Lezione 14

METODI STRUMENTALI IN
CHIMICA ANALITICA
Metodi di separazione eterogenei: Elettroforesi Capillare, Frazionamento in

campo flusso, Estrazione e Cromatografia in fase supercritica
Prof. Ilaria Palchetti,
moodle ID: metodi2021 !2
Elettroforesi Capillare
Introduzione alle tecniche elettroforetiche

Principi: velocità degli ioni, forze, mobilità, flusso elettrosmotico, tempo di
migrazione, efficienza e risoluzione
Strumentazione per elettroforesi capillare
Metodi di separazione elettroforetica
!3
Metodi Strumentali in Chimica Analitica, AA 2020-2021

il campione viene caricato su un supporto contenente un tampone di
corsa. Si applica un campo elettrico e quindi gli ioni del tampone di
Elettroforesi corsa iniziano a fluire verso gli elettrodi, producendo una corrente.
Allo stesso tempo gli ioni del campione migreranno verso gli elettrodi
in base alla loro carica e alle loro dimensioni. Approccio adatto a
particelle cariche, ioni piccoli, virus, proteine, ecc.
L’elettroforesi è una tecnica nella

Electro (elettrica) + Phoresis (migrazione)
quale gli analiti vengono separati
sulla base delle loro differenti
velocità di migrazione all’interno di
un campo elettrico.
Tale tecnica di separazione è stata

sviluppata per la prima volta dal
chimico svedese Arne Tiselius
(1902-1971) negli anni ’30 per lo
studio delle proteine nel siero; per
questo lavoro egli fu insignito del
Premio Nobel per la Chimica nel
1948. https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/1948/tiselius/biographical/
!4

Elettroforesi Capillare: Introduzione
L'efficienza di separazione in una

soluzione libera, come nel caso della
tecnica utilizzata da Tiselius, era
limitata dalla diffusione termica e dalla
convezione.
Per questo motivo, tradizionalmente

l'elettroforesi è stata effettuata in
mezzi anti-convettivi, come un gel di
poliacrilamide o gel di agarosio.
I capillari di piccole dimensioni,

avendo una bassa conduttanza,
generano soltanto piccole quantità di
calore e in linea di principio sono anti- Courtesy Agilent Technologies
convettivi.
Capillari per elettroforesi capillare
!5

L'Elettroforesi può essere eseguita su

vari supporti.
Quelli maggiormente utilizzati sono:

https://www.issalute.it/index.php/la-salute-dalla-a-alla-z-menu/a/analisi-cliniche/protidogramma-o-elettroforesi-proteica#risultati
1- Acetato di cellulosa (protidogramma)

L'elettroforesi proteica su acetato di cellulosa, o
2- Elettroforesi su gel
protidogramma costituisce la tecnica più utilizzata in
laboratorio per analizzare la composizione qualitativa e
3- Fase liquida all’interno di capillari: quantitativa delle proteine presenti nei liquidi biologici quali
elettroforesi capillare (CE) siero, urine, liquor (liquido cerebrospinale).
Il protidogramma è usato per identificare la presenza di
proteine anomale, l’assenza di proteine normali e per
determinare se un gruppo di proteine sia presente in
quantità minore, o maggiore, rispetto alla norma.
Permette di separare le proteine in 5 gruppi: albumina, alfa
1, alfa 2, beta e gamma globuline (attualmente molti
laboratori effettuano una separazione in 6 bande, con
separazione delle beta-globuline in due frazioni, beta-1-
globuline e beta-2-globuline).
!6

Supporti e strumentazione per l’Elettroforesi capillare

L’elettroforesi capillare è una versione strumentale dell’elettroforesi, è stata ideata tra
la metà e la fine degli anni ’80 (Jorgenson and Lukacs Clin Chem. 1981 27(9):1551-3)
Schema di un generico sistema di elettroforesi capillare ed ingrandimento di un

capillare.
Courtesy Agilent Technologies
!7

Le estremità di un capillare in silice fusa con foro

di piccolo diametro sono poste in serbatoi di
tampone (il contenuto dei serbatoi è identico a
quello del capillare).
I serbatoi contengono inoltre gli elettrodi utilizzati

p e r re a l i z z a re i l c o n t a t t o e l e t t r i c o t r a
l'alimentatore ad alta tensione e il capillare.
Il campione viene caricato nel capillare

sostituendo uno dei serbatoi (generalmente
quello in corrispondenza dell'anodo) con un
serbatoio di campione e applicando un campo
elettrico oppure una pressione esterna.
Dopo aver riposizionato il contenitore con il

tampone, si applica il campo elettrico e si
ottiene la separazione.
La rivelazione può essere effettuata all'estremità

opposta, in caso di rivelazione ottica
direttamente attraverso la parete del capillare.
!8

Come già accennato, i capillari sono

di piccole dimensioni ed avendo una
bassa conduttanza, generano
soltanto piccole quantità di calore e
in linea di principio sono anti-
convettivi.
Pertanto nell'elettroforesi capillare

l'utilizzo di mezzi gel all’interno dei
capillari non è essenziale.

Diametro interno tipico del capillare
Ciò consente di eseguire l'elettroforesi (d.i.): 25 – 75 µm
in soluzione libera (o capillare) come Lunghezza tipica del capillare: 150 –
1000 mm
anche di utilizzare i tradizionali mezzi
gel nel capillare.
!9

Elettroforesi Capillare: Teoria
Principi generali dell’elettroforesi
L’elettroforesi è la migrazione degli ioni in

soluzione sotto l’influenza di un campo
elettrico (E).
E (V/m) = V/L
Dove V è la differenza di potenziale

applicato, ed L è la distanza tra i due
elettrodi (ossia la lunghezza del sistema
elettroforetico).
Gli ioni migreranno con velocità diverse in

funzione della dimensione e della carica.
Facc = qE
Quando uno ione di carica q (coulomb) è
posto in un campo elettrico E (V/m), la forza
esercitata sullo ione è qE (newton).
Facc= qE
!10

La migrazione di uno ione è soggetta ad un

equilibrio di forze opposte: la forza di
accelerazione Facc, causata dal campo elettrico,
a cui si oppone la forza di attrito viscoso (Fatt).
Fatt = fvef
La viscosità è una proprietà interna di un fluido
che determina resistenza al flusso.
In soluzione, la forza di attrito viscoso è fνef,

dove νef è la velocità dello ione e f è il
f = 6πηr
coefficiente di attrito. Il suffisso ef sta per
elettroforesi.
Per una particella sferica di raggio r (cm)

Fatt = fνef
che si muove attraverso un fluido di
viscosità η (Pa×s=Kg×m -1 ×s -1 ), il
coefficiente di attrito (f) è descritto dalla
legge di Stokes.
!11

velocità elettroforetica e mobilità elettroforetica
+ -
Lo ione raggiunge
+ fνef qE -
+
rapidamente una velocità
stazionaria quando la forza + -
di accelerazione eguaglia
la forza di attrito: + -
Velocità elettroforetica:
µ ef ( cm2 V-1 s-1): Mobilità elettroforetica

q
ν ef = E ≡ µef E
f La mobilità elettroforetica è la costante di proporzionalità
tra la velocità dello ione e la forza del campo elettrico. La
mobilità è direttamente proporzionale alla carica dello ione
e inversamente proporzionale al coefficiente di attrito.
Poiché la mobilità è q/f , maggiore è il raggio, minore la mobilità

!12

La separazione mediante
elettroforesi si basa sulle differenze
di velocità del soluto in un campo
elettrico
v velocità dello ione
La velocità di uno ione può essere
rappresentata dall'equazione µef mobilità elettroforetica
ν = µ ef E E campo elettrico applicato
Il campo elettrico è semplicemente il

rapporto (in volt/cm) tra la tensione
applicata e la lunghezza del capillare.
La mobilità, è una costante
caratteristica di quel particolare ione in
quel particolare mezzo.
!13

• Il valore di µ è costante per determinate condizioni di solvente e

temperatura.
• Il valore di µ dipende dalle dimensioni apparenti della carica del

soluto, come indicato dal rapporto q/r. Quest’ultimo aspetto sta a
significare che qualsiasi coppia di analiti aventi tra di loro un
differente rapporto carica/dimensioni può, in teoria, essere
separata per elettroforesi.
• Per ottenere buone separazioni in elettroforesi è spesso

necessario aggiustare le condizioni utilizzate per modificare la
mobilità elettroforetica di un soluto. Ciò può essere ottenuto
tramite reazioni secondarie che modificano la carica o le
dimensioni apparenti del soluto di interesse.
!14

mobilità elettroforetica effettiva
Nella pratica si prende la mobilità

effettiva, che differisce dalla
mobilità
sperimentalmente.
determinata
µeff = α i ⋅ µe
αi grado di ionizzazione (o
µef dipende fortemente dal pH (cioè,
dal pKa del soluto) e dalla
dissociazione)
composizione del tampone di
analisi.
!15

Flusso elettrosmotico
Un componente fondamentale per il

funzionamento di un sistema CE è il flusso
elettrosmotico (EOF).
Costituisce il flusso principale di liquido nel

capillare ed è conseguenza della carica
superficiale sulla parete interna del
capillare.
È l'effetto del campo elettrico applicato sul

doppio strato della soluzione in
corrispondenza della parete.
The resulting double layer is schematically

depicted with a rigid boundary layer close to the
Controlla l'intervallo di tempo per il quale i wall followed by a diffuse (Stern) boundary layer. It
soluti rimangono nel capillare mediante la is assumed that the potential built up on account of
sovrapposizione di un flusso alla mobilità the charge distribuition decreases linearly in the
rigid and exponentially in the diffuse layer. The
del soluto (ciò può alterare la lunghezza del
region of exponential decline is responsible for the
capillare richiesta ma non ha effetti sulla effect of electroosmosis and is designated as the
selettività. zeta-potential (ζ).
!16

L’effetto elettrosmotico è principalmente

dovuto ai numerosi gruppi silanolo (SiOH) e
della relativa forma anionica (SiO-) che
risultano dalla ionizzazione della superficie
del capillare e/o dall'adsorbimento di specie
ioniche.
vEOF = (εζ / η ) E
µEOF = (εζ / η )
vEOF velocità Courtesy Agilent Technologies
µEOF “mobilità” dell'EOF

Sviluppo del flusso elettrosmotico: a) superficie
ζ  potenziale zeta di silice fusa con carica negativa (Si-O-); b)
dove
ε Ecostante
è il campo elettrico,
dielettrica ε ed η sono
della soluzione cationi idratati che si accumulano vicino alla
rispettivamente la costante dielettrica e la superficie; c) flusso principale verso il catodo
viscosità del tampone di corsa, e ζ è il per effetto dell'applicazione del campo elettrico.
potenziale zeta (che rappresenta la carica
del supporto).
!17

Una caratteristica esclusiva dell'EOF è il

profilo piatto della velocità del flusso,
dovuto al fatto che non si ha alcuna
caduta di pressione all'interno del
capillare e la velocità è quasi uniforme.
Vantaggi:
Riduzione dell'allargamento (dispersione)

delle zone di soluto.
Il profilo di velocità è generalmente

indipendente dal diametro del
capillare.
Profili della velocità di flusso e
Quasi tutte le specie, indipendentemente corrispondenti zone di soluto nel flusso
spinto elettricamente e in quello spinto
dalla carica, si muovono nella stessa dalla pressione.
direzione.
!18

I cationi, le specie neutre e gli anioni possono

essere sottoposti a elettroforesi in un unico ciclo I cationi migrano più
di analisi perché “migrano” tutti nella stessa velocemente poiché
direzione.
l ' a t t r a z i o n e
elettroforetica verso il
catodo e l'EOF hanno la
stessa direzione.
Le specie neutre
vengono trasportate alla
velocità dell'EOF
Gli anioni migrano più
lentamente poiché sono
attratti dall'anodo ma
sono comunque
trasportati dall'EOF
verso il catodo.
Anche se generalmente vantaggioso, l'EOF deve essere
controllato per mezzo:
-dell’alterazione della carica superficiale del capillare
-della viscosità del tampone

!19

Mobilità elettrosmotica
A seconda della direzione di flusso del tampone,

l’elettrosmosi può andare con o contro l’inerente
migrazione di un analita in un sistema elettroforetico.
La mobilità elettroforetica totale osservata (μnet) per
un analita sarà così uguale alla somma della sua
mobilità elettroforetica (μef) e della mobilità del
tampone di corsa dovuta al flusso elettrosmotico
(
v = µ ef +µ eof E )
(μeof).
μnet= μef+μeof
Nell’elettroforesi su gel, il flusso elettrosmotico è

spesso piccolo se paragonato alla velocità intrinseca
In presenza di elettrosmosi, la
di migrazione dell’analita. Questo in genere non è
velocità di uno ione è la
vero per l’elettroforesi capillare, nella quale il somma tra la velocità di
supporto ha una carica relativamente grande e migrazione e la velocità del
un’elevata area superficiale rispetto al volume del flusso elettrosmotico.
tampone di corsa.
!20

• La mobilità di uno ione è la somma della mobilità elettroforetica dello ione e
della mobilità elettrosmotica della soluzione.
µnet= µef+µeo
Per un analita cationico, che si muove nella stesa direzione del flusso
elettrosmotico µef e µeof hanno lo stesso segno, per cui µnet è maggiore di µef . Al
contrario, l’elettroforesi trasporta gli analiti anionici in direzione opposta
all’elettrosmosi così, per gli anioni, i due termini (µef e µeof ) hanno segno
opposto. A pH acido, l’elettrosmosi è debole e gli anioni possono non
raggiungere mai il rivelatore.
• Il flusso elettrosmotico uniforme contribuisce all’elevata risoluzione

dell’elettroforesi capillare. Qualunque effetto che riduca l’uniformità produce
allargamento di bande e diminuzione della risoluzione.
• Il flusso di ioni nel capillare genera calore (riscaldamento Joule). Il

riscaldamento Joule non è un problema serio in un capillare di 50 µm di
diametro, ma il gradiente di temperatura sarebbe proibitivo se il diametro
fosse ≥ 1mm.
!21

Il tempo che un soluto impiega per

migrare fino al punto di rivelazione
prende il nome di “tempo di migrazione”.
l lL
1.8 µa = =
t a E t aV
µa µe + µEOF
V tensione applicata
l lunghezza effettiva del capillare
L lunghezza totale del capillare
ta tempo di migrazione (ione analita) La lunghezza effettiva del capillare è la distanza tra il punto
di iniezione e il punto di rivelazione.
E campo elettrico
!22

Elettroforesi Capillare: principi
• L’elettroforesi capillare (CE) produce separazioni di elevata

velocità e risoluzione, su volumi di campione eccezionalmente
piccoli.
• L'efficienza è espressa in numero di piatti teorici (N).
µEl
N=
2D
ovvero
µVl
N=
2DL
Dove D è il coefficiente di diffusione dell’analita, µ è la mobilità elettroforetica
dell’analita, E è l’intensità del campo elettrico, L è la lunghezza totale del capillare, l
è la distanza effettiva dal punto di di iniezione al rivelatore e V è il voltaggio
applicato. Courtesy Agilent Technologies
!23

Il valore di N (che rappresenta

l’efficienza del sistema CE) aumenta
all’aumentare dell’intensità del campo
elettrico ossia del voltaggio applicato. tm 2
Per un rapporto l/L costante, il numero N = 16( )
dei piatti teorici è indipendente dalla
lunghezza del capillare. Al contrario W
della cromatografia in elettroforesi
capillari più lunghi non danno maggiore
risoluzione.
lL l
Campo elettrico elevato significa tm = =
maggiore velocità di migrazione, minor µV µE
tempo nel capillare e quindi minore
diffusione longitudinale.
W, c o m e i n c r o m a t o g r a f i a è
l’ampiezza del picco misurata alla sua
base.
!24

Fattori che influenzano l’allargamento delle bande e bande
irregolari
• Diffusione longitudinale
• Effetto Joule
Si verifica tutte le volte che un campo elettrico viene applicato a un
sistema. In accordo con la legge di Ohm, se si applica un voltaggio V
attraverso un mezzo con resistenza R è necessario che si abbia una
corrente I per mantenere questo voltaggio V=I×R
Il flusso di questa corrente attraverso il sistema genera il riscaldamento.
La produzione di questo calore dipende dal voltaggio, dalla corrente e dal
tempo di passaggio di questa corrente attraverso il sistema. Questo
calore determina un innalzamento della temperatura del sistema
elettroforetico, con conseguente aumento della diffusione longitudinale e
quindi dell’allargamento delle bande. Inoltre, se questo riscaldamento non
è distribuito uniformemente, anche la temperatura non sarà la stessa in
tutto il sistema elettroforetico. Questo comporta regioni a differente
densità e differenti velocità di diffusione, favorendo ulteriormente
l’allargamento delle bande. In CE l’effetto Joule è trascurabile.
• Altri fattori
!25

Quando la conduttività della banda dell’analita (ka) è significativamente diversa da quella

del tampone di supporto (Kb) si generano picchi di forma irregolare. Per minimizzare la
distorsione delle bande, la concentrazione del campione deve essere molto minore della
concentrazione dell’elettrolita di supporto. Altrimenti è necessario scegliere per il tampone
un co-ione che abbia la stessa mobilità dello ione analita. D. C. Harris
Chimica Analitica Quantitativa
II ed., Zanichelli
!26

Come in cromatografia, la risoluzione tra due picchi adiacenti in un

elettroferogramma è la differenza nei tempi di migrazione (Δt) divisa per la
larghezza media dei picchi alla linea di base (W)
tB − t A
R=
1
2
(
WB +WA ) D. C. Harris
II ed., Zanichelli
!27

Nella CE la separazione è governata principalmente dall'efficienza, non dalla

selettività. Ciò è in contrasto con quanto avviene nella cromatografia liquida.
Pertanto, la risoluzione di due componenti può anche essere espressa in funzione
dell'efficienza:
1 1/ 2 Δµa µaVl µa El Δµ = µa 2 − µa1

R= N ( ) N= =
4 µa 2 DL 2 D µa =
µa 2 + µa1
2
Sostituendo l'equazione 1.10 nell'equazione 1.9

2 si ottiene un'equazione teorica per
la risoluzione comunemente citata:
1 V 1/ 2
R=( )(Δµa )( )
4 2 D( µa + µEOF )
!28

Cromatografia Elettroforesi
Principio di Separazione basata sulle differenze tra velocità
Ripartizione
separazione specifiche del composto in un campo elettrico
Colonne Impaccate Tubo aperto in silice fusa o polimero
Costante e dipendente dalla Velocità di flusso dipendente dal pH +

Velocità di flusso pompa (nelle colonne analitiche migrazione specifica del composto
classiche va da µL/min a mL/min) generalmente dell’ordine di pochi nL/min
Dipendente dal tempo di Dipendente dalla mobilità
Ampiezza del picco

ritenzione (del composto e del tampone)
Se la rivelazione è
spettrofotometria
Generalmente tra 1 cm e 6 cm Generalmente tra 25 µm e 75 µm
UV/vis
Cammino ottico
!29

HPLC CE
Familiarità con la tecnica
Analita neutro – polare
Gamma di rivelatori
Sensibilità analitica
ComplementareØ
Ortogonale Ø
Riproducibilità (qual/quant)
Costo di investimento per
l'apparecchiatura
Lavoro di preparazione del campione
Prestazioni di risoluzione
Volume di campione richiesto
Dimensione degli analiti
Costi di esercizio
Biocompatibilità (proteina nativa)
Analita polare – completamente carico
Polimeri e proteine carichi
!30

Elettroforesi Capillare: Strumentazione
Apparato per elettroforesi capillare D. C. Harris

II ed., Zanichelli
!31

Rivelatore a serie di diodi UV

Cassetta per cartuccia
Vassoio portacampioni
Sistema di rifornimento
Pompa per pressione/vuoto

Sistema operativo
Cartuccia del capillare
!32

L’iniezione del campione:
•idrodinamica (impiega una differenza di pressione tra le due

estremità del capillare, es flusso di azoto sul campione, o
aspirazione dall’uscita del capillare)
•elettrocinetica (impiega un campo elettrico per introdurre il
campione nel capillare)
•per gravità (la fiala del campione in cui è inserita
un’estremità del capillare è sollevata (circa 10 cm) rispetto al
livello della soluzione tampone all’altra estremità del
capillare.
Nella CE soltanto volumi di campione molto piccoli (tipicamente 1 - 50 nL)

vengono caricati nel capillare per evitare un sovraccarico di campione.
!33

Autocampionatore
Autocampionatore termostatato
per vial di campione e di tampone.
Ruotando il carosello il vial del

campione di interesse viene portato
nella posizione di iniezione.
Un sensore di vial rileva le

posizioni occupate del vassoio.
!34

Capillare e cassetta
Rivelatore
Il capillare è installato nella cassetta

che è inserita nel sistema,
esattamente di fronte al rivelatore.
Le estremità del capillare

terminano nei vial.
Interfaccia di allineamento con finestra di

rivelazione ad allineamento automatico
Capillare avvolto
!35

Capillare
A seconda dell'applicazione, sono disponibili differenti capillari.
Caratteristiche
I capillari in CEP contengono un rivestimento polimerico legato in modo permanente.

Con rivestimento in •  Prevenzione dall'assorbimento del campione
CEP •  Eliminazione dell'EOF (quasi)
•  Raccomandato per la separazione del DNA e per l'analisi di anioni e acidi organici
I capillari con rivestimento in PVA contengono uno strato assorbito in modo permanente
di alcol polivinilico.
Con rivestimento in
•  Riduzione dell'interazione idrofobica ed elettrostatica soluto/parete
PVA
•  Eliminazione dell'EOF
•  Raccomandato per l'analisi di proteine e ammine
I capillari µSIL sono rivestiti in modo permanente utilizzando processi di reticolazione
µSIL-DB brevettati per mascherare gruppi di silanolo attivi e fornire un'elevata stabilità.
µSIL-WAX •  EOF ridotto, per la modalità cIEF
µSIL-FC •  Raccomandato per la separazione di biomolecole come frammenti di PCR, proteine,
peptidi e carboidrati
Silice fusa non

Capillare per CE standard senza rivestimento interno.
rivestita
!36

Cross-section of a polyimide-covered fused silica capillary of 50 µm i.d. and 300 µm
o.d.
!37

Controllo delle condizioni all’interno del capillare
Le condizioni della parete interna sono critiche in elettroforesi
•Inversione di carica generata da un doppio strato di tensioattivo
cationico che riveste la parete del capillare. La parte diffusa del doppio
strato elettrico contiene un eccesso di anioni e il flusso elettrosmotico è
in senso opposto mostrato in precedenza. Il tensioattivo può essere, per
esempio, lo ione cetiltrimetilammonio.
D. C. Harris
II ed., Zanichelli
!38

!39

Rivelazione: Assorbanza UV-Vis
Rivelatore a serie di diodi UV-Vis

(190-600 nm)
Lampada al deuterio
Il rivelatore è a temperatura controllata
!40

Rivelazione UV-VIS
L'assorbimento UV-visibile è il sistema di rivelazione più ampiamente utilizzato per via della
sua universalità e del fatto che si tratta di un sistema di rivelazione a capillare.
L'assorbanza è correlata alla concentrazione
secondo la legge di Beer-Bouguer-Lambert:
Cammino ottico
A = ε ⋅b ⋅c
Capillare
ε  coefficiente di estinzione o
assorbimento molare (Lmol-1cm-1)
b lunghezza del percorso (cm)
c concentrazione Allineamento Ferrula
La brevità della lunghezza del percorso (b) è il principale Courtesy Agilent Technologies
fattore limitante della sensibilità nella CE. Sono disponibili

celle di flusso progettate con lunghezza del percorso estesa
(cella a bolla e cella a Z, vedere l'immagine).
!41

Modelli di capillare con cammino

ottico aumentato per misurazione
dell’assorbimento nell’ UV.
a) Cella a bolla. La fetta della zona
di soluto si conserva durante il
passaggio attraverso la bolla.
b) Curvatura ad angolo retto. Il
cammino ottico è realizzato in
silice fusa nera, per ridurre la
luce diffusa.
c) cella a riflessione multipla: La
parete interna riflettente funziona
da guida ottica per massimizzare
la trasmissione
D. C. Harris
II ed., Zanichelli
!42

Rivelazione amperometrica
D. C. Harris
II ed., Zanichelli
!43

Rivelazione MS
La CE può essere accoppiata a spettrometri di massa compresi i sistemi a
singolo quadrupolo, TOF,
Il sistema CE Agilent 7100 si integra Q-TOF, trappola ionica, ICP-MS e sistemi a triplo
perfettamente con gli spettrometri
quadrupolo.
di massa Agilent della Serie 6000,
compresi i sistemi a singolo quadrupolo,
TOF, Q-TOF, trappola ionica, ICP-MS e
sistemi a triplo quadrupolo. Il sistema
d’introduzione del campione “plug-and-
play” non richiede di effettuare la noiosa
operazione di fine-tuning e il design unico
dell’iniettore del sistema MS rende le
condizioni di separazione CE indipendenti
dalle condizioni di funzionamento dello
spettrometro di massa.
ndo
Il sistema di nebulizzazione ESI è tra i

6 più usati.
Per ulteriori informazioni sul sistema CE/MS Agilent Serie 7100, visita il sito www.agilent.com/chem/ce
!44
RFU
Interfaccia di elettronebulizzazione per

elettroforesi capillare/spettrometria di massa
D. C. Harris
II ed., Zanichelli
L’ a c c i a i o è i n c o n t a t t o
elettrico con il liquido
all’interno del capillare di
quarzo mediante uno strato
di liquido che fluisce tra i
capillari.
!45

Sistema di rifornimento
Il rifornimento del tampone è fondamentale per
mantenere un'elevata riproducibilità del tempo
di migrazione. L'elettrolisi della soluzione può
alterare il pH del tampone di analisi e di
conseguenza modificare l'EOF.
Il sistema di rifornimento (serbatoio
del tampone) è situato al di sotto del
carosello del campione.
Riproducibilità del tempo di migrazione migliorata utilizzando

il rifornimento del tampone. Sovrapposizione dei cicli di
analisi 5, 10 e 15. A) rifornimento ogni 5 cicli. B) nessun
rifornimento.
!46

Elettroforesi Capillare: campi di applicazione e metodi
Diversi Metodi di CE:
• Elettroforesi capillare di zona

(zonale) (CZE)
• Elettroforesi capillare su gel (CGE)
• Focalizzazione isoelettrica capillare
• Isotacoforesi capillare
• Cromatografia elettrocinetica
micellare
!47

Campi di applicazione della CE

La versatilità dell'elettroforesi capillare deriva dalle sue numerose modalità operative.
Modalità operative
Separazione in base alle differenze di velocità delle zone:

•  Elettroforesi di zona capillare (CZE)
Eluizione
•  Cromatografia elettrocinetica micellare (MEKC)
•  Elettrocromatografia capillare (CEC)
Separazione in base al passaggio attraverso una fase stazionaria o
Setaccio molecolare immobile (gel) a seconda della dimensione e della forma:
•  Elettroforesi capillare gel (CGE)
Focalizzazione isoelettrica capillare Separazione mediante il passaggio attraverso un gradiente di pH

(CIEF) stazionario nel tampone di analisi.
Separazione in base a un gradiente di campo elettrico mobile tra un

elettrolita di entrata e uno di uscita che fa in modo che tutte le
Isotacoforesi capillare (CITP)
molecole del campione si muovano in zone connesse tra loro che
hanno concentrazione costante e la stessa velocità.
!48

Elettroforesi capillare di zona (CZE) o Elettroforesi capillare zonale
La elettroforesi capillare di zona (CZE) è

la forma più semplice di elettroforesi
capillare.
Elettroforesi
I principi teorici sono quelli descritti La CZE è la f
precedentemente.
viene riempito
Nella CZE, un capilare viene riempito viene introdot
con un elettrolita (tampone di corsa), il applicato un c
campione viene introdotto in
corrispondenza dell’iniettore, quindi
viene applicato un campo elettrico. Nella Cromatograf
CZE, la composizione del tampone è La MECK (tec

costante in tutta la regione della modalità CE a
separazione. e le molecole
elettroforetica
soluti sia neu
Elettrocroma
!49CEC è un
La
Metodi Strumentali in Chimica Analitica, AA 2020-2021 utilizza un cam
Il risultato di un'analisi CE è un elettroferogramma.
Migrazione differenziale dei soluti

sovrapposta al flusso elettrosmotico
nella CZE. L'analita cationico (1) ha la
mobilità maggiore, seguito dall'analita
neutro (n) e dai due analiti anionici (2,
3)
!50

La versatilità della CE
Elettroforesi di zona capillare (CZE)
La CZE è la forma più semplice di CE. Nella CZE, un capillare
viene riempito con un elettrolita (tampone di analisi), il campione
viene introdotto in corrispondenza dell'iniettore, quindi viene
applicato un campo elettrico.
Cromatografia elettrocinetica micellare (MEKC)

La MECK (tecnica ibrida di elettroforesi e cromatografia) è una
modalità CE ampiamente utilizzata per i prodotti biofarmaceutici
e le molecole di piccole dimensioni. È l'unica tecnica
elettroforetica che è possibile utilizzare per la separazione di
soluti sia neutri che carichi.
Elettrocromatografia capillare (CEC)

La CEC è un tipo di cromatografia liquida miniaturizzata che
utilizza un campo elettrico per pompare un liquido in una colonna
di cromatografia impaccata mediante flusso elettrosmotico
(EOF), assicurando numeri di piatti molto elevati.
!51

Elettroforesi capillare gel (CGE) Isotacoforesi capillare (CITP)

LA CGE è ideale per la separazione in base alle La CITP è una tecnica di elettroforesi a
dimensioni delle macromolecole (proteine, acidi nucleici). “barriera mobile” in cui una combinazione di
Quando i soluti carichi migrano attraversando la rete due sistemi tampone viene utilizzata per
polimerica, il loro movimento viene ostacolato, quello creare uno stato in cui tutti i soluti si
dei soluti di dimensioni più grandi in modo maggiore muovono in bande separate ma tra loro
rispetto a quello dei soluti di dimensioni più piccole. connesse e alla stessa velocità. Le zone
La separazione di DNA e proteine saturate con SDS rimangono separate tra due elettroliti detti di
(sodio-dodecilsolfato) non può essere effettuata senza entrata e di uscita. Possono essere
un gel a causa dell'invariabilità dei rapporti massa/carica. analizzati sia i cationi che gli anioni.
Focalizzazione isoelettrica capillare (CIEF)

La CIEF è una tecnica elettroforetica ad “alta
risoluzione” utilizzata per separare peptidi e proteine
in base al loro punto isoelettrico (pI).
!52

Campi di applicazione della CE

L'elettroforesi capillare (CE) è una tecnica di separazione a scopo qualitativo o
quantitativo per la rivelazione di molecole di piccole e grandi dimensioni. È
spesso utilizzata in combinazione con la spettrometria di massa.
Trova impiego in un ampio range di settori, tra i quali:

analisi di cationi/anioni
composti polari (per es. droghe basiche)
prodotti naturali in matrici complesse
analisi di composti chirali e isomeri
caratterizzazione di proteine (per es. anticorpi)
analisi di peptidi, DNA, RNA, oligonucleotidi
interazioni tra molecole (per es. proteina-DNA)
!53

The use of capillary electrophoresis (CE) in genetic analysis applications
Sanger sequencing workflow. The Sanger sequencing workflow enables chain-terminated, end-labeled
fragments to be generated and subsequently read as a sequence.
!54

During capillary electrophoresis, products of

the sequencing reaction enter the capillary as
a result of electrokinetic injection. A high-
voltage charge applied to the buffered
sequencing reaction forces the negatively
charged DNA fragments into the capillaries.
The DNA fragments are separated by size due
to the larger fragments migrating more slowly
through the matrix. CE plays a central role in
the overall workflow for both automated
Sanger sequencing and fragment analysis.
Before reaching the positive electrode, the

DNA fragments pass through a laser beam,
which excites the dye labels and cause them
to fluoresce. The dye signals are separated by
a diffraction system, and a charge-coupled
device (CCD) camera detects the Automated parallel capillary electrophoresis.
fluorescence. Because each dye emits light at
a different wavelength when excited by the
laser, all colors, and therefore loci, can be
detected and distinguished in one capillary
injection.
!55

The fluorescence signals are converted to digital data, in a file format compatible with an
analysis software application
!56

Esempio
Analisi di ammine biogeniche in salmone e gamberetti
Ammina LOD (ng/ LOQ

y= a ± bx R2
biogenica mL) (ng/mL)
SPM y= 0,0056 ± 0,1177x 0,999 1,9 6,3
SPD y= 0,0144 ± 0,1927x 0,999 2,6 8,6
PUT y= 0,0112 ± 0,0826x 0,999 2,5 8,3
HIS y= 0,0330 ± 0,2254x 0,999 1,1 3,6
CAD y= 0,164 ± 0,1503x 0,999 1,6 5,3
Parametri importanti del metodo per la determinazione delle

ammine biogeniche proposto; per la tabella completa,
consultare la nota applicativa.
Elettroferogramma CE-MS/MS di una miscela di ammine

biogeniche, ognuna alla concentrazione di 10 µg/mL, in
un elettrolita di fondo.
Spermina (SPM), spermidina (SPD), putrescina (PUT),
istamina (HIS), cadaverina (CAD), agmatina (AGM), 1,7-
diamminoeptano (DIA) a 5 µg/mL (standard interno),
feniletilamina (PHE), tiramina (TYR), triptamina (TRY), Fonte:
acido urocanico (URO), serotonina (SER). Analyze Biogenic Amines in Salmon and Shrimp by Capillary
Electrophoresis-Tandem MS
!57

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µ ef ( cm2 V-1 s-1): Mobilità elettroforetica

Poiché la mobilità è q/f , maggiore è il raggio, minore la mobilità

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ν = µ ef E E campo elettrico applicato

Il campo elettrico è semplicemente il

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• Il valore di µ è costante per determinate condizioni di solvente e

• Il valore di µ dipende dalle dimensioni apparenti della carica del

• Per ottenere buone separazioni in elettroforesi è spesso

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Nella pratica si prende la mobilità

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Un componente fondamentale per il

Costituisce il flusso principale di liquido nel

È l'eﬀetto del campo elettrico applicato sul

The resulting double layer is schematically

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L’eﬀetto elettrosmotico è principalmente

µEOF “mobilità” dell'EOF

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Una caratteristica esclusiva dell'EOF è il

Riduzione dell'allargamento (dispersione)

Il profilo di velocità è generalmente

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I cationi, le specie neutre e gli anioni possono

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