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Fluorescenza in stato
stazionario

Condizioni fotostazionarie
N0+h

kA

N1

kr

N0+h

knr

N0

k A[ N 0 ]

d [ N1 ]
= k A [ N 0 ] (k r + k nr )[ N1 ] = 0
dt
k A [ N 0 ]st = (k r + k nr )[ N1 ]st
[ N1 ]st
kA
=
= k A
[ N 0 ]st (k r + k nr )
Fst k r [ N1 ]st = k r k A [ N 0 ]st = cost.
Fst k r =

Si raggiunge (in pochi ns) una condizione di equilibrio, in cui eccitata una frazione costante di
fluorofori.
Con le normali intensit delle lampade, questa frazione sempre prossima a 0 (kA dipende dal
flusso di fotoni)
Lintensit di fluorescenza costante e proporzionale alla resa quantica.
Nota: lespressione delleccitazione come kA[N0] approssimata (vedi dopo)

Il fluorimetro
Beam splitter

Lampada

ecc.

Monocromatore
di eccitazione

Lente

Campione

em.
Lente
Monocromatore
di emissione

Computer

PMT
riferimento

PMT
segnale

Osservabili: intensit
Dipende da:

Ecc.

Concentrazione di fluoroforo
Efficienza dellassorbimento di radiazione ()
Efficienza dellemissione radiativa (resa quantica)
F fotoni emessi = (fotoni assorbiti) =

Em.

= ( I 0 ' I ' ) = ( I 0 ' I 0 '10 A' ) = I 0 ' (1 10 A' )

fotoni emessi
fotoni assorbiti

F (1 10 A' )
per A'<< 1
10A

d ln(10 A )
d

e
{10A }A = 0 + (10 A ) A = 1+ A
dA
A= 0
dA
A= 0
d A ln10
= 1+ A [e
] = 1+ A { ln10 e A ln10}A = 0 = 1 A ln10
dA
A= 0

1 10A A ln10

(1 10A ' ) A'ln10

F A = C l

Filtro interno

Fluorescence (a.u.)

15

10

0.5

1.5
A

2.5

Filtro interno
Ecc.

Ecc.

Campione diluito

Campione concentrato
50

A
2

) = I 010 (1 10 A' )

F I(centro cella ) I0 10

A ( ecc . )
2

40
Fluorescence (a.u.)

F I 0 ' (1 10

A'

30
Measured
Inner-filter corrected

20

10

A( ecc. ) 0.03 10

0.03
2

= 0.97

0.5

1.5
A

2.5

Filtro interno in emissione

Attenzione!

Assorbanza

Inoltre: lassorbimento un processo istantaneo, la fluorescenza no

sensibilit molto maggiore allambiente del cromoforo (processi non radiativi)
Sensibilit alla dinamica.

Intensit: applicazioni
Misure di concentrazione
(fino a nM, ma anche singola molecola)
Ambiente ed interazioni molecolari del
fluoroforo, tramite

F C l

Partizione acqua membrana

Lipid
concentration

300

320

340

Wavelength (nm)

360

Apparent membrane-bound peptide fraction

Fluorescence intensity (a.u.)

KP

F10 1.1 M
F10 11 M

0.5

F10 30 M

0
0

0.001
Lipid (mM)

Stella et al., Biophys . J. 2004 86: 936945.

Processi di associazione

Fluorescence (arbitrary units)

BSA bound
Free

400

450

500
(nm)

550

600

Curva di associazione dell'ANS alla BSA

1
0,8

0,6
0,4
0,2
0
0

2 10

-6

4 10

-6

6 10

-6

8 10
Cf (M)

-6

1 10

-5

1,2 10

-5

1,4 10

-5

pH

Variazioni
dellambiente
del fluoroforo
Chem. Commun., 2011, 47, 994-996

ESICT=excited state
intramolecular charge transfer
ESIPT=excited state
intramolecular
proton transfer

0,012

BSA Nativa

0,01

0,008

0,006

BSA
BSA+GCL

BSA Denaturata

0,004

0,002

0
300

320

340

360

380
lambda (nm)

400

420

440

460

Altri esempi quando parleremo del

quenching

Osservabili: intensit e resa quantica

Lintensit di fluorescenza una misura relativa, perch
dipende anche da:
Intensit della lampada
Efficienza dei monocromatori
Banda passante utilizzata
Sensibilit del tubo fotomoltiplicatore

Ossia dipende dallo strumento con cui stata determinata

Al contrario,
lassorbanza una misura assoluta [A=log(I0/I)]
la resa quantica una misura assoluta [=kr/(kr+knr)]

Osservabili: resa quantica

misura diretta
Bisogna raccogliere i fotoni emessi in
tutte le direzioni
Sfera integratrice
Materiale altamente riflettente
(es. teflon)

Alternativa: misura calorimetrica

Osservabili: resa quantica

misure per confronto
Fst
F A
st = S
Ast
F

F
A
S

F Ast
A
=
=
F
=S
st S Fst
A Fst
A
Ast
F Ast
= st

Fst A

Osservabili: resa quantica

misure per confronto
S dipende da exc e em:
standard e campione devono avere spettri simili.

Osservabili: resa quantica

misure per confronto
Se standard e campione sono in solventi differenti:

F Ast n

= st

Fst A nst
La frazione di luce
raccolta dal rivelatore
dipende dagli n

i
o

Angolo solido in coordinate sferiche

A
r2

Lintero angolo solido 4

d =

dA
2

1
2

rd r sin d

r
r
d = sin dd
2

d sin d

A causa del diverso indice di rifrazione tra cuvetta ed esterno viene

rivelata una frazione della luce pari a
2

d sin d

2 sin d

i
= 20
o

i2

i
2
=

= 2 =
o
o
o
o o
d sin d 2 sin d d 2

i
o

Legge di Snell
no sin i i
=

ni sin o o
2

i i no
1
= = 2
o o ni ni
F
2 F
= S = S'n
A
A

F Ast n

= st

Fst A nst

Indice di rifrazione a 500 nm

Aria:
1
Acqua:
1.337
Metanolo:
1.345
Etanolo:
1.365
Cicloesano: 1.431

N.B.:
dipendono da !
refractiveindex.info

Per acqua-cicloesano, il
fattore di correzione
(1.431/1.337)2=1.14

 In realt gli spettri di standard e campione non

sono identici
Per tenere conto di tutti i fotoni emessi (come
prevede la definizione di resa quantica) si usa
lintegrale spettrale e non lintensit ad una sola
lunghezza donda
Lintegrale va calcolato in !

F ( ) d
0