E = hn
h= costante di Planck
n = frequenza (numero di vibrazioni nell’unità di tempo) in hertz
n = c/λ
Fenomeni di Assorbimento
Spettro di assorbimento
Fenomeni di Emissione
Spettro di emissione
Ogni sostanza, quando colpita da una radiazione elettromagnetica o da uno
spettro di radiazioni specifico, ha un suo caratteristico spettro di assorbimento
o di emissione, pertanto attraverso la loro identificazione non solo è possibile
individuare una sostanza all’ interno di un campione biologico ma anche
misurarne la quantità
Per effettuareSpettrofotometria
analisi qualitative si fa uso di raggi policromatici a spettro contin
monocromatiche di tale raggio si fanno passare, una alla volta, attraverso la sos
Ogni molecola ha assorbirà
quindiin modo diverso, cioè con
un caratteristico diversa di
spettro intensità, le diverse che
assorbimento radiazioni.
ne
Riportando perciò in un grafico i valori registrati di assorbimento in funzione de
permette l’ analisiottiene
qualitativa e quantitativa,
lo spettro lo spettro
di assorbimento di assorbimento
della sostanza esaminata. è tipico di
ciascuna sostanza
DNA l'esame di
Per il fatto che ogni sostanza ha3 il suo spettro di assorbimento,
identificare una sostanza (per confronto diretto con campioni PROT
noti o tramite ba
controllarne il grado di purezza.
2
1
Appositi dispositivi sono in grado di misurare l'intensità del flusso luminoso ed in particolare:
• I0 : intensità del flusso luminoso all'ingresso della cella con il campione;
Nel lavoro analitico di routine le regioni dello spettro dell’ultravioletto e del visibile sono le più utilizzate.
• I : intensità del flusso luminoso all'uscita della cella con il campione.
T = trasmittanza T=I/I0
Una sostanza con trasmittanza pari a 1 non assorbe fotoni ed è trasparente, mentre una sostanza con
Per valori intermedi si può parlare di assorbanza o estinzione detta anche densità ottica (optical
density)
Assorbanza o Optical Density
A= -logT = log//I0
Legge di Lambert-Beer
A = (εl). c . l
εl= il coefficiente di estizione molare della sostanza che assorbe la radiazione di lunghezza d’onda l,
c= la concentrazione molare della soluzione che assorbe la radiazione
l è il cammino ottico, cioè lo spessore di materia attraversato dalla radiazione.
attraversato (quantità assoluta). Dalla misura dell’assorbanza di una sostanza si può quindi
risalire alla sua quantità in un campione biologico
Assorbanza
A = (εl). c . l
da cui
C = A/(εl) . l
Concentrazione
Limiti di applicabilità della legge di Lambert-Beer
C
La lunghezza d’onda della radiazione incidente selezionata deve essere quella che permette
l’assorbimento massimo
1.0
Assorbanza
0.8
0.6
0.4
0.2
C C C N N N
C C C O N O
C S
• Gli elettroni coinvolti in legami doppi e tripli di molecole organiche (legami π) sono
legati più debolmente e sono perciò più facilmente eccitabili
Sistemi aromatici
in genere (effetto
• L’aumento di doppi legami aumenta la lunghezza d’onda di assorbimento
batocromico)
• La diminuzione di doppi legami riduce la lunghezza d’onda di assorbimento (effetto
ipsocromico)
Fattori che influenzano il valore di lmax
Effetto batocromico (red shift): spostamento della λmax verso valori più alti (frequenza
minore ed energia più basse)
Possibili cause
-solvente: polarità
coniugazione con altri cromofori
-sostituenti iper-coniugazione
coniugazione con auxocromi
analizzare in un’ altra in grado di foto-assorbire grazie alla formazione o all’ aggiunta di
lucosio ossidasi)
o (colesterolo esterasi)
(lipoproteinlipasi-GPO)
V=tga=Kc
assorbanza
tempo
Apparecchi utilizzati nella spettrofotometria di assorbimento
• Fotometri o colorimetri (uso: spettri del visibile, le radiazioni incidenti sono opportunamente
selezionate)
• Spettrofotometri (uso: dall’ ultravioletto all’infrarosso)
Nello spettrofotometro
-Sorgente luminosa (luce bianca nel visibile e lampade al deuterio o idrogeno per
l’ultravioletto)
-Selettore di lunghezza d’onda (monocromatore, permette di selezionare le radiazioni in
maniera precisa ed individuale, è costituito da prismi di quarzo o da reticoli)
-Cella di lettura (cuvetta di quarzo con cammino ottico noto)
-Fotorivelatore
-Volmetro (che converte le misure elettriche in valori di assorbanza)
Spettrofotometro a singolo e doppio raggio
Singolo raggio
Doppio raggio
Turbidimetria e Nefelometria
Turbidimetria
Quando le particelle hanno dimensioni nell’ordine del μ i fenomeni di assorbimento
prevalgono sui fenomeni di diffusione. In questi casi la legge di Lambert e Beer presenta
ancora una relazione sufficientemente lineare tra l’assorbimento e la concentrazione della
Turbidimetria
sostanza in sospensione. Condizione necessaria è la stabilità della sospensione e l’ assenza di
precipitazione.
Nefelometria
Anche in questo caso la legge di Lambert e Beer è applicabile entro certi limiti di
concentrazione in quando la diffusione è direttamente proporzionale alla concentrazione
della sospensione.
L’effetto Tyndall e’ un fenomeno di diffusione della luce che comporta una deviazione del
raggio incidente di 90°, pertanto il rilevatore deve essere posto a 90° rispetto al
Misura della diffusione della luce dalla sospensione in una direzione a 90°
campione.
rispetto a quella della radiazione incidente (fotometri o spettrofotometri):
La legge di Rayleigh lega l’intensita’ della luce diffusa al numero di particelle presenti in
Presenta elevati livelli di sensibilità e, opportunamente standardizzata, può
sospensione:
essere anche molto precisa.
N V2
I= K Io
d 2 λ4
dove
I = intensità della luce diffusa;
K = costante di proporzionalità;
N = numero di particelle per unità di volume;
V = volume delle particelle;
d = distanza del rivelatore dalla cella contenente l'analita;
λ = lunghezza d'onda del raggio di luce incidente;
I0 = intensità del raggio di luce incidente.
Lavorando con un determinato strumento e in condizioni sperimentali tali da mantenere
costante il volume V delle particelle e l'intensità I0 del raggio incidente, il secondo
membro dell'equazione precedente permette di raggruppare tutti i termini considerabili
costanti, introducendo una nuova costante globale K:
Nefelometria
I=KN
dove l’intensità della luce diffusa è direttamente proporzionale al numero di particelle sospese
Fluorimetria
• Nella fluorimetria viene misurata la radiazione emessa anziché quella assorbita dall’analita
maggiore) è sempre minore della lunghezza d’onda della radiazione emessa (energia
minore).
tempi di decadimento maggiori e permane anche quando non è più applicata l’eccitazione
F=2.3IoεlcdQ
La fluorimetria è estremamente sensibile al pH, alla temperatura, alla polarità del solvente,
alla sua torbidità, all’adsorbimento di superficie ed alla diffusione della luce per effetto
Raman, Rayleigh e Tyndall.
Per le determinazioni quantitative è sempre necessario allestire una curva di calibrazione con
sostanze a concentrazione nota.
Le procedure di analisi applicabili sono tre:
Metodo indiretto: l’analita non è naturalmente fluorescente ma lo diventa inseguito ad una sua
trasformazione chimica (il composto o analita possiede fluorescenza estrinseca)
Metodo del quencing: in questo caso si sfrutta la capacità dell’analita di ridurre l’emissione di
un fluoroforo naturale.
I fluorimetri e gli spettrofluorimetri sono simili ai fotometri e spettrofotometri, eccetto che
per la presenza di un secondo monocromatore per la rilevazione della radiazione emessa.
Sono costituiti da:
-sorgente luminosa ( lampada allo xenon)
-filtro primario (per i fluorimetri) monocromatore (per spettrofluorimetri)
-cella di lettura in vetro o in quarzo a seconda della emissione
-filtro o monocromatore secondario
-fotorivelatore
La fluorimetria/spettrofluorimetria è utile nella determinazione quantitativa di
sostanze presenti nei campioni in concentrazioni troppo basse per essere rilevate
dalla fotometria/spettrofotometria:
Dosaggio di :
Vitamina B1 negli alimenti
NADH o NADPH (dosaggi enzimatici e cinetici)
Ormoni
Farmaci
Pesticidi
Agenti cancerogeni
Colesterolo
Porfirine
Alcuni ioni metallici
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