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Fluorescenza risolta nel tempo

Cos’è il tempo di vita di fluorescenza?


Il decadimento allo stato fondamentale è casuale.
Ogni molecola emette un fotone.
1

0.8

0.6

I(t)
τ=1/e=37%
0.4

0.2

0
0 500 1000
Verde=molecole eccitate time, ps
Bianco=molecole nello stato fondamentale
Tempo di vita dello stato eccitato
t
− 1
F (t ) = F (0)e τ τ=
kr + knr
1 ns = 10-9 s

1 ns : 1s = 1s : 32 anni
Perché misurare i tempi?
• Estrema sensibilità all’ambiente (knr)
– ANS: 0.1 ns in acqua, 10 ns legato ad una
proteina

– Bromuro d’etidio: 1.8 ns in acqua, 22 ns


legato al DNA

– Trp in diverse proteine varia da 0.1 a 8 ns.


Però…
kr 1
Φ= τ= Φ = krτ
kr + knr kr + knr
0.6

T=84 K
0.4
Resa quantica

0.2

T=298 K
0
0 0.5 1 1.5 2
τ (ns)
Campione eterogeneo
• Consideriamo un campione in cui sono presenti due
(o più) specie diverse della molecola da analizzare in
cui lo stesso fluoroforo ha knr diverse.
– Conformazioni
– Fasi
– Monomero-aggregato Specie
– Libero-legato diverse
– Ecc.

knr
diverse
k1nr k2nr
Campione eterogeneo
resa quantica
fotoni emessi
Φ= =
fotoni assorbiti
(fotoni emessi)1 + (fotoni emessi)2
= =
fotoni assorbiti
(fotoni assorbiti )1 Φ1 + (fotoni assorbiti )2 Φ 2
= =
fotoni assorbiti
(fotoni assorbiti )1 (fotoni assorbiti )2
= Φ1 + Φ2 =
fotoni assorbiti fotoni assorbiti
= α1Φ1 + α 2Φ 2
Campione eterogeneo
resa quantica

Φ = ∑α iΦi
i

α i = frazione di fotoni assorbiti dalla specie i

N.B.:
•l’assorbanza è molto meno sensibile della fluorescenza all’intorno del
cromoforo
•si può assumere ε1= ε2=…= εN
•In tal caso
αi= xi (frazione molare)
Campione eterogeneo: decadimento
N * = N1* + N 2* Non c’è interscambio tra le specie durante lo stato eccitato

dN * dN1* dN 2*
dt
=
dt
+
dt
dN i*
dt
( )
1 *
= − kr + knr N i = − N i
i *
τi
N i* (0 ) (fotoni assorbiti )i
t

N i* (t ) = N i* (0 )e τi
*
= = αi
N ( 0) fotoni assorbiti

t

t
 −t −
t

N * (t ) = N1* (0 )e τ1
+ N 2* (0 )e τ2
= N * (0) α1e τ 1 + α 2e τ 2 
 
 
F (t ) = F1 (t ) + F2 (t ) ∝ kr N1* (t ) + kr N 2* (t )
 −t −
t
 −
t

t

= kr N * (0) α1e τ 1 + α 2e τ 2  ∝ α e τ1 + α e τ 2
  1 2
Campione eterogeneo: decadimento
t

F (t ) = F (0)∑ α i e τi

Posso determinare:
•i singoli τi
(ambiente del
fluoroforo in ciascuna
specie)
•le singole αi
(frazione molare di
ciascuna specie)
Frazioni di intensità
∞ ∞ t ∞ −t

τi τi
Fi ss ∝ ∫ Fi (t )dt = F (0) ∫ α i e dt =F (0)α i ∫ e dt =
0 0 0
∞ −
t

d  τi −
t ∞ 
1 τi
= − F (0)α iτ i ∫ − e dt = − F (0)α iτ i ∫ e dt =
τi dt  
0 0  

 − t

= − F (0)α iτ i e τ i  = F (0)α iτ i
 
 0

α iτ i
fi =
∑α jτ j
j
1
Fluorescence intensity (counts)

Aggregated fraction
3
10

0.5

1
10 0
0 10 Time (ns)
0 5 10
c(µM)

nM Mn
K

Stella et al., Biophys . J. 2004 86: 936–945.


Aggregate in water
Aggregate in membrane
Monomer in water
Monomer in membrane

KP
0.5
Relative population

0.25 KA(water) KA(membrane)

0
0 50 100 [F10] (µM)

Stella et al., Biophys . J. 2004 86: 936–945.


Campione eterogeneo: miscela di fluorofori

t

F (t ) = F (0)∑ α i e τi

NB:
se abbiamo una miscela di fluorofori diversi
•ε 1 ≠ ε 2
•k1r ≠ k2r
•La frazione di fotoni emessi alla λ di osservazione è diversa

αi ≠ xi
αi ≠ frazione di fotoni assorbiti dalla specie i
Miscele di fluorofori
Miscele di fluorofori

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