cinetica→meccanismo

Per gli enzimi:

Modello di Michaelis-Menten
(1913)
• Reazione a singolo substrato (idrolisi del saccarosio)
Enzima
saccarosio+H20 → glucosio+fruttosio

Osservazione: (Brown, 1902) ad altissime

concentrazioni di substrato, la velocità di reazione
non dipende più da questa variabile (ordine 0).
Modello:

Ipotesi: reazione ES→E+P irreversibile

(valida comunque all’inizio della reazione, quando P non c’è)
Si possono ridurre le variabili
𝐸𝐸 + 𝐸𝐸𝐸𝐸 = [𝐸𝐸]0 (L’enzima è un catalizzatore)
𝑆𝑆 + 𝐸𝐸𝐸𝐸 + 𝑃𝑃 = [𝑆𝑆]0

𝐸𝐸 = [𝐸𝐸]0 −[𝐸𝐸𝐸𝐸] Possiamo eliminare [E] e [P]

𝑃𝑃 = [𝑆𝑆]0 − 𝑆𝑆 − 𝐸𝐸𝐸𝐸

𝑑𝑑 𝑆𝑆
= −𝑘𝑘𝑓𝑓 𝐸𝐸 0 − 𝐸𝐸𝐸𝐸 [𝑆𝑆] + 𝑘𝑘𝑟𝑟 𝐸𝐸𝐸𝐸
𝑑𝑑𝑑𝑑
𝑑𝑑 𝐸𝐸𝐸𝐸
= 𝑘𝑘𝑓𝑓 𝐸𝐸 0 − 𝐸𝐸𝐸𝐸 𝑆𝑆 − 𝑘𝑘𝑟𝑟 + 𝑘𝑘𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 𝐸𝐸𝐸𝐸
𝑑𝑑𝑑𝑑
Soluzione esatta trovata solo nel 2010!
• Trucco di M&M: metodo delle velocità iniziali
• Trucco di M&M: metodo delle velocità iniziali

Ricorda qualcosa?
Modello di M&M
Ipotesi: equilibrio kcat<<kf, kr

Se consideriamo la velocità iniziale,

allora [S]≅ [S]o
Modello di stato stazionario
(Briggs & Haldane)
Ipotesi (meno stringente):
all’inizio della reazione c’è un periodo
di tempo per cui la velocità è costante.
[ES]=costante.
Valida per [E]0<<[S]0 (realistica)

[P] cresce linearmente

v=cost.

Pre-SS
(ms) SS
 𝑑𝑑 𝑆𝑆
= −𝑘𝑘𝑓𝑓 𝐸𝐸 0 − 𝐸𝐸𝐸𝐸 𝑆𝑆 + 𝑘𝑘𝑟𝑟 𝐸𝐸𝐸𝐸
𝑑𝑑𝑑𝑑
𝑑𝑑 𝐸𝐸𝐸𝐸
= 𝑘𝑘𝑓𝑓 𝐸𝐸 0 − 𝐸𝐸𝐸𝐸 𝑆𝑆 − 𝑘𝑘𝑟𝑟 + 𝑘𝑘𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 𝐸𝐸𝐸𝐸
𝑑𝑑𝑑𝑑
[S] e [ES] variano alla stessa velocità?
Consideriamo le variazioni relative, per vedere se sono dello stesso ordine nell’unità di tempo.
Dividiamo per la massima concentrazione possibile ([S]0 e [E]0, rispettivamente)

𝑑𝑑 𝑆𝑆 / 𝑆𝑆 0 1
= − 𝑘𝑘𝑓𝑓 𝐸𝐸 0 − 𝐸𝐸𝐸𝐸 𝑆𝑆 − 𝑘𝑘𝑟𝑟 𝐸𝐸𝐸𝐸
𝑑𝑑𝑑𝑑 𝑆𝑆 0
𝑑𝑑 𝐸𝐸𝐸𝐸 / 𝐸𝐸 0 1
= 𝑘𝑘𝑓𝑓 𝐸𝐸 0 − 𝐸𝐸𝐸𝐸 𝑆𝑆 − 𝑘𝑘𝑟𝑟 + 𝑘𝑘𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 𝐸𝐸𝐸𝐸
𝑑𝑑𝑑𝑑 𝐸𝐸 0
Ipotesi: eccesso di substrato (realistica) 𝐸𝐸 0 ≪ 𝑆𝑆 0

𝑑𝑑 𝐸𝐸𝐸𝐸 / 𝐸𝐸 0 𝑑𝑑 𝑆𝑆 / 𝑆𝑆 0
≫
𝑑𝑑𝑑𝑑 𝑑𝑑𝑑𝑑
Nella fase pre-SS (pochi ms, prima delle nostre osservazioni),
[ES] cresce rapidamente, mentre [S]≅[S]0.

Man mano che aumenta [ES], diminuisce la sua velocità di

variazione.

Rapidamente si raggiunge una condizione di stato stazionario,

in cui

𝑑𝑑 𝐸𝐸𝐸𝐸
= 𝑘𝑘𝑓𝑓 𝐸𝐸 0 𝑆𝑆 0 − 𝑘𝑘𝑟𝑟 + 𝑘𝑘𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 + 𝑘𝑘𝑓𝑓 𝑆𝑆 0 𝐸𝐸𝐸𝐸 𝑠𝑠𝑠𝑠 =0
𝑑𝑑𝑑𝑑

𝑘𝑘𝑓𝑓 𝐸𝐸 0 𝑆𝑆 0 𝑆𝑆 0
𝐸𝐸𝐸𝐸 𝑠𝑠𝑠𝑠 = = 𝐸𝐸 0
𝑘𝑘𝑟𝑟 + 𝑘𝑘𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 + 𝑘𝑘𝑓𝑓 𝑆𝑆 0 𝑘𝑘𝑟𝑟 + 𝑘𝑘𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐
+ 𝑆𝑆 0
𝑘𝑘𝑓𝑓
 𝑆𝑆 0 𝑆𝑆 0
𝑣𝑣 = 𝑘𝑘𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 𝐸𝐸𝐸𝐸 𝑠𝑠𝑠𝑠 = 𝑘𝑘𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 𝐸𝐸 0 = 𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚
𝑘𝑘𝑟𝑟 + 𝑘𝑘𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 𝐾𝐾𝑀𝑀 + 𝑆𝑆 0
+ 𝑆𝑆 0
𝑘𝑘𝑓𝑓

𝑆𝑆 0
𝑣𝑣 = 𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚
𝐾𝐾𝑀𝑀 + 𝑆𝑆 0
Costante di Michaelis
𝑘𝑘𝑟𝑟 +𝑘𝑘𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 𝑘𝑘𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐
𝐾𝐾 M= = 𝐾𝐾𝐷𝐷 +
𝑘𝑘𝑓𝑓 𝑘𝑘𝑓𝑓

È la concentrazione di substrato per cui la velocità è la metà di Vmax.

Coincide con la costante di dissociazione se la reazione catalitica è

limitante (𝑘𝑘𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 <<𝑘𝑘𝑓𝑓 )

Numero di turnover
𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚
𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 = 𝑘𝑘𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 𝐸𝐸 0 𝑘𝑘𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 = = numero di turnover
𝐸𝐸 0

È il numero di molecole di prodotto create al secondo per molecola di

enzima, a saturazione.
• Quando S è basso (<< 𝐾𝐾𝑀𝑀), l’equazione è di ordine 1 in S

𝑆𝑆 0 𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 𝑘𝑘𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐
𝑣𝑣 = 𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 ≅ 𝑆𝑆 0 = 𝑆𝑆 0 𝐸𝐸 0
𝐾𝐾𝑀𝑀 + 𝑆𝑆 0 𝐾𝐾𝑀𝑀 𝐾𝐾𝑀𝑀
𝑘𝑘𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐
(costante di specificità) rappresenta l’efficienza enzimatica.
𝐾𝐾𝑀𝑀
Al massimo può essere limitata dalla diffusione. In questo caso, se il substrato è una
piccola molecola, ha un valore 108 -109 M-1s-1.

• Quando S è alto (>> 𝐾𝐾𝑀𝑀), l’equazione è di ordine 0 in S

𝑆𝑆 0
𝑣𝑣 = 𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 ≅ 𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 = 𝑘𝑘𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 𝐸𝐸 0
𝐾𝐾𝑀𝑀 + 𝑆𝑆 0
 𝑆𝑆 0
Linearizzazioni 𝑣𝑣 = 𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚
𝐾𝐾𝑀𝑀 + 𝑆𝑆 0
 𝑆𝑆 0
Linearizzazioni 𝑣𝑣 = 𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚
𝐾𝐾𝑀𝑀 + 𝑆𝑆 0

𝑆𝑆 0
𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 − 𝑣𝑣 = 𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 1−
𝐾𝐾𝑀𝑀 + 𝑆𝑆 0
𝐾𝐾𝑀𝑀 𝐾𝐾𝑀𝑀
= 𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 = 𝑣𝑣
𝐾𝐾𝑀𝑀 + 𝑆𝑆 0 𝑆𝑆 0

𝑣𝑣 1
= 𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 − 𝑣𝑣
𝑆𝑆 0 𝐾𝐾𝑀𝑀
L’anidrasi carbonica (CA), localizzata negli
eritrociti, è un enzima contenente zinco avente
il ruolo di catalizzare reversibilmente
l’idratazione dell’anidride carbonica:
CO2+ H2O → H2CO3
La CA è attiva anche come esterasi verso diversi
substrati, tra cui l’acetato di p-nitrofenile (PNFA)

PNFA + OH- → PNFO-+ CH3COOH

NO2 O COCH3 + OH- → NO2 O- + CH3COOH

Ricorda qualcosa???

Stavolta lavoreremo a pH 8, in modo da ridurre la velocità di reazione spontanea.

NO2 O COCH3 NO2 O-

- ε R (403 nm) =
R P −1 −1
= 0 M cm
A

ε P (403 nm) =
−

= 18500 M −1cm −1
(Clin. Chem. 1980 26: 724)

(Eur. J. Biochem. 1974 41: 263)

• Soluzioni: tampone TRIS 0.1 M a pH 8.0; soluzione
di CAB: 5.5 mg in 25 ml di TRIS (soluzione A);
soluzione di PNFA: 36 mg in 5 ml di CH3CN (
soluzione B ); seconda soluzione di PNFA: 5 mg in 5
ml di CH3CN ( soluzione C ); terza soluzione di
PNFA: 3 mg in 5 ml di CH3CN ( soluzione D ).
• Le misure spettrofotometriche a 400 nm si
eseguono in celle di poli(metilmetacrilato) (PMMA);
la lettura a 280 nm si fa in cella di quarzo ottico.
Misura della concentrazione di CAB:
• La concentrazione di CAB nella soluzione A si
misura leggendo l’assorbanza della soluzione A a
280 nm in cella di quarzo da 1 cm (con TRIS nella
cella di riferimento). Per la CAB il valore del
coefficiente di estinzione molare a 280 nm è
εCAB,280= 54000 M-1cm-1.
Misure di v0 in stato stazionario:
• In cella di PMMA da 1 cm si pongono 0.6 ml di soluzione A +
1.9 ml di TRIS. Si termostata a 25° C per 3 minuti. Si
iniettano x μl di soluzione B, si agita e si segue l’assorbanza a
400 nm per 60 secondi, campionando ogni 0.1 sec (con TRIS
nella cella di riferimento).
• Eseguire i seguenti esperimenti cinetici:
• x = 10, 20, 30, 50, 75, 100, 150, 200 μl.
•
Misure di v0 per sottrazione dell’effetto di catalisi basica:
• In cella di PMMA da 1 cm si pongono 2.5 ml di TRIS. Si
termostata a 25° C per 3 minuti. Si iniettano x μl di soluzione
B, si agita e si segue l’assorbanza a 400 nm per 120 secondi,
campionando ogni 0.1 sec (con TRIS nella cella di
riferimento).
• Eseguire i seguenti esperimenti cinetici:
• x = 10, 20, 30, 50, 75, 100, 150, 200 μl.
• Si valuti l’assorbanza nei primi 20 secondi di reazione.
Calcolare la velocità iniziale come

• Calcolare la velocità iniziale per gli esperimenti eseguiti

in presenza di enzima, e per gli esperimenti eseguiti
con il solo tampone. Determinare quindi la velocità
iniziale della reazione catalizzata dalla CAB al netto
della catalisi basica:

• Riportare in grafico v0 in funzione di [PNFA]0 (curva di

saturazione). Dal fit dei dati determinare kcat e KM