Laboratorio Professionalizzante

di Spettroscopia

Prof. Lorenzo Stella

Settore 5 Livello 1 Stanza 4
Tel.: 06-7259-4463
E-mail: stella@stc.uniroma2.it
 La luminescenza
Luminescenza: emissione di luce da atomi, molecole o cristalli
eccitati elettronicamente.

Eccitazione luminosa: Eccitazione chimica:

Chemiluminescenza

~ns: ~ms:
fluorescenza fosforescenza
 Spettroscopia di fluorescenza:
Informazioni ottenibili Vantaggi sperimentali
Concentrazione della sonda fluorescente Elevatissima sensibilità
(fluoroforo), fino a nM. (fino alla singola
Ambiente chimico ed accessibilità al molecola).
solvente del fluoroforo. Flessibilità di
campionamento (anche
Dinamica dell’ambiente del fluoroforo. misure “in vivo”).
Dinamica conformazionale e diffusionale Basso costo e semplicità
della (macro)molecola fluorescente (nei ps- della strumentazione.
ns).
Numero e popolazione di specie presenti in
soluzione.
Distanza tra due fluorofori
Alcuni esempi:
•Processi di associazione, transizioni conformazionali, transizioni di
fase, struttura di peptidi, dinamica di proteine, rilascio di farmaci,
sensori e biosensori, pH intracellulare, imaging di cellule, etc. …
Il diagramma di Jablonski

Conseguenze
Stokes shift (spostamento ad energie più basse).
Regola di Kasha (invarianza spettrale con la lunghezza d’onda di eccitazione).
Regola dell’immagine speculare.
Sensibilità alla dinamica.
 Tempo di vita dello stato eccitato
dN *
 (k r  k nr )N *
dt
dN *
*
 (k r  k nr )dt
N
N*
dN * t

* N *  (k r  k nr )  dt
N0 0

kr= costante di decadimento radiativo N * 

ln *  (k r  k nr )t
kn.r.= costante di decadimento attraverso i processi N 0 
non radiativi N*
 e (kr knr )t
*
N*= numero di molecole nello stato eccitato N0
N *  N *0 e (kr knr )t
I  kr N *
t I

I  I 0e 

1
  tempo di vita
kr  knr
t
 Fluorofori

Tutte le molecole assorbono.

In fase condensata (solidi, soluzione) sono
fluorescenti solo molecole con probabilità di
transizione radiativa molto elevata: sistemi ad
elevata coniugazione.
Vantaggio per la sensibilità e la selettività della tecnica.
 Il fluorimetro
Lampada Beam splitter Campione
ecc.

ecc.
Monocromatore Lente
di eccitazione Lente
Monocromatore
Computer di emissione

PMT PMT
“riferimento” “segnale”
 Osservabili: intensità
Dipende da:
Ecc.
Concentrazione di fluoroforo
Efficienza dell’assorbimento di radiazione () Em.
Efficienza dell’emissione radiativa (resa quantica)
fotoni emessi decadimenti radiativi kr
  resa quantica   
fotoni assorbiti totale decadimenti kr  knr
F  fotoni emessi = (fotoni assorbiti)   per A' 1
 (I 0 ' I ')   (I 0 ' I 0 '10A ' )    (1 10A ' ) (1 10A ' )  A'ln10

 d   d ln(10 A ) 
10A  10A 
A 0
  (10 A ) A  1 A  
dA A 0 dA 
e   
A 0
 d  A ln10 
 1 A   e
dA
  1 A   ln10 e A ln10A  0  1 A  ln10
A 0
FF
AA  Cll
C
1 10A  A ln10
Osservabili: intensità e resa quantica
•L’intensità di fluorescenza è una misura relativa, perché
dipende anche da:
•Intensità della lampada
•Efficienza dei monocromatori
•Banda passante utilizzata
•Sensibilità del tubo fotomoltiplicatore
•Ossia dipende dallo strumento con cui è stata determinata

•Al contrario,
•l’assorbanza è una misura assoluta [A=log(I0/I)]
•la resa quantica è una misura assoluta [=kr/(kr+knr)]

FF FF00 FFAA00

 
00  
 
00
AA AA00 AA FF00
 Filtro interno
Ecc. Ecc.

Em. Em.
Campione diluito Campione concentrato

A ( ecc . )

F  I(centro cella )  I0 10 2

0.03

A(  ecc. )  0.03 10 2  0.97
 Assorbanza contro fluorescenza

Inoltre: l’assorbimento è un processo istantaneo, la fluorescenza no

•sensibilità molto maggiore all’ambiente del cromoforo (processi non radiativi)
•Sensibilità alla dinamica.
Osservabili: spettro di emissione
ecc. fissa.
em. variabile.
F in funzione di em..
Rilassamento del solvente
S1
S1’
E Ass.
Em.
h h
S0 S0’

c-Hex DMF EtOH H2O

Esempi
Osservabili: spettro di eccitazione
em. fissa.
ecc. variabile.
F in funzione di ecc..

Se:
unico fluoroforo
 indipendente da ecc.
(unico stato eccitato).
A<<1
Allora F(ecc.) A(ecc.)

•Altrimenti: separazione dei diversi cromofori

 Smorzamento della fluorescenza (quenching)
Alcune molecole (quenchers), se si trovano in prossimità del fluoroforo
eccitato, sono in grado di causare il suo decadimento non radiativo.

Misurando l’efficienza di smorzamento della fluorescenza si può

determinare l’accessibilità del fluoroforo al quencher.

k nr  k nr0  k q [Q]
kr

k r  k nr0  k q [Q]
1 k r  k nr  k q [Q] k r  k nr0 k q
0
1 kq
   [Q]   [Q]
 kr kr kr  0 kr
0  0kq
 1 [Q]  1  K [Q]
 kr
F0
 1 K[Q ]
F
1a Esperienza
Spettri di assorbimento, emissione ed
eccitazione.

Intervallo di dipendenza lineare di F da C.

Solvatocromismo

Processi di associazione
 Il fluoroforo: PRODAN
d = 10 Debye c-Hex DMF EtOH H2O

d = 2.8 Debye

6-propionil-2-(N,N-dimetilammino)naftalene
(PRODAN)
 Le ciclodestrine

•Molecole cicliche formate da unità glucopiranosio (6, 7, 8).

•Si ottengono per conversione enzimatica dell’amido.

 Complessi di inclusione
• La struttura 3-D delle ciclodestrine è a
tronco di cono, con una cavità apolare.
• In soluzione acquosa formano complessi di
inclusione con molecole idrofobe.
• Questa proprietà viene utilizzata per
modificare le proprietà della molecola
ospite:
– solubilità
– volatilità
– tossicità
– resistenza alla biodegradazione.
• I complessi di inclusione hanno inoltre
molteplici applicazioni in campo catalitico
e separativo.
• Poiché la ciclodestrina è chirale, i
complessi di inclusione sono
enantioselettivi.
 Complessazione
ciclodestrina-PRODAN
15

10

F-F0
5

0
0 20 40 60 80 100 120
[-CD] (mM)

Applicazione: sensori a fluorescenza.