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METODICHE PER LA PREPARAZIONE E

SEPARAZIONE DELLE CELLULE DELLA


RISPOSTA IMMUNITARIA DA SANGUE
PERIFERICO
IL SANGUE

COMPOSIZIONE:

ELEMENTI FIGURATI (ERITROCITI, LEUCOCITI, PIASTRINE)


PLASMA

LEUCOCITI:
-POLIMORFONUCLEATI (neutrofili (N), eosinofili (E), basofili(B)
-CELLULE MONUNUCLEATE (linfociti, monociti)

FORMULA LEUCOCITARIA:
N. 50-70%
E. 2-4%
B. 0,5-1%
LINF. 20-40%
MON. 3-8%
POLIMORFONUCLEATI

CELLULE MONONUCLEATE
LINFOCITI
La possibilità di isolare fisicamente
particolari popolazioni di cellule o cellule singole di una
popolazione mista riveste spesso una grande importanza in
biologia cellulare.
Cell separation products for your species of interest

human non human primate

mouse other species

rat
Cell separation for cell of interest
CD8+ T cell
T cell CD4+ T cell subset B cell

NK monocyte progenitor dendritic cell mesenchymal


cell

granulocyte eosinophil basophil Tumour cell Mammary cell


Esistono numerose soluzione per la selezione di ogni tipo cellulare presente nel
sangue periferico e non solo.
Ci sono metodiche che prevedono una selezione negativa e altre invece che
prevedono una selezione positiva.
Inoltre si può utilizzare una separazione per gradiente di densità, o una
separazione di tipo “immunomagnetico” , o una separazione
detta“immunodensità” che utilizza un gradiente di densità in presenza di
anticorpi.

- Positive and Negative Selection

- Magnetic and Density-Based Separation


Immunodensity separation:
Unwanted cells are targeted with monoclonal antibody-based reagents,
and pellet when centrifuged over density medium.

Immunomagnetic selection:
Cells are labeled using monoclonal antibodies and magnetic particles.

Negative selection:
Unwanted cells are targeted for depletion using monoclonal antibodies to
specific cell surface antigens.
Desired cells are not labeled with antibody.
Positive selection:
Desired cells are targeted for selection using a monoclonal antibody to a
specific cell surface antigen.
Metodi per la separazione delle cellule

1) SEPARAZIONE DELLE CELLULE MONONUCLEATE DEL SANGUE


MEDIANTE CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITA’

ARNE BOYUM, NORWAY(1965)

FICOLL HYPAQUE 1077


MISCELA DI:
•DESTRANO AD ALTO PESO
MOLECOLARE
•MEZZO DI CONTRASTO IODATO
(SODIO METRIZOATO)

FICOLL HYPAQUE
DENSITA’ 1.077
DESTRANO AD ALTO PESO MOLECOLARE

PSEUDOAGGLUTINAZIONE DEGLI
ERITROCITI PER MODIFICAZIONI
DELLA CARICA ELETTRICA DI
SUPERFICIE
SODIO METRIZOATO

CONSENTE DI OTTENERE SOLUZIONI AD


ELEVATA DENSITA’
Durante la centrifugazione si hanno migrazioni differenziali dei
vari elementi del sangue, dando luogo così alla formazione di
varie fasi distinte contenenti tipi cellulari diversi.

•Lo strato più in basso nella provetta contiene


eritrociti aggregati dall’azione del destrano
• lo strato immediatamente sopra contiene
granulociti che alla pressione osmotica del
Ficoll Hypaque raggiunge un gradiente di
densità tale da attraversarlo e migrare sul fondo
della provetta
•Ancora al di sopra troviamo i linfociti posti
all’interfase fra il plasma e il ficoll Hypaque , a
causa della loro bassa densità non riescono a
migrare attravrso la miscela, ma anche altre
componenti del sangue a bassa densità, quali le
piastrine e i monociti.
2) SEPARAZIONE DEI GRANULOCITI MEDIANTE CENTRIFUGAZIONE IN
GRADIENTE DI DENSITA’

ENGLISH E ANDERSEN (1974)

FICOLL HYPAQUE 1077 E 1119


È dunque possibile ideare un sistema in cui anche le cellule delle serie granulocitiche possano essere
raccolte utilizzando una procedura ad una sola fase. Il sistema ficoll-paque 1119 è stato progettato
per questo scopo specifico, sulla base delle osservazioni di English e Andersen.

Secondo la procedura, si forma un


doppio gradiente depositando uno
strato di soluzione ficoll-paque 1077
su un volume identico di soluzione
ficoll-paque 1119. Successivamente
si versa uno strato di sangue intero
sul mezzo ficoll-paque 1077
superiore.
Le provette vengono centrifugate a
700 x g per 30 minuti. Le cellule
delle serie granulocitiche si trovano
in corrispondenza dell’interfaccia
1077-1119, mentre i linfociti, le altre
cellule mononucleari e le piastrine si
trovano in corrispondenza
dell’interfaccia plasma-1077.
3) SEPARAZIONE POPOLAZIONI CELLULARI PER IMMUNODENSITA’

Unwanted cells are targeted with monoclonal antibody-based reagents,


and pellet when centrifuged over density medium.

Selezione negativa
A Immunodensità
Questa metodica permette l’isolamento di popolazioni cellulari umane
utilizzando:
-antibody-based TAC (tetrameric antibody complex) technology,
-density centrifugation

Cell enrichment simply involves a brief incubation of the sample with the antibody-based
enrichment cocktail at room temperature, followed by a standard buoyant density
separation. The antibody cocktail crosslinks unwanted cells in human whole blood to
multiple red blood cells (RBCs), forming immunorosettes. This increases the density of
the unwanted (rosetted) cells, such that they pellet along with the free RBCs when
centrifuged over a buoyant density medium. Desired cells are never labeled with
antibody and are easily collected as a highly enriched population at the interface between
the plasma and the buoyant density medium .
Alcuni esempi:
-kit per la separazione di linfociti T
TAC cocktail with monoclonal antibodies to the following human cell
surface antigens: glycophorin A, CD16, CD19, CD36, CD56, CD66b
This depletion cocktail is tailored to enrich T cells from fresh whole blood.
The enriched T cells have not been labeled with antibody.
-kit per la separazione di monociti
TAC cocktail with monoclonal antibodies to the following human cell
surface antigens: Glycophorin A, CD2, CD3, CD8, CD19, CD56, CD66b
This depletion cocktail is tailored to enrich monocytes from fresh whole
blood. The enriched monocytes have not been labeled with antibody.
-kit per la separazione di linfociti NK
TAC cocktail with monoclonal antibodies to the following human cell
surface antigens: Glycophorin A, CD3, CD4, CD19, CD36, CD66b
This depletion cocktail is tailored to enrich NK cells from fresh whole
blood. The enriched NK cells have not been labeled with antibody
B Immunodensità
4) SEPARAZIONE POPOLAZIONI CELLULARI CON METODICA
IMMUNOMAGNETICA
Questa metodica utilizza:

-specific antibodies
-magnetic nanoparticles in a column-free magnetic system.

Cells are targeted for selection or depletion using monoclonal antibodies directed against specific cell surface
antigens. These labeled cells are then crosslinked to EasySep® magnetic nanoparticles in a standard FACS tube.
The tube is then placed directly in the specially designed EasySep® magnet. This handheld magnet is gently
inverted to remove the cells that are not bound to the magnetic nanoparticles. The unique EasySep® magnet
generates a high gradient magnetic field in the interior cavity that is strong enough to separate cells labeled with
EasySep® nanoparticles without the additional magnetic field gradients provided by a column matrix. Unlike
larger microparticles used with other column-free systems, the EasySep® nanoparticles do not interfere with
subsequent FACS analysis and do not need to be removed.
For Positive Cell Selection: Cells of interest remain
in the tube after pouring off the cells that are not
bound to the magnetic nanoparticles. To obtain a
highly pure population, these cells are rinsed twice or
more, then easily collected by removing the tube from
the magnet.

For Negative Enrichment: Cells of interest are poured


into a new tube when the magnet is inverted, as they
are not bound to the magnetic nanoparticles.
negative selection procedure positive selection procedure
Alcuni esempi

Human CD3+ Cell Depletion

This depletion cocktail is tailored to efficiently remove CD3+ cells from fresh or previously frozen peripheral
blood or bone marrow. With this magnetic cell depletion technique, one cell type (CD3+ cells) is targeted for
removal and all other cells are recovered without being labeled with antibody.
•TAC reagent with monoclonal antibody to CD3
•Appropriate volume of magnetic colloid

Human CD3 Positive Selection Kit


These reagents are designed to positively select CD3+ cells (cells expressing the CD3 antigen) from fresh or
previously frozen peripheral blood mononuclear cells. The CD3 antigen is expressed on all T cells. This cocktail
contains an antibody to human Fc receptor to minimize nonspecific binding to monocytes and macrophages.
TAC reagent with monoclonal antibody to CD3
•Appropriate volume of magnetic colloid
Protocollo sperimentale

Sul vostro banco troverete:

· un tubo da 15 ml contenente 4ml di sangue (2 ml buffy coat diluito in 2ml di PBS)


· una eppendorf contenente 100 μl di cocktail di anticorpi
· un tubo da 15 ml con 4 ml di PBS + FBS 2% (siero fetale bovino)
· un tubo da 15 ml con 2 ml di Ficoll

1. Aggiungere i 100 μl di cocktail di anticorpi alla provetta contenente il campione di sangue.


2. Incubare per 20 min. a temperatura ambiente, per permettere la formazione delle rosette.
3. Una volta scaduto il tempo d’incubazione, aggiungere al tubo con il sangue e gli anticorpi 2ml di
PBS + FBS 2%.
4. Stratificare la sospensione formata su Ficoll: ciò vuol dire versare lentamente la sospensione di
sangue, anticorpi e PBS + FBS 2% nel tubo con Ficoll.
5. Centrifugare per 15 min. a 1200 g.
6. Dopo la centrifugata vedrete nel tubo varie fasi:
· in alto si trova il plasma;
· più o meno al centro (subito al di sotto del plasma) si trovano le cellule che ci interessano
· ancora sotto si trova il Ficoll
· sul fondo della provetta sono stratificate le “rosette”, cioè globuli rossi e cellule non desiderate.