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Spettroscopia

La spettroscopia analizza la struttura e le proprietà della materia attraverso


l’interazione della stessa con la radiazione elettromagnetica
La radiazione elettromagnetica è generata da una sorgente ed ha una doppia natura:
ondulatoria e corpuscolare (fotone)

ed è definita dalla energia ad essa associata calcolata attraverso l’equazione di Planck

E = hn

h= costante di Planck
n = frequenza (numero di vibrazioni nell’unità di tempo) in hertz

n = c/λ

c= velocità di propagazione che dipende dal mezzo attraversato

λ = lunghezza d’onda (distanza tra due punti massimi dell’onda)


Le radiazioni elettromagnetiche possono essere ordinate secondo livelli di energia e di

lunghezza d’onda e raggruppate in campi o spettri


Cosa succede quando una radiazione elettromagnetica od uno spettro di
radiazioni colpisce la materia?

un fascio di luce bianca che colpisce


un prisma viene scomposto nelle
singole radiazioni costituenti
Fenomeni di Assorbimento o di Emissione

Fenomeni di Assorbimento

Nei fenomeni di assorbimento, la materia (atomi o molecole) assorbono radiazioni


di opportuna lunghezza d’onda e lo spettro rilasciato manca delle radiazioni
assorbite, questo assorbimento è misurato dalla spettrofotometria

Spettro di assorbimento
Fenomeni di Emissione

Nei fenomeni di emissione viene invece misurata l’intensità della


radiazione o dello spettro di radiazioni emesse, tale spettro è misurato
nella spettrofluorimetria

Spettro di emissione
Ogni sostanza, quando colpita da una radiazione elettromagnetica o da uno
spettro di radiazioni specifico, ha un suo caratteristico spettro di assorbimento
o di emissione, pertanto attraverso la loro identificazione non solo è possibile
individuare una sostanza all’ interno di un campione biologico ma anche
misurarne la quantità
Per effettuareSpettrofotometria
analisi qualitative si fa uso di raggi policromatici a spettro contin
monocromatiche di tale raggio si fanno passare, una alla volta, attraverso la sos
Ogni molecola ha assorbirà
quindiin modo diverso, cioè con
un caratteristico diversa di
spettro intensità, le diverse che
assorbimento radiazioni.
ne
Riportando perciò in un grafico i valori registrati di assorbimento in funzione de
permette l’ analisiottiene
qualitativa e quantitativa,
lo spettro lo spettro
di assorbimento di assorbimento
della sostanza esaminata. è tipico di

ciascuna sostanza

Proprietà degli α-amminoacidi: Assorbimento della luce

DNA l'esame di
Per il fatto che ogni sostanza ha3 il suo spettro di assorbimento,
identificare una sostanza (per confronto diretto con campioni PROT
noti o tramite ba
controllarne il grado di purezza.
2

1
Appositi dispositivi sono in grado di misurare l'intensità del flusso luminoso ed in particolare:
• I0 : intensità del flusso luminoso all'ingresso della cella con il campione;
Nel lavoro analitico di routine le regioni dello spettro dell’ultravioletto e del visibile sono le più utilizzate.
• I : intensità del flusso luminoso all'uscita della cella con il campione.

I0= intensità della radiazione incidente

I = intensità della radiazione trasmessa

T = trasmittanza T=I/I0

Una sostanza con trasmittanza pari a 1 non assorbe fotoni ed è trasparente, mentre una sostanza con

T pari a 0 è opaca ed assorbe tutta la radiazione.

Per valori intermedi si può parlare di assorbanza o estinzione detta anche densità ottica (optical

density)
Assorbanza o Optical Density

A= -logT = log//I0
Legge di Lambert-Beer

• La legge di Lambert-Beer mette in relazione l’assorbanza con la concentrazione di un analita in


soluzione.
• L’assorbanza di un analita in soluzione dipende non solo dalla natura dell’analita ma anche dalla sua
concentrazione e dalla quantità assoluta dell’analita assorbente.

A = (εl). c . l

εl= il coefficiente di estizione molare della sostanza che assorbe la radiazione di lunghezza d’onda l,
c= la concentrazione molare della soluzione che assorbe la radiazione
l è il cammino ottico, cioè lo spessore di materia attraversato dalla radiazione.

• Il coefficiente di estinzione molare εl rappresenta l’assorbanza di una soluzione 1M (molare) di un


composto puro in condizioni standard di solvente, temperatura e lunghezza d'onda di radiazione
elettromagnetica incidente. Il coefficiente di estinzione molare è specifico di ciascuna sostanza
Secondo la legge di Lambert-Beer l’assorbanza è direttamente proporzionale sia alla
concentrazione della sostanza assorbente sia allo spessore dello strato di analita

attraversato (quantità assoluta). Dalla misura dell’assorbanza di una sostanza si può quindi
risalire alla sua quantità in un campione biologico

Assorbanza

A = (εl). c . l

da cui

C = A/(εl) . l

Concentrazione
Limiti di applicabilità della legge di Lambert-Beer

La legge si applica quando si conosce


• il coefficiente di estinzione molare dell’analita in esame
• il cammino ottico.

• Il principale limite di applicabilità è rappresentato da concentrazioni


particolarmente alte di analita che creano dimeri, polimeri, aggregati e
modificazioni dell’indice di rifrazione della soluzione. Ciò genera deviazioni
positive o negative dalla relazione di linearità tra assorbanza e concentrazione

C
La lunghezza d’onda della radiazione incidente selezionata deve essere quella che permette
l’assorbimento massimo

La lunghezza d’ onda della radiazione incidente


deve essere tale da garantire il massimo
assorbimento in quanto se ci si scosta dal valore
di lunghezza d’ onda ottimale possono verificarsi
errori di assorbanza anche molto grandi
In alternativa si usa il metodo della curva standard o di taratura.

1.0

Assorbanza
0.8

0.6

0.4

0.2

0.1 0.2 0.4 0.6 0.8


Conc. nota mg/ml
0,48 mg/ml conc. dell’analita
Quando si usano le curve di taratura è indispensabile interpolare i dati solo nei
tratti del grafico che seguono un andamento lineare e non curvo, nei tratti non
lineari la legge di Lambert-Beer non è rispettata
• L’analisi spettrofotometrica può essere condotta sia nel visibile che nell’ uv su sostanze
che nel loro stato naturale hanno un loro spettro di assorbimento.

• Ciò che conferisce la capacità di assorbimento è la presenza di specifici gruppi chimici


detti cromofori come doppi o tripli legami e doppietti elettronici liberi

C C C N N N
C C C O N O
C S

• Gli elettroni coinvolti in legami doppi e tripli di molecole organiche (legami π) sono
legati più debolmente e sono perciò più facilmente eccitabili
Sistemi aromatici
in genere (effetto
• L’aumento di doppi legami aumenta la lunghezza d’onda di assorbimento
batocromico)
• La diminuzione di doppi legami riduce la lunghezza d’onda di assorbimento (effetto

ipsocromico)
Fattori che influenzano il valore di lmax

Effetto batocromico (red shift): spostamento della λmax verso valori più alti (frequenza
minore ed energia più basse)
Possibili cause
-solvente: polarità
coniugazione con altri cromofori
-sostituenti iper-coniugazione
coniugazione con auxocromi

la coniugazione con un cromoforo comporta generalmente un aumento sia di lunghezza


d’onda max che di coefficiente di estinzione molare

Auxocromi: gruppi funzionali saturi con doppietti elettronici di non legame

Effetto ipsocromico (blue shift): opposto al precedente e causato dal solvente o da


interruzione della coniugazione con un gruppo cromoforo o auxocromico
In chimica analitica può succedere che le sostanze da analizzare non siano in grado di

foto-assorbire opportunamente ed è quindi necessario convertire la sostanza da

analizzare in un’ altra in grado di foto-assorbire grazie alla formazione o all’ aggiunta di

opportuni gruppi cromofori.

Tali reazioni devono essere fortemente standardizzate e riproducibili

Tecniche spettroscopiche: esempio di reazione end-point


Glucosio ossidasi
end-point enzimatiche
glucosio+H2O+O2→Ac. Gluconico +H2O2
Perossidasi
ome reattivo un enzima che ha come substrato proprio l’analita da dosare; a partire
H2O2+accettore
eazione si sviluppa, al termine del dosaggio,
ossigeno→cromogeno + H2O
un prodotto colorato, direttamente o in
azioni successive.

muni analiti dosati con queste metodiche vi sono:

lucosio ossidasi)
o (colesterolo esterasi)
(lipoproteinlipasi-GPO)

lucosio: reazione enzimatica end-point; lettura finale a 510 nm


In questi casi la determinazione della assorbanza, può essere eseguita:

-al termine della reazione di produzione del cromoforo


-prima del termine della reazione di formazione del cromoforo
-costruzione di una curva cinetica

Costruzione di una curva cinetica; in questo caso si valuta la variazione di assorbanza


in funzione del tempo, se l’andamento della reazione cinetica è rettilineo (reazione di
primo ordine) l’angolo formato tra la retta e l’asse dei tempi è direttamente
proporzionale alla concentrazione dell’analita. Tale metodo è molto in uso nella
determinazione delle attività enzimatiche nei liquidi biologici dove la reazione catalizzata
porta alla formazione di un composto in grado di assorbire nel visibile o nel’ UV (NAD o
NADP)

V=tga=Kc
assorbanza

tempo
Apparecchi utilizzati nella spettrofotometria di assorbimento

• Fotometri o colorimetri (uso: spettri del visibile, le radiazioni incidenti sono opportunamente
selezionate)
• Spettrofotometri (uso: dall’ ultravioletto all’infrarosso)

Nel fotometro o colorimetro abbiamo:


-Sorgente luminosa (bianca)
-Selettore di lunghezza d’onda (filtri colorati)
-Cella di lettura (cuvetta di vetro o plastica con superfici liscie e cammino ottico definito)
-Fotorivelatore
-Volmetro (che converte le misure elettriche in assorbanza)

Nello spettrofotometro
-Sorgente luminosa (luce bianca nel visibile e lampade al deuterio o idrogeno per
l’ultravioletto)
-Selettore di lunghezza d’onda (monocromatore, permette di selezionare le radiazioni in
maniera precisa ed individuale, è costituito da prismi di quarzo o da reticoli)
-Cella di lettura (cuvetta di quarzo con cammino ottico noto)
-Fotorivelatore
-Volmetro (che converte le misure elettriche in valori di assorbanza)
Spettrofotometro a singolo e doppio raggio

Singolo raggio

Doppio raggio
Turbidimetria e Nefelometria

La spettrofotometria può essere utilizzata anche quando l’analita di interesse è presente


sotto forma di particelle solide disperse in una sospensione semplice o colloidale. In questi
casi la radiazione incidente subisce dei fenomeni che non sono solo di assorbimento ma
anche di diffusione (riflessione, rifrazione, diffrazione).

Turbidimetria
Quando le particelle hanno dimensioni nell’ordine del μ i fenomeni di assorbimento
prevalgono sui fenomeni di diffusione. In questi casi la legge di Lambert e Beer presenta
ancora una relazione sufficientemente lineare tra l’assorbimento e la concentrazione della
Turbidimetria
sostanza in sospensione. Condizione necessaria è la stabilità della sospensione e l’ assenza di
precipitazione.
Nefelometria

Quando invece le particelle sospese hanno dimensioni inferiori al μ, e quindi sono


nell’ordine del nanometro il fenomeno di diffusione è molto più intenso e la misura
diventa di tipo nefelometrico.

In questi casi la misurazione sfrutta il fenomeno di diffusione secondo Tyndall ma la


sospensione deve essere molto diluita perchè le particelle possono assorbire la luce
diffusa impedendone la misurazione.

Anche in questo caso la legge di Lambert e Beer è applicabile entro certi limiti di
concentrazione in quando la diffusione è direttamente proporzionale alla concentrazione
della sospensione.
L’effetto Tyndall e’ un fenomeno di diffusione della luce che comporta una deviazione del
raggio incidente di 90°, pertanto il rilevatore deve essere posto a 90° rispetto al
Misura della diffusione della luce dalla sospensione in una direzione a 90°
campione.
rispetto a quella della radiazione incidente (fotometri o spettrofotometri):

La legge di Rayleigh lega l’intensita’ della luce diffusa al numero di particelle presenti in
Presenta elevati livelli di sensibilità e, opportunamente standardizzata, può
sospensione:
essere anche molto precisa.
N V2
I= K Io
d 2 λ4

dove
I = intensità della luce diffusa;
K = costante di proporzionalità;
N = numero di particelle per unità di volume;
V = volume delle particelle;
d = distanza del rivelatore dalla cella contenente l'analita;
λ = lunghezza d'onda del raggio di luce incidente;
I0 = intensità del raggio di luce incidente.
Lavorando con un determinato strumento e in condizioni sperimentali tali da mantenere
costante il volume V delle particelle e l'intensità I0 del raggio incidente, il secondo
membro dell'equazione precedente permette di raggruppare tutti i termini considerabili
costanti, introducendo una nuova costante globale K:
Nefelometria
I=KN
dove l’intensità della luce diffusa è direttamente proporzionale al numero di particelle sospese
Fluorimetria

• La fluorimetria permette di identificare e quantizzare un analita in soluzione misurando la

quantità di radiazione elettromagnetica emessa in seguito all’assorbimento di una

radiazione elettromagnetica di specifica lunghezza d’onda.

• Nella fluorimetria viene misurata la radiazione emessa anziché quella assorbita dall’analita

(fotometria). Nella fluorimetria la lunghezza d’onda della radiazione assorbita (energia

maggiore) è sempre minore della lunghezza d’onda della radiazione emessa (energia

minore).

• La differenza tra i due livelli energetici è detta spostamento di Stokes.

• In fluorimetria le misurazioni più attendibili si ottengono nel caso di composti che

presentano spostamenti di Stokes molto grandi

• Un fenomeno associato alla fluorescenza è la fosforescenza, in questo caso l’ emissione ha

tempi di decadimento maggiori e permane anche quando non è più applicata l’eccitazione

• Le sostanze fluorescenti in genere contengono anelli aromatici e sostituenti tipo -OH, -

NH2, -Or, -NHR, -NR2.


In una soluzione diluita la relazione tra l’emissione e la concentrazione dell’analita in

soluzione è data dalla relazione:

F=2.3IoεlcdQ

F=intensità della radiazione fluorescente (emessa)


Io=intensità della radiazione incidente
εl =coefficiente di assorbimento molare ad una specifica lunghezza d’onda
d=cammino ottico
c=concentrazione della sostanza
Q= efficienza quantica ed è indipendente dalla lunghezza d’onda di eccitazione

OVVERO: la concentrazione è direttamente proporzionale alla intensità di


fluorescenza
La fluorimetria è più sensibile della fotometria di assorbimento per la determinazione di
analiti diluiti.

Questo a causa del cosidetto fenomeno del quencing o smorzamento.


Il quencing è dovuto al fatto che parte dell’energia di emissione per collisione può essere
trasferita a molecole vicine, tale energia, che possiamo considerare persa, è minore se il
numero di molecole in soluzione è basso e quindi l’analita è diluito.

La fluorimetria è estremamente sensibile al pH, alla temperatura, alla polarità del solvente,
alla sua torbidità, all’adsorbimento di superficie ed alla diffusione della luce per effetto
Raman, Rayleigh e Tyndall.
Per le determinazioni quantitative è sempre necessario allestire una curva di calibrazione con
sostanze a concentrazione nota.
Le procedure di analisi applicabili sono tre:

Metodo diretto: determinazione della fluorescenza di un composto naturalmente fluorescente


(il composto o analita possiede fluorescenza intrinseca)

Metodo indiretto: l’analita non è naturalmente fluorescente ma lo diventa inseguito ad una sua
trasformazione chimica (il composto o analita possiede fluorescenza estrinseca)

Metodo del quencing: in questo caso si sfrutta la capacità dell’analita di ridurre l’emissione di
un fluoroforo naturale.
I fluorimetri e gli spettrofluorimetri sono simili ai fotometri e spettrofotometri, eccetto che
per la presenza di un secondo monocromatore per la rilevazione della radiazione emessa.
Sono costituiti da:
-sorgente luminosa ( lampada allo xenon)
-filtro primario (per i fluorimetri) monocromatore (per spettrofluorimetri)
-cella di lettura in vetro o in quarzo a seconda della emissione
-filtro o monocromatore secondario
-fotorivelatore
La fluorimetria/spettrofluorimetria è utile nella determinazione quantitativa di
sostanze presenti nei campioni in concentrazioni troppo basse per essere rilevate
dalla fotometria/spettrofotometria:

Dosaggio di :
Vitamina B1 negli alimenti
NADH o NADPH (dosaggi enzimatici e cinetici)
Ormoni
Farmaci
Pesticidi
Agenti cancerogeni
Colesterolo
Porfirine
Alcuni ioni metallici