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L’elettroforesi è una tecnica analitica e separativa basata sul movimento di particelle dotate di carica che
immerse in un campo elettrico sono indotte a muoversi per effetto dello stesso.
L’elettroforesi serve a distinguere, caratterizzare e identificare biomolecole anche in miscele complesse.
Quando si applica una differenza di potenziale (ΔV) tra due elettrodi, si genera un campo elettrico (E), che
dipende dalla distanza tra gli elettrodi (d) verso l'elettrodo di carica opposta e che induce la mobilità di una
molecola di carica q verso l'elettrodo di carica opposta, imprimendole una velocità di migrazione (v).
Le molecole si spostano verso il catodo se hanno carica positiva e verso l'anodo se hanno carica negativa.
MOBILITÀ ELETTROFORETICA: è una proprietà intrinseca di ogni molecola carica dipendente dal coefficiente
frizionale nel mezzo fluido in cui si realizza l’esperimento; è pari al rapporto tra la velocità di migrazione
della particella e il campo elettrico applicato.
La differenza di potenziale tra gli elettrodi genera un gradiente di potenziale elettrico definito da:
E=V/d
La corrente viene condotta principalmente dagli ioni del tampone che ha la funzione di mantenere le
molecole del campione in uno stato ionizzato, senza legarsi ai composti da separare. La sua concentrazione
oscilla tipicamente tra da 0.05 e 0.10 M, mentre il suo pH determina, influenza e stabilizza la migrazione.
STRUMENTAZIONE
La strumentazione necessaria a condurre una corsa elettroforetica comprende un alimentatore e una
camera elettroforetica che può essere orizzontale su carta o verticale in gel.
Gli alimentatori devono essere in grado di fornire tensione e corrente adeguata. Per quanto riguarda i
supporti, molto usati sono i gel di poliacrilammide, agarosio, oppure carta da filtro o acetato di cellulosa.
ELETTROFORESI SU GEL
L’elettroforesi su gel prevede che la miscela di molecole da separare sia caricata su di un supporto
gelatinoso preparato a base di agarosio o poliacrilammide.
L’agarosio è normalmente utilizzato per la separazione di frammenti di acidi nucleici aventi dimensioni
comprese tra 500 bp a 20 kb circa; gel di poliacrilammide sono invece più usati per la separazione di
proteine e per frammenti di DNA più piccoli, da pochi nucleotidi a 2-3 kb circa.
ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO
Il gel di agarosio (polisaccaride estratto dalle alghe, preparato dall’1 al 3%) viene preparato portando ad
ebollizione l’agarosio mescolato al tampone. La soluzione ottenuta si versa in uno stampo dove avviene la
gelificazione e dove, con un pettine verranno ricavati gli spazi per depositare i campioni. Il gel viene poi
immerso completamente nel tampone. La migrazione dei campioni avviene in orizzontale verso il polo
positivo (anodo) sulla base alla loro massa poiché il loro rapporto carica/massa è costante. La loro velocità
di migrazione dipende da:
dimensioni dei frammenti
percentuale dell’agarosio nel gel
voltaggio applicato
Frammenti lineari più piccoli migrano più velocemente rispetto a quelli più grandi, mentre, a parità di peso
molecolare, il DNA circolare migra più velocemente di un DNA lineare, in quanto assume una
conformazione detta super avvolta (super coiled DNA).
Per la rivelazione del campione si sfrutta la colorazione con etidio bromuro, una molecola fluorescente che
è capace di intercalarsi tra le coppie di basi del DNA.Il colorante viene visualizzato irradiando il gel con raggi
U.V. e selezionando l’emissione con un filtro rosso. Un transilluminatore consente la visualizzazione del gel
e l’immagine può essere registrata fotografandola su film o acquisita con fotocamere digitali. La sensibilità
del rilevamento è solitamente superiore a 0.1 μg di DNA.
GEL DI ACRILAMMIDE
Il gel di poliacrilammide si ottiene dalla polimerizzazzione di molecole di acrilammide mediante formazione
di legami crociati in presenza di metilen-bis-acrilammide. Il processo di polimerizzazione è innescato
dall’aggiunta di un catalizzatore, il TEMED, e uno ione persolfato che funge da iniziatore.
L’utilizzo di gel di poliacrilammide ci permette di visualizzare le proteine. Infatti, alla soluzione aggiungiamo
l’SDS, un detergente anionico che si lega alle proteine, è un agente riducente (b-ME o DTT) che rompe la
loro struttura terziaria.
I campioni caricati su gel, dopo la separazione elettroforetica, possono essere resi visibili mediante utilizzo
di metodi in grado di colorare le molecole separate. Silver stain e colorazione con Coomassie brilliant blue,
sono metodi frequentemente utilizzati per la rivelazione di proteine. L’analisi densitometrica delle bande
corrispondenti a ciascun componente può essere utilizzata per determinarne i rapporti ed eseguire una
stima quantitativa dei campioni.
L’elettroforesi su gel è tipicamente una tecnica analitica, tuttavia essa può essere usata a scopi preparativi,
perché le molecole contenute nella banda possono essere recuperate dal gel per diffusione o mediante
elettroeluizione e sottoposte ad analisi successive.
ELETTROFORESI DI PROTEINE
La separazione dei componenti di una miscela eterogenea di proteine mediante elettroforesi su gel di
poliacrilammide può essere ottimizzata modificando opportunamente la porosità del gel, attraverso l’uso di
acrilamide e bis-acrilamide in rapporti diversi per la preparazione del gel.
La carica netta di una proteina dipende dal pH del tampone: a pH neutro la maggior parte delle proteine è
sotto forma di anioni (-) e migra quindi verso il polo positivo.
Una corsa elettroforetica in condizioni native permette di separare enzimi o proteine preservando la loro
attività biologica. In queste condizioni le proteine conservano la loro conformazione e la separazione
avviene sulla base del rapporto carica/massa. La conservazione della conformazione è importante per il
mantenimento dell’attività biologica: proteine estratte da gel sono attive e possono essere utilizzate in
ulteriori esperimenti.
IMMUNOBLOT (elettrotrasferimento)
Le proteine separate sul gel di poliacrilammide possono essere trasferite su un filtro di nitrocellulosa dove
poi vengono immobilizzate mantenendo le stesse posizioni relative che occupavano nel gel. Le proteine sul
filtro possono essere raggiunte e riconosciute da anticorpi specifici. La procedura prende il nome di
immunoblot e consente di identificare proteine anche se presenti in piccole quantità e di definire il loro
peso molecolare.
ISOELETTROFOCALIZZAZIONE
La tecnica di isoelettrofocalizzazione consente la separazione di sostanze anfotere sulla base del pH.
Il gel viene prodotto con miscele di anfoliti che formano un gradiente di pH nella matrice prima della sua
polimerizzazione. Gli anfoliti disponibili commercialmente sono utilizzati per diversi range di pH, sia a banda
larga (ad es. da pH 3 a pH 10), che a banda stretta (ad es. da pH 7 a pH 8).
ELETTROFORESI CAPILLARE
Il principio chimico-fisico su cui si basa l'elettroforesi consiste nella risposta che molecole cariche
producono se immerse in un campo elettrico: queste, infatti, tenderanno a muoversi lungo le linee del
campo di modo che gli ioni positivi migrino verso il polo negativo e quelli negativi verso il polo positivo.
I vantaggi della CE sono l’alta efficienza di separazione, i piccoli campioni necessari, la velocità
dell’assemblaggio e della corsa, la facilità di automazione. La rilevazione dei campioni può essere effettuata
mediante rilevazione di assorbanza o di fluorescenza alla estremità del tubo. L’uso di gel di acrilamide o
agarosio, invece di solo buffer, permette invece di eseguire una elettroforesi equivalente a quella su gel, ma
con i vantaggi dell’automazione. È usata per proteine, peptidi, acidi nucleici.