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Analisi della Diffusione Dinamica di Luce

Federico Amato
March 24, 2019

Abstract
La diffusione dinamica di luce (DLS) è una tecnica spettroscopica utile nello studio di macro-
molecole in soluzione, che permette di calcolare il coefficiente di diffusione della specie e di
conseguenza il raggio idrodinamico di queste.

1 Introduzione
La diffusione dinamica segue il modello di diffusione di Rayleigh, che prevede l’eccitazione da parte
di una radiazione elettromagnetica di particelle piccole rispetto alla lunghezza d’onda di questa.
Un semplice modello di un campione di particelle puntiformi monodisperse in soluzione mostra che
l’intensità luminosa diffusa dai dipoli molecolari del campione eccitati è proporzionale alla massa
e alla concentrazione di questi e inversamente proporzionale alla quarta potenza della lunghezza
d’onda incidente:
2
4π 2 sin2 χCM

∂n
< IS >= (1)
λ40 R2 NA ∂C 0

Sono incluse nella (1) anche le dipendenze dalla posizione del detector: l’angolo χ alla oscillazione
del dipolo e la distanza R da cui si raccoglie il segnale diffuso, e inoltre vi appare la dipendenza dalla
variazione dell’indice di rifrazione con la concentrazione.
Tale intensità diffusa varierà nel tempo nonostante la coerenza del segnale incidente a causa del
moto Browniano delle particelle, che è legato al coefficiente di diffusione delle particelle DT :
kB T
DT = (2)
6πηah
dove η è il coefficiente di viscosità e ah è il raggio idrodinamico.
Questa variazione può essere espressa in termini della funzione di correlazione G(1) (τ ) del campo
elettrico diffuso ES (t), normalizzata:

G(1) (τ )
g (1) (τ ) = =< ES∗ (t)ES (t + τ ) > / < E 2 (t) > (3)
<I>
Se si suppone che il campione irradiato sia polidisperso e composto da piccoli corpuscoli isotropi,
centri di scattering, la funzione di correlazione normalizzata potrà anche essere espressa come un
decadimento esponenziale modulato da una certa distribuzione normalizzata Q(Γ) della costante di
decadimento:
Z ∞
(1)
|g (τ )| = Q(Γ)e−Γτ dΓ (4)
0
2 2
dove Γ = DT q e q è il modulo quadro del vettore di scattering, che ragionamenti geometrici
portano a definire come:
 
4πn θ
|→

q|= sin (5)
λ0 2
Infine, poiché sperimentalmente si ha accesso all’intensità I di radiazione diffusa e non al campo
elettrico, si potrà misurare la funzione di correlazione di questa:

G(1) (τ ) < IS∗ (t)IS (t + τ ) >


g (2) (τ ) = 2
= (6)
<I> < I >2

1
Sotto l’ipotesi che il campo elettrico sia una variabile casuale normalmente distribuita, vale la
relazione di Siegert tra la funzione di correlazione del campo elettrico e dell’intensità, che adattata
ai dati sperimentali può esprimersi come:

g (2) (τ ) = B + β|g (1) (τ )|2 (7)


dove B è la baseline calcolata dall’autocorrelatore, che dovrebbe oscillare attorno l’unità, e β
è un fattore correttivo che dipende dai limiti temporali e spaziali dell’esperimento ed è trattato
come un parametro strumentale da ricavare dai dati. Da questa relazione si potrà quindi ricavare il
coefficiente di diffusione delle particelle in soluzione.
In questo esperimento si è studiato il funzionamento della diffusione dinamica di luce con un sem-
plice campione di macromolecole di polistirene (PLS) in soluzione. Il PLS è un campione monodis-
perso, per cui la funzione di correlazione del campo elettrico sarà:
2
|g (1) (τ )| = e−DT q τ
(8)
Misurando l’intensità di luce diffusa per un certo numero di angoli si otterrà il coefficiente di
diffusione e il raggio idrodinamico delle molecole di PLS.

2 Strumentazione
Lo schema del sistema sperimentale è rappresentato in Figura 1. Un fascio laser di radiazione
monocromatica, di lunghezza d’onda 532nm viene fatto incidere sul campione in una soluzione
di buffer fosfato, contenuto in una cuvette sulla quale superficie esterna scorre olio in modo da
eliminare la variazione di coefficiente di rifrazione all’interfaccia tra il campione e l’esterno. Un
braccio meccanico connesso a un goniometro permette di ruotare il detector attorno il campione.
La raccolta dei dati è affidata all’Autocorrelatore Digitale Brookhaven BI-9000AT e al software
annesso, che fornisce un file di dati con varie informazioni sulle misurazioni, oltre alle misurazioni
stesse della funzione di correlazione in funzione del tempo: il conteggio medio di fotoni, il numero di
campionamenti e il tempo di campionamento, l’angolo a cui è impostato il goniometro e la baseline
calcolata. I dati sono poi analizzati tramite il software grafico xmgrace.

Figure 1: Lo schema mostra l’apparato sperimentale, composto da un laser che fa incidere


radiazione elettromagnetica sul campione, posto in una cuvette bagnata da olio, in modo da
eliminare la variazione di coefficiente di rifrazione all’interfaccia tra il campione e l’esterno.
La luce diffusa a ogni angolo viene quindi raccolta, attraverso un pinhole, dall’autocorrelatore,
collegato al software.

3 Preparazione del campione


La prima fase dell’esperimento consiste nella preparazione del tampone che ospiterà il campione
di PLS. Si sceglie di utilizzare un buffer fosfato 10 mM in N aH2 P O4 e N a2 HP O4 e 100 mM in
N aCl. I sali vengono pesati e aggiunti in un pallone da 1 litro, portato a volume con acqua purificata
super Milli-Q. Prima di riempire completamente il pallone, se ne misura il PH tramite PH-metro,

2
precedentemente tarato con soluzioni campione, in modo da effettuare eventuali correzzioni nelle
quantità di elementi disciolti. La Tabella 1 riporta le masse degli elementi che compongono il buffer.

Elemento Peso molecolare Molarità Quantità in soluzione

N aH2 P O4 141.96 g/mol 10 mM 0.228 g


N a2 HP O4 119.98 g/mol 10 mM 1.150 g
N aCl 58.44 g/mol 100 mM 5.844 g

Table 1: Sostanze disciolte in 1l di soluzione acquosa nella preparazione del buffer per il
campione di PLS.

Il buffer viene quindi filtrato per eliminare polveri tramite una pompa a vuoto in due contenitori
da 0.5l, siglati e conservati in un refrigeratore.
Si preparano due campioni di PLS, il primo diluito 100 volte in 1.2ml di soluzione e il secondo
diluito 1000 volte. Le soluzioni vengono filtrate direttamente in due cuvette di quarzo tramite una
siringa e un filtro da 800nm, ancora per evitare residui di polvere.

4 Scattering dinamico
I due campioni di PLS vengono inseriti nell’apposito alloggio e se ne misura lo scattering a 90 gradi
per osservare la dipendenza dello scattering dalla concentrazione: il primo campione, più concentrato,
produce un conteggio di fotoni molto più elevato del secondo campione, eccedendo anche il limite
di sicurezza della macchina, e presenta effetti di scattering multiplo. Tale scattering multiplo porta
a risultati non linearmente dipendenti dalla concentrazione, come si verifica osservando lo stesso
scattering con diverse concentrazioni più basse. L’analisi è pertanto condotta solo sul secondo
campione, con diluizione di 1:1000.
L’apparato viene tarato effettuando misure di dark current chiudendo il pinhole di ingresso.
Si raccolgono quindi misure di intensità a 17 angoli, corrispondenti ad altrettanti vettori di
scattering, con un tempo di campionamento di 5 minuti, nel quale il macchinario costruisce la
funzione di correlazione dell’intensità g (2) , legata a quella del campo elettrico g (1) tramite la (6).
Infine si ripetono le misure agli stessi angoli col buffer puro e col toluene, in modo da poter
effettuare una blanck correction dei dati.
I dati vengono normalizzati rispetto alla baseline calcolata e al coefficiente β, ottenuto tramite
una regressione lineare sui dati per tempi di correlazione piccoli. I primi punti, molto oscillanti, si
riferiscono a tempi di correlazione troppo piccoli per avere buona precisione e sono esclusi.
Si assume che il campione abbia una bassa polidispersività, che sarà trattata come un’incertezza
sul coefficiente di decadimento, e verranno trascurati i momenti di ordine superiore al secondo.
Inoltre si può osservare dal Grafico 2 la presenza di una seconda specie di dimensioni maggiori,
con tempi di rilassamento superiori: assumendo che questa seconda specie abbia un decadimento
trascurabile porta a una baseline residua a tempi alti. Si può quindi considerare la funzione di
correlazione del campo elettrico come:
µ1 2
g (1) (τ ) = (A1 )exp(−Γτ )(1 + τ ) + (A2 ) =
2 (9)
µ1 2
= (1 − A2 )exp(−Γτ )(1 + τ ) + (A2 )
2
Le funzioni sono quindi analizzate tramite un fit non lineare in modo da ricavare i parametri di
interesse Γ e µ2 .
Il decadimento è legato al vettore di scattering: rappresentando in Grafico 4 i dati in funzione
di Γτ le curve tendono quindi a sovrapporsi. Le curve che più si discostano dal gruppo sono quelle
che portano meno informazioni: per angoli troppo piccoli o troppo grandi la baseline è più alta,
cioè la presenza della seconda specie è più influente ed è maggiore la dispersione del coefficiente Γ
del campione, ottenuta dal secondo momento µ2 che non si potrà considerare indipendente dalla
presenza di questa specie.
I risultati ottenuti, riportati in Tabella 2, sono rappresentati in funzione dei vettori di scattering
al quadrato q 2 dei relativi set, calcolati secondo l’equazione 5. Dalla relazione lineare che lega Γ a
q 2 si ricava il coefficiente di diffusione DT .

3
Figure 2: Il grafico riporta tutti i set di dati raccolti, corrispondenti a 17 funzioni di corre-
lazione dell’intensità nel tempo, ognuno prodotto dallo scattering del campione a diversi angoli,
interpolati dalle rispettive funzioni di fit ottenute dalla 9. I dati sono normalizzati rispetto
la baseline calcolata e al coefficiente β. Per tempi bassi i punti oscillano attorno l’unità a
causa della bassa precisione dell’autocorrelatore in questo range; per tempi alti le funzioni non
raggiungono esattamente lo zero ma si nota la presenza di una baseline ”parassita” causata
dalla presenza di una seconda specie di dimensioni maggiori.

4
Figure 3: Il grafico mostra i dati della funzione di correlazione in funzione del tempo di
decadimento per il coefficiente medio di decadimento ottenuto dal fit non lineare. Qui si può
apprezzare meglio come il decadimento sia della stessa natura per tutti i set, tranne per uno
che si discosta evidentemente dal gruppo. In realtà i set di dati raccolti per angoli di scattering
sia piccoli che grandi presentano tutti una baseline più elevata che lascia presumere una minor
precisione di questi nel ricavare grandezze d’interesse per il sistema.

q 2 [µm−1 ] Γ[s−1 ] sigma2Γ [s−1 ]


46.696791 0.00211618 4.27147e-06
58.339673 0.00346201 1.2801e-05
62.490350 0.000107528 9.56342e-09
85.208822 0.000168669 1.57331e-08
95.187233 0.000219894 5.42888e-08
128.018462 0.000312737 6.23116e-08
145.980140 0.000278787 7.29276e-08
152.184541 0.000459935 2.89103e-07
205.451151 0.000525283 3.47166e-07
226.955691 0.000557158 3.62014e-07
303.665258 0.000581148 4.645e-08
336.143380 0.000787243 4.91347e-08
454.972028 0.000942337 2.11308e-07
489.713522 0.00113668 6.10715e-07
498.412157 0.00132364 5e-07
668.883622 0.00154449 1.93528e-06
850.857699 0.00155199 1.88834e-06

Table 2: Risultati ottenuti tramite fit non lineari delle funzioni di correlazione del coefficiente
di decadimento Γ, ciascuno ottenuto per un certo vettore di scattering q

5
Figure 4: Il grafico mostra la regressione lineare effettuata sui coefficienti di decadimento in
funzione del quadrato del vettore di scattering. I dati evidentemente discordanti dalla linearità
sono quelli ottenuti per angoli più bassi o più alti, indicati con cerchi dal contorno rosso: questi
sono anche quelli caratterizzati da una maggiore semidispersione, che poiché è assunta come
parametro di incertezza nel fit li rende poco significativi: la retta rossa tratteggiata è ottenuta
con un fit lineare pesato su tutti i dati, mentre quella verde tiene in considerazione sono quelli
più precisi, indicati da cerchi neri, e di fatto le rette sono quasi indistinguibili. Sono indicati
in legenda i raggi idrodinamici calcolati dal coefficiente angolare, essendo questo DT , tramite
l’equazione 2.

Dal coefficiente di diffusione si ricava quindi il raggio idrodinamico RH delle sfere di PLS. Con-
siderando o meno i punti più estremi, con errore maggiore, i risultati sono concordi per più del 99%,
ma naturalmente l’esclusione di questi porta a un coefficiente di correlazione molto maggiore, per
cui verrà considerato questo risultato:

RH = 1.06095nm

5 Conclusioni
Si è svolta qui una parziale esplorazione delle potenzialità della diffusione di luce che ha permesso di
ricavare delle dimensioni tipiche del campione in esame. Affiancando questi risultati a quelli ottenuti
dallo scattering statico delle particelle, che attraverso la frazione di intensità luminosa diffusa a vari
angoli permette di trovare il Raggio di girazione e ottenere informazioni sul Coefficiente di forma,
si può dare con buona precisione una descrizione completa di particelle, anche nanometriche, in
soluzione.