques 303
13 Assay Development, Readers and High-Throughput Screening 323

63 € (II edizione, 2015) 344 p.

Per il dicroismo lineare/circolare
 1
Richiami
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mantenere l’anonimato!)
• Rispondete il più
rapidamente possibile,
avete massimo 30 s a
domanda
• Appena finito, tornate qui.
https://kahoot.it/challenge/08030416?challenge-id=0c3202ea-7481-
4cbd-bee7-562262d86200_1615154814585
 Diagramma di Jablonski
per l’assorbimento elettronico

200

ε (M cm )
-1
-1
100

0
230 240 250 260 270

λ (nm)
 Perché parliamo di livelli energetici
elettronici, rotazionali, vibrazionali, di spin?

200

ε (M cm )
-1
-1
100

0
230 240 250 260 270

λ (nm)
Born-Oppenheimer!
me~ 10−30 kg mp~ 10−27 kg

mp/ me ~1000
ma le forze che agiscono su entrambi sono confrontabili!

I nuclei si muovono molto più lentamente degli elettroni

∆Eel. ≈ 10 ∆Evib. ≈ 10 ∆Erot .

2 2
 L’Hamiltoniana totale è
       
H (r , R) = TN ( R) + Te (r ) + VNN ( R) + Vee (r ) + VNe (r , R)

Se fosse separabile in
   
H (r , R) = H N ( R) + H e (r )

avremmo
 
 
Ψ (r , R) = χ N ( R)ϕe (r )

Tuttavia c’è il termine

 
VNe (r , R)
 Gli elettroni si muovono molto più velocemente dei nuclei!
Fissiamo un valore di R.
In questo caso l’hamiltoniano per gli elettroni diventa
   
H e (r ; R ) = Te (r ) + Vee (r ) + VNe (r ; R ) + VNN ( R )

(abbiamo aggiunto anche VNN, che non riguarda gli elettroni,

perché tanto, per R fissato, è solo una costante)

Cerchiamo le autofunzioni di He
j  j 
H eϕe (r ; R ) = Ee ( R )ϕe (r , R )
j
 Ora vediamo se le autofunzioni totali possono essere
approssimate come:
  j 
 k 
Ψ j,k
(r , R ) = ϕe (r ; R ) χ N ( R )

L’equazione di Schrödinger totale diventa:

  j,k   j,k 

H (r , R)Ψ (r , R) = E Ψ (r , R)
j,k

Sviluppiamo il primo termine:

  j,k  
H (r , R)Ψ (r , R) =
 j   k 
= TN ( R)ϕe (r , R ) χ N (R ) +
     j   k 
+ [Te (r ) + Vee (r ) + VNe (r ; R) + VNN ( R)]ϕe ( r , R) χ N ( R) =
 j   k   j   k 
= TN ( R)ϕe (r , R ) χ N ( R ) + Ee ( R )ϕe (r , R ) χ N ( R )
j
 Rigorosamente parlando, TN non commuta con ϕ.
Tuttavia, sempre per i soliti motivi, ϕ varia lentamente con R,
e quindi si può approssimare:
  j,k   j 
  k  j 
 j  k 
H (r , R )Ψ (r , R ) = ϕe (r , R )TN ( R ) χ N ( R ) + ϕe (r , R ) Ee ( R ) χ N ( R )

L’equazione di Schrödinger diventa:

  k  
[TN ( R ) + Ee ( R )]χ N ( R ) = E χ N ( R )
j j,k k
La funzione d’onda nucleare può a sua
volta essere fattorizzata in una parte
vibrazionale, una rotazionale ed una
traslazionale.

Nella funzione d’onda elettronica

(trascurando l’accoppiamento spin-
orbita) si può fattorizzare la funzione
d’onda di spin.
Ψ = ϕeϕ s χV χ R χT
 Perché in fase condensata
non si vede la struttura rotazionale
(e spesso neanche la vibrazionale)?

200

ε (M cm )
-1
-1
100

0
230 240 250 260 270

λ (nm)
 Larghezza di riga!
• Principio di indeterminazione τ ∆E ≥ 

ν ν 2kT ln 2
• Effetto Doppler: ν obs. =
v
∆ν =
c m
1±
c

• Interazioni soluto-solvente!
Perché, a T ambiente tutte le molecole si
trovano nello stato fondamentale
(elettronico e vibrazionale)?

200

ε (M cm )
-1
-1

100

0
230 240 250 260 270

λ (nm)
 Boltzmann!
E1 − E0
N1 −
=e kT
N0

∆E = hν = h(c / λ )
200
ε (M cm )
-1
-1

100
h= 4.13566733(10)×10−15 eV s
c= 299792458 m/s
e= −1.602176487(40)×10−19 C
0
4.6 4.8 5 5.2 5.4

E (eV)
N1 k=8.62  × 10−5 eV K-1
∆E = 5 eV = 10 −84
N0 T=300 K
∆E = 0.12 eV
N1
= 0.01 kT=2.59 × 10−2 eV
N0
Cosa determina la probabilità di
transizione?

200

ε (M cm )
-1
-1

100

0
230 240 250 260 270

λ (nm)
 Assorbimento (stimolato)

hν10

prima dopo

d[ N0 ]  1  2
= −[ N 0 ] I (ν 10 ) 1 µ 0 
 2cε 0 
2
dt 
• Transizioni σσ* sono normalmente ad energie fuori della zona
misurabile dell’UV/Vis (<180 nm)
• Transizioni ππ* hanno una grossa sovrapposizione degli orbitali e
quindi hanno elevati coefficienti di estinzione (>1000 cm-1 M-1).
• Transizioni nπ* non hanno sovrapposizione degli orbitali e quindi
hanno coefficienti di estinzione molto bassi (<200 cm-1 M-1)
Cosa determina l’intensità relativa
delle diverse bande vibroniche?

200

ε (M cm )
-1
-1

100

0
230 240 250 260 270

λ (nm)
Franck-Condon!
 Fattori di Franck
 
Condon
μ = μ N + μe

Ψ1 μ Ψ0 =
1 j   0 k
= ϕe χ ' N μ N + μ e ϕe χ N =
 
= ϕe1 χ ' Nj μ N ϕe0 χ Nk + ϕe1 χ ' Nj μ e ϕe0 χ Nk =
 1
≅ ϕe1 ϕe0 χ ' Nj μ N χ N + χ ' N χ N ϕe μ e ϕe0 =
k j k

1
= 0+ χ ' Nj χ Nk ϕe μ e ϕe0

χ ' Nj χ Nk = fattore di Franck - Condon

L’approssimazione consiste nel trascurare la dipendenza (parametrica) dalle coordinate

nucleari della funzione d’onda elettronica.
Le funzioni d’onda vibrazionali non sono ortogonali perché si riferiscono a due stati
elettronici diversi (e quindi a due equazioni di Schrödinger con potenziali diversi).
 2
Rilassamento degli stati eccitati
 d[ Ni ]
= −k p1 [ N i ]
dt
d[ Ni ]
= − k p2 [ N i ]
dt
d[ Ni ]
= − k p3 [ N i ]
dt

d[ Ni ]  
= − ∑ k p j [ N i ]
dt  j 
I processi di decadimento da uno stato eccitato sono (quasi) tutti
processi monomolecolari (del primo ordine).
Per ciascuno si può definire una costante cinetica, con dimensioni s-1.
I vari processi sono in competizione.
 Processi non radiativi:
Rilassamento vibrazionale
• Conservazione dello stato elettronico
• L’energia in eccesso viene ceduta alle
molecole di solvente.

Tempo
caratteristico
∼ps
Processi non radiativi: Conversione esterna
• Conservazione dello spin
• Cambiamento dello stato elettronico
• Processo intermolecolare
• Conversione dell’energia elettronica in vibrazionale
(del solvente)

Tempo
caratteristico
∼ps-ns
Processi non radiativi: Conversione interna
• Conservazione dello spin
• Cambiamento dello stato elettronico
• Processo intramolecolare
• Conversione dell’energia elettronica in vibrazionale

Tempo
caratteristico
∼ps-ns
 Processi non radiativi: Conversione
intersistema (intersystem crossing)
• Processo intramolecolare
• Cambiamento dello spin
Molteplicità=2S+1

Tempo
caratteristico ∼ns
(isoenergetico)
 Perché T1 è ad energia più bassa di S1?

• Funzione d’onda totale: antisimmetrica (Fermioni)

• S1: funzione d’onda di spin antisimmetrica, funzione d’onda spaziale simmetrica
• T1 : funzione d’onda di spin simmetrica, funzione d’onda spaziale antisimmetrica

1 Orbitale molecolare a due elettroni

Φ𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒 1 Φ0 2 ±Φ0 1 Φ𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒 2 ottenuto come combinazione degli orbitali a singolo
2 elettrone [+=S1; -=T1]
In T1, quando le coordinate degli elettroni sono uguali
la funzione d’onda si annulla.
• minore probabilità per gli elettroni di essere vicini
• minore repulsione
• energia più bassa (1° regola di Hund)
 Regola della differenza energetica
(energy gap law)
La probabilità per unità di tempo dei processi
intramolecolari (conversione interna ed intersistema)
diminuisce (esponenzialmente) con il salto energetico
tra i due livelli elettronici.

Questo fenomeno è
dovuto essenzialmente ai
fattori di Franck-Condon.
Costanti di decadimento non radiative di tripletti di idrocarburi aromatici
NOTA: Livelli energetici
dell’atomo di H
∆EN+1→N<< ∆E1→0

Il decadimento non radiativo

S1->S0 è molto meno efficiente
di quello tra gli stati eccitati
(di un fattore 106)
NOTA: L’efficienza
dei processi non radiativi intermolecolari
dipende dalla mobilità dell’ambiente
(es. T)
 Processi non radiativi:
Dissociazione e predissociazione

Dissociazione: Predissociazione:
l’eccitazione fornisce un’energia La molecola passa per
sufficiente a rompere un legame. conversione interna ad uno
stato non legato.
 Processi non radiativi:
Spegnimento dell’emissione (quenching)
Oltre alla conversione esterna, le molecole di solvente o di altri cosoluti
possono causare il decadimento non radiativo tramite diversi processi (a corta
distanza <10-100 Å).
Ad esempio:
• Aumento della conversione intersistema:
– atomi pesanti (l’accoppiamento spin-orbita dipende dalla 4° potenza del
numero atomico)
– ossigeno.
• Trasferimento energetico:
D*+A→D+A*
• Trasferimento elettronico fotoindotto :
D*+A→D++A-
A*+D→A-+D+
• Trasferimento protonico fotoindotto:
(DH..A)* →(D..HA)*
(DH..A)* →(D-..H+A)*
 Luminescenza
Emissione di luce da parte di atomi, cristalli o molecole
in uno stato elettronico eccitato
Eccitazione chimica:
Chemiluminescenza

Eccitazione tramite illuminazione:

Fotoluminescenza

τ~ns Fluorescenza Fosforescenza τ>μs

 Processi radiativi:
fluorescenza
2ν 103  2
kr = 0 µ1 Emissione spontanea
(2πc) ε 0 h
3

S1→S0

N.B.: la transizione è “istantanea”, come

l’assorbimento (~fs)
N.B.: kr ∝ ε
 Processi radiativi:
fosforescenza
2ν 103 
T1→S0
2
kP = S 0 µ T1
(2πc) ε 0 h
3

In prima approssimazione è proibita, ma diventa

possibile per l’accoppiamento spin-orbita.
kP<<kF
Normalmente non riesce a competere con i
processi non radiativi, e quindi in genere
diventa visibile solo in condizioni criogeniche o
campioni solidi