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SEQUENZIAMENTO DEL DNA DI NUOVA GENERAZIONE

Il sequenziamento di nuova generazione (NGS) è una metodologia ad alta produttività che consente il
sequenziamento rapido delle coppie di basi nei campioni di DNA o RNA.
Supportando una vasta gamma di applicazioni, tra cui la profilazione dell'espressione genica, il conteggio
cromosomico, il rilevamento dei cambiamenti epigenetici e l'analisi molecolare, NGS sta guidando la
scoperta e consentendo il futuro della medicina personalizzata.
Si basa sul principio del sequenziamento di cluster clonali: milioni di analisi di sequenziamento di DNA
contemporaneamente sullo stesso campione e su più campioni diversi.
Contemporaneità: molte reazioni di sequenziamento avvengono contemporaneamente
Micro scala: le reazioni in piccolo spazio e possono essere fatte contemporaneamente su un chip
Veloce: poiché le reazioni sono fatte in parallelo, i risultati sono pronti molto più velocemente
A basso costo: il sequenziamento di un genoma è più economico rispetto al sequenziamento di Sanger
Lunghezza più breve: le letture in genere vanno da 50 -700 nucleotidi di lunghezza.
Attraverso questa nuova metodologia si creano in corrispondenza dei chip un gruppo di frammenti di DNA
tutti uguali, definiti cloni Cluster, che vengono sequenziati tutti contemporaneamente.
Questa modalità ci permette di amplificare il segnale e garantisce una sicurezza sulla sequenza che io sto
leggendo.
A partire dalla fine degli anni 90 ad oggi la tecnologia e la strumentazione è nettamente migliorata.
Ogni azienda crea dei sistemi chiusi con una diversa metodologia; se prendiamo in considerazione una
piattaforma detta ILLUMINA, come le altre piattaforme, ha una sua tecnologia e metodica.

TECNOLOGIA ILLUMINA
Nel 1997 Balasubramanian e Klenerman hanno ideato un approccio per il
sequenziamento di singole molecole di DNA legate a microsfere.
L’anno successivo hanno fondato Solexa, ma l’obiettivo di sequenziare
singole molecole di DNA non è stato raggiunto, portando invece allo
sviluppo di una metodica basata sull’amplificazione clonale del DNA.
A partire dal 2006, la prima piattaforma per il sequenziamento di
frammenti corti (“short reads”) di DNA (Solexa Genome Analyzer) è
stata introdotta sul mercato e, in seguito, acquisita da Illumina
(http://www.Illumina.com).
Lo strumento utilizza una cella a flusso consistente in una “slide”
otticamente trasparente costituita, sulla superficie, da 8 comparti a cui
sono legati degli oligonucleotidi di ancoraggio (Figura 2).
Il DNA stampo è frammentato in segmenti lunghi alcune centinaia di
basi e modificato per generare estremità tronche 5’-fosforilate.
L’attività polimerasica del frammento di Klenow è utilizzata per
aggiungere una singola base di adenina all’estremità 3’ del frammento di
DNA stampo fosforilato.
Questa aggiunta prepara i frammenti di DNA per il processo di ligazione ad oligonucleotidi adattatori, che
presentano al 3’ una sporgenza di una singola base di timina per aumentare l’efficienza di ligazione.
Gli oligonucleotidi adattatori sono complementari agli oligonucleotidi ancorati alla cella a flusso.
In condizioni di diluizione limite, il DNA stampo a singolo filamento legato agli adattatori è aggiunto alla
cella a flusso e immobilizzato mediante ibridazione agli oligonucleotidi di ancoraggio.
A differenza della PCR in emulsione, i frammenti di DNA sono amplificati nella cella a flusso mediante una
amplificazione “a ponte” (“bridge amplification”), che si basa sulla cattura dei filamenti di DNA ripiegati ad
arco che si ibridano a un oligonucleotide di ancoraggio adiacente.
Cicli multipli di amplificazione convertono la singola molecola di DNA stampo in un “cluster” di frammenti
ripiegati, amplificati clonalmente, ciascuno composto approssimativamente da 1000 ampliconi clonali.
In una singola cella a flusso possono essere generarti circa 50 x 106 “cluster” separati.
Per il sequenziamento, i “cluster” sono denaturati e una successiva reazione di scissione chimica e lavaggio
consente di ottenere solo i filamenti “senso” (“forward”).
Il sequenziamento dei filamenti “senso” avviene mediante l’ibridazione di un “primer” complementare alla
sequenza dell’oligonucleotide adattatore; successivamente, si ha l’aggiunta di una DNA polimerasi e di una
miscela di 4 nucleotidi terminatori “reversibili” marcati con fluorofori differenti.
I nucleotidi terminatori sono incorporati in base alla complementarità della sequenza di ciascun filamento,
all’interno di ogni “cluster” clonale.
Dopo l’incorporazione, i reagenti in eccesso vengono rimossi con un lavaggio e la fluorescenza relativa ad
ogni “cluster” viene rilevata e registrata.
Mediante successivi passaggi, il gruppo di blocco dei nucleotidi terminatori “reversibili” viene rimosso e la
marcatura fluorescente viene allontanata tramite un lavaggio, consentendo di effettuare il ciclo successivo di
sequenziamento.
Questo processo iterativo di “sequenziamento per sintesi” richiede circa 2,5 giorni per generare “reads” di
36 bp di lunghezza.
Con 50 x 106 “cluster” per ogni cella a flusso vengono prodotte più di un miliardo di basi (Gb) per ogni
seduta analitica.
Il vantaggio di questa tecnica è che mi dà la possibilità di sequenziare contemporaneamente, velocemente e
con un’alta efficienza qualsiasi molecola di DNA, gene o gruppo di geni, ma il problema è l’elaborare i dati
forniti dalla macchina.
La macchina fornisce una serie di nucleotidi letti durante i cicli.
Di conseguenza, uno studioso tramite dei software, si occuperà dello studio e l’allineamento di queste
sequenze tramite le banche dati in cui sono contenute le sequenze di questi geni.

Allineamento delle sequenze e confronto con le sequenze di riferimento


Se consideriamo due geni che sono associati a delle cardiomiopatie e valutiamo la differenza fra NGS e
Sanger, notiamo che abbiamo una sequenza nota che è quella che si trova dai database e, il software, tutte le
sequenze che derivano o da un singolo cluster clonare o da un altro cluster clonale che contiene sempre il
frammento che si riferisce a questo gene, vengono messe le une sotto le altre per verificarne l’allineamento
delle sequenze e la corrispondenza delle basi azotate.
Le alterazioni o mutazioni vengono segnati mettendole in evidenza.
In quest’analisi la sequenza viene letta, proprio perché si creano i cluster clonali, tantissime volte e quindi
questo mi dà la certezza che la successione delle basi che ho ottenuto è corretta.
Dunque, se la mutazione che ho la osservo in più letture, vuol dire che c’è una mutazione reale e non è un
errore della polimerasi.

Le possibili applicazioni in campo clinico di queste nuove tecnologie che stanno iniziando ad essere più
utilizzate trovano applicazione nel sequenziamento di un intero genoma e quindi acquisire delle
informazioni che possono essere traslate in campo clinico.
può essere utilizzato analizzando il sequenziamento della porzione codificante detto anche esoma.
Permette anche di fare diagnostica ad alta processività, dove per processività intendiamo poter lavorare e
ottenere dai dati su un numero di campioni molto ampio in un tempo molto breve.
L’NGS ci permette di analizzare l’intero genoma ma può essere utilizzata anche per analizzare una piccola
parte dell’intero genoma.
Inoltre, si può anche partire dal genoma per avere delle info su regioni ben determinate.

Queste piattaforme possono essere utilizzate per l’analisi dell’esosoma.


L' esosoma è la parte del genoma che in grado di esprimere per una proteina: è la fetta codificante del
genoma.
L' esosoma umano contiene circa 180.000 ai suoni che costituiscono circa il 2% del genoma e si stima che
contenga fino all' 85% di tutte le mutazioni patogene.
Pertanto, il suo sequenziamento rappresenta un approccio efficace e molto meno costoso rispetto al
sequenziamento dell'intero genoma.
Il sequenziamento dell’esosoma di un individuo ha oggi due alternative:
-Whole exome sequencing, ossia sequenziare tutti i 20.000 geni del genoma umano;
-Clinical exome sequencing, sequenziare circa i 6mila geni fino ad ora noti per essere associati a malattia.
Si può addirittura arrivare ad un Esoma Clinico Parziale, per esempio, considerando delle patologie di
origine genetica, questa è associata ad un gene ed andandolo a ricercare mi si ricollega nell’immediato alla
patologia.

Se io utilizzassi come approccio diagnostico, per una valutazione genetico clinica di una malattia che si
manifesta con un fenotipo specifico e bassa eterogenicità genetica, il sequenziamento di singoli geni con il
metodo di Sanger noterei che il quadro sintomatologico e le indagini precedenti chiamano in causa una
condizione associata ad un singolo gene; quindi, avrebbe un senso.
Se invece io utilizzassi per:
-un fenotipo specifico con elevata eterogeneità genetica
-per un fenotipico non specifico dove il quadro clinico può riflettere varie condizioni con sintomatologia
sovrapposta
-per un fenotipo altamente aspecifico dove la sintomatologia può riflettere due o più condizioni distinte
nello stesso paziente, dunque vi è l'impossibilità di formulare un sospetto clinico
il sequenziamento di Sanger non avrebbe senso.
Infatti, rapidamente si sta passando ad un uso di exam sequencing per tutti questi casi.

L'avanzamento di queste tecnologie risiede anche sul fatto che nelle analisi è possibile utilizzare delle
matrici biologiche come per esempio la saliva.
Oggi il costo dell’analisi del genoma è divenuto molto più accessibile e da diversi centri viene offerta come
servizio.
Inoltre, questa analisi facendo seguito alle leggi approvate in agosto 2016 dovrebbe essere chiesta come
screening neonatale obbligatorio.

Quindi con la WHOLE EXOME SEQUENCING (WES) si ha il sequenziamento di tutti i tratti del genoma
che codificano proteine (< 2% del genoma di un individuo); si stima che l’esoma debba contenere circa
l’85% delle mutazioni associate a patologia.
Vi è un nuovo approccio per l’individuazione di nuovi geni-malattia: in particolar modo con le nuove
strategie si considerano i pazienti singoli o al massimo i genitori, si fa il sequenziamento dell’esoma, si
vanno a ricercare le varianti, si agisce attraverso un filtraggio e si individuano i geni ossia le mutazioni
candidate.
Bisogna effettuare IL WHOLE EXOME SEQUENCING quando:
-Il fenotipo clinico o la storia familiare indicano fortemente una causa genetica, ma il fenotipo non
corrisponde ad una malattia in cui esiste già un gene responsabile.
-Un paziente con una probabile malattia genetica è già stato analizzato per tutti i geni noti ma non si è giunti
ad una diagnosi.

Se consideriamo delle malattie come, per esempio, l’adenocarcinoma polmonare si è visto che dal 2004
dove i geni responsabili erano solamente due, si è passati al 2012 dove grazie a queste nuove tecnologie, è
stato possibile individuare diverse mutazioni di geni a cui è correlabile la malattia.
Implementazione del TEST GENETICO in termini di sensibilità, riduzione dei costi e dei tempi di analisi
per TEST GENETICI MALATTIA-SPECIFICI
Applicazioni:
✓ Diagnosi molecolare in malattie associate a mutazioni in geni di grandi dimensioni non approcciabili
mediante sequenziamento Sanger
✓ Diagnosi molecolare per malattie a ereditarietà multigenica: il target resequencing è destinato a diventare
una pratica standard dato l’alto beneficio in termini di costo-detection rate della tecnologia NGS (es.
cardiomipatia, ritardo mentale X-linked, retinite pigmentosa):
- Pannelli che includono numerosi geni, selezionati in base alla correlazione con la patologia in esame.
Approccio indicato per lo studio di malattie ad elevata eterogeneità genetica

Se consideriamo malattie come l’OSTEOGENESI IMPERFETTA: malattia delle ossa fragili; è una
patologia rara genetica caratterizzata da una forte eterogeneità genetica (causata cioè da 16 potenziali geni).
Anche prima della NGS erano stati riscontrati dei geni, ma la visione si è ampliata con l’NGS.
Altre patologie che hanno un eterogeneo cita genica sono le cardiomiopatie che possono essere strutturali e
la mutazione interessa 62 geni, le cardiomiopatie dilatative 35 geni e le cardiomiopatie da non
compattazione delle ventricolo sinistro che interessa la mutazione di 11 geni.

Ovviamente vi sono dei benefici e dei rischi nell’effettuare dei test genetici; tra i BENEFICI riscontriamo:
✓ formulazione o conferma della diagnosi clinica
✓ disponibilità di informazioni prognostiche
✓ prevenzione di possibili complicanze (MEDICINA PREDITTIVA)
✓ potenziale beneficio terapeutico, TRATTAMENTO PERSONALIZZATO
✓ riduzione di indagini inutili

Tra i RISCHI ritroviamo:


✓ conoscenza di condizioni prive di alcun approccio terapeutico
✓ difficoltà interpretative del dato, confusione tra rischio e certezza, tra mutazione e malattia
✓ quali risultati comunicare? A chi?
✓ nuove problematiche etiche (i risultati ottenuti rappresentano una condizione permanente dell’individuo e
possono influenzarne le scelte riproduttive e avere importanti ricadute sul soggetto in esame e su altri
membri della famiglia).

IL CLONAGGIO E LA CLONAZIONE
Il clonaggio consiste nella produzione in molte copie di una molecola di DNA ricombinante.
Per fare questo il DNA ricombinante deve essere inserito in cellule ospiti che vengono chiamate
transgeniche. Per riconoscere le cellule contenenti DNA ricombinante si possono usare geni reporter di cui si
conosce il fenotipo, che servono dunque da marcatori genetici.
Per trasportare il DNA ricombinante all’interno di una cellula ospite si usano vettori che possono essere
plasmidi, virus o cromosomi artificiali di lievito.
I plasmidi sono:
-molecole circolari di DNA che contengono alcuni geni (da uno a decine)
-presenti naturalmente nelle cellule batteriche, alle quali conferiscono caratteristiche peculiari
-utilizzati in natura dai batteri per favorire il trasferimento di informazioni da una cellula all’altra
-in grado di trasportare un frammento genetico da un organismo all’altro (vettori)

I vettori di espressione: produzione di proteine


Quando si delinea l’idea di creare una molecola di DNA ricombinante e di trasferirla in un organismo ospite
per ottenere più copie, uno degli obiettivi principali è di permettere a quella specie di esprimere quel DNA,
quindi esprima la mia proteina.
Questo processo è alla base delle formulazioni di farmaci biotecnologici su base proteica.
Il mio vettore deve essere quindi un vettore di espressione, il quale mi permette, una volta che il DNA è
stato inserito nella cellula, che possa essere trascritto e tradotto ottenendo una proteina finale funzionale.
Quindi fondamentalmente un vettore di espressione comprende la sequenza necessaria per la trascrizione e
la traduzione da parte della cellula ospite.
Il gene estraneo viene inserito in corrispondenza di un sito di restrizione in cui è presente un promotore che
mi permette il legame dell’RNA polimerasi e la sequenza che riconosce il ribosoma e mi permette la
traduzione dell’mRNA.

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1. L’iperproduzione del fattore della coagulazione VIII viene prodotto attraverso un sistema che va uso di due
cromosomi ricombinanti:
- Il cromosoma di una cellula di E. coli ingegnerizzata contiene il gene della RNA polimerasi di T7
sotto il controllo del promotore lac.
- Da una sequenza di cDNA del fattore VIII sotto il controllo del promotore tardivo dell’RNA
polimerasi di tipo T7.
Questa polimerasi è una RNA polimerasi in grado di catalizzare la sintesi di un filamento di RNA in senso
nella direzione 5’3’, cioè pronto per essere tradotto.
Si aggiunge nel terreno di coltura una sostanza ITPFG che induce e si lega al promotore lac e di
conseguenza viene trascritto il gene per la polimerasi t 7 che comincia ad aumentare la sua concentrazione
all'interno del batterio punto
L’RNA polimerasi all’interno della cellula incontrerà l'altro plasmide che contiene il suo promotore, quindi
riconosce questa sequenza, il promotore si trova a valle del DNA che voglio che la cellula produca.
Appena l’RNA polimerasi si va a legare al suo promotore inizia la trascrizione del frammento di RNA e una
volta che l’mRNA viene trascritto, viene prodotto e all’interno della cellula batterica aumenta il fattore VIII.

2. Per l’iperproduzione dell’insulina umana si parte da due plasmidi con una catena A e una catena B.
Si ha il promotore di trascrizione batterico.
Si utilizza un gene reporter che mi permette di recuperare queste due catene.
Le catene A e B dell’insulina sono sintetizzate come proteina di fusione con la BETA-Galattosidasi.
Il gene viene messo consecutivamente rispetto le due catene, e alla fine, succede che quando l’RNA
polimerasi del batterio comincia a trascrivere l’mRNA, crea un mRNA unico che contiene la proteina BETA
e la catena o A o B.
Si procede inserendo il batterio in un terreno di coltura che mi permette di avere tanti cloni e la molecola di
insulina viene purificata come proteina di fusione poiché per come è stato costruito il vettore, attaccata alla
catena di insulina è attaccata la proteina BETA.
Nel punto di contatto tra la sequenza amminoacidica della beta e alla catena di A o B c’è una sequenza di
aminoacidi.
Aggiungendo un reattivo a questo si ottiene il taglio in corrispondenza della metionina ottenendo la
separazione della proteina di funzione e si purificano le due catene A e B.
Si permette a queste catene di ripiegarsi, vengono modificate, e otteniamo la molecola di insulina matura.

Esistono tre tipi di clonazione:


- Clonazione embrionale: è simile al processo che produce gemelli identici.
Le cellule vengono rimosse da un embrione fecondato e incoraggiati a sviluppare in duplice copia embrioni
con DNA identico.
- La clonazione riproduttiva mira a creare una copia di un animale esistente.
Il DNA viene rimosso dal nuovo e sostituito con il DNA ha prelevato da un animale adulto, facendo un
gemello genetico.
Poi l'uovo fecondato viene impiantato in un utero che permette di sviluppare un nuovo animale identico al
primo.
- La clonazione terapeutica: segue le stesse fasi iniziali della clonazione riproduttiva, ma una volta che la
copia di pre-embrioni è stata creata le cellule staminali vengono rimosse.
Le cellule staminali possono svilupparsi in qualsiasi tipo di cellula, così ricercatori sperano di raccoglierla e
utilizzarle.
Questo tipo di clonazione ha come fine la produzione di cellule tessuto somatici con un genoma nucleare
identico quello della cellula di partenza, anche se non corrisponde alla vera e propria formazione
dell'embrione, perché è possibile interromperne la crescita molto prima, per la sola estrazione delle cellule
staminali.
È definita terapeutica perché grazie a destra si possono curare molte patologie alle quali non si sono trovate
altre terapie

La clonazione riproduttiva è definita anche con l’acronimo SNCT ed è una tecnica che combina una cellula
uovo enucleata con il nucleo di una cellula somatica per creare un embrione.
Il caso della pecora Dolly
Il primo esempio di clonazione animale fu il caso della pecora dolly.
Nel 1997 per la prima volta si riuscì a clonare con successo un mammifero partendo da una cellula somatica
adulta.
Questo esperimento mira a creare una copia di un animale esistente.
Il nucleo di una cellula uovo viene rimosso e sostituito con il nucleo di una cellula adulta.
In seguito, l’embrione derivato dalla cellula uovo viene impiantato in un utero di una madre surrogata, così
da generare un nuovo animale identico al primo (donatore).
Per la clonazione della pecora dolly è stata presa la cellula proveniente dalla mammella di una pecora A e
una cellula uovo viene rimossa da una pecora B.
Il nucleo viene rimosso dalla cellula uovo e le cellule provenienti dalla mammella vengono mantenute in un
mezzo di coltura privo di nutrienti per arrestare il ciclo cellulare nella fase che precede la duplicazione del
DNA.
La cellula della mammella, quindi la cellula donatore, viene fusa con quella enucleata vi sono degli induttori
che stimolano la mitosi e provocano la divisione cellulare sviluppando un embrione che viene impiantato
nell'utero di una pecora ospite.

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