WESTERN BLOT

È una tecnica in cui le proteine vengono trasferite su un supporto. Perme5e di iden7ficare una
specifica proteina grazie al riconoscimento con un supporto.

Perché effe5uare un western blot? Nel momento in cui ho purificato, estra5o e separato le
proteine l’unica informazione che ho sulla molecola di interesse è legata al peso molecolare.
Per studiare una proteina specifica uso un an7corpo che riconosce solo quella determinata
proteina.

FASI
1. Ele5roforesi su gel
2. Trasferimento su membrana a5raverso applicazione di un campo ele5rico
3. Blocking à lego i si7 di legame aspecifici della proteina
4. Legame con an7corpo primario per riconoscere la proteina
5. Legame con l’an7corpo secondario
6. Rivelazione o detec7on

I gel si possono conservare però le bande tendono a diffondere e quindi le proteine si confondono.
L’unico modo per immobilizzare le proteine è trasferirle su una membrana o un filtro.

Per fare un western blot si usano diversi 7pi di membrane che possono essere:
• Nitrocellulosa à appare come un foglio di carta molto soWle.
• PVDF
• Nylon
La membrana ha delle maglie per cui le proteine si immobilizzano all’interno.

Il western blot viene effe5uato all’interno di una cella ele5rofore7ca. Per poter fare il
trasferimento devo me5ere il gel a conta5o con la membrana e dall’altro lato con una serie di fogli
di carta.
La strumentazione prevede un alimentatore e un apparato di trasferimento.
All’interno della cella il trasferimento avviene perché si fa quello che viene chiamato panino: la
membrana ha ai la7 il gel e all’esterno di ques7 vengono messi di fogli di carta e delle spugne5e.
Quando applico la differenza di potenziale le bande si trasferiscono dal gel alla membrana di
nitrocellulosa.

Il buffer di trasferimento è una soluzione salina per facilitare il passaggio di corrente.

La membrana di nitrocellulosa può essere colorata con rosso Ponceau. Coloro la membrana perché
l’an7corpo usato per il western blot è piu5osto costoso e andando a visualizzare le bande posso
selezionare una parte della membrana in base al peso molecolare ed incubare solo quello che
interessa.
Il rosso ponceau può essere lavato con acqua.

A questo punto devo bloccare tuW i si7 di legame aspecifico. Posso farlo andando a incubare con
la5e scremato o con albumina di siero bovino.
Ora posso fare il riconoscimento con l’an7corpo primario. L’an7corpo deve essere molto specifico
per la proteina di interesse.
L’an7corpo primario di per sé non è visibile per cui devo usare un sistema di rivelazione. Userò
quindi un an7corpo secondario che si legherà all’an7corpo primario. Il secondo an7corpo avrà
coniugato un sistema di detec7on che potrà essere un enzima, un fluoroforo o una molecola
radioaWva.
I principali sistemi di detec7on sono:
• An7corpi secondari fluorescen7
• An7corpi coniuga7 a fosfatatasi alcalina o perossidasi del rafano. O si aggiunge un substrato
che viene conver7to in un substrato colorato che precipita oppure si u7lizzano dei substra7
chemioluminescen7, che una volta conver77 dalla perossidasi del rafano eme5ono luce. Il
luminolo a5accato dalla perossidasi dà un precipitato ed eme5e luce. I sistemi di detec7on
presentano anche un intensificatore chimico di luce. Per sviluppare le lastre si usano delle
camere oscure oppure si usa uno strumento come l’image quant.
La chemioluminescenza viene usata di più in laboratorio.

A cosa serve il western blot?

• Iden7ficare una proteina di interesse
• Analisi della densità di una banda