L’osservazione al microscopio ottico ha come fine l’esame morfologico di cellule e

tessuti e può essere di due tipi:

 Osservazione in vivo
 Osservazione di campioni non vitali
L’osservazione in vivo consente di osservare cellule vive, non trattate e segue gli eventi
dinamici degli organismi, come, ad esempio, lo sviluppo embrionale o la mitosi.
L’osservazione di campioni non vitali invece, consente al meglio lo studio della
morfologia interna della cellula. È molto più utilizzata, in quanto i campioni vengono
trattati in modo tale da evitare, in seguito all’uccisione, la decomposizione e preservare
le loro caratteristiche. Il campione si conserva nel tempo consentendo un maggior
numero di osservazioni. Le fasi fondamentali per allestire un preparato istologico
sono:
 Prelievo
 Fissazione
 Disidratazione e diafanizzazione
 Inclusione
 Sezionamento
 Colorazione
Prima di effettuare il prelievo, un organismo viene sacrificato o anestetizzato.
In seguito, utilizzando lame affilatissime, si procede a prelevare campioni di
determinati organi o tessuti da studiare. Per ottenere buoni preparati, è necessario che
il prelievo avvenga rapidamente, che il materiale sia molto fresco e che i pezzi non
superino 1 cm di diametro.

La fissazione minimizza la degradazione dei tessuti, conseguente alla rimozione del

tessuto dal suo ambiente vitale, in seguito alla variazione di temperatura e di pH.
Inoltre protegge dall'azione dei microrganismi che invadono il materiale biologico,
nutrendosi delle strutture non più in grado di proteggersi.
La fissazione favorisce l’osservazione e la colorazione, consente ai coloranti di
penetrare nei tessuti e di fissarsi a particolari strutture. Può essere fisica o chimica;
La fissazione fisica avviene tramite congelamento rapido del tessuto in azoto liquido.
La fissazione chimica avviene tramite aggiunta al campione di fissativi che variano a
seconda dei componenti che si intendono visualizzare meglio. Vi sono fissativi
coagulanti, in grado di coagulare le proteine come etanolo e acido acetico e fissativi
non coagulanti come la formaldeide.
La scelta del fissativo è molto importante e dipende dallo studio da effettuare.

Dopo essere stato lavato accuratamente con acqua, il campione viene immerso in
soluzioni contenente alcol etilico a concentrazioni via via maggiori (50%, 70%, 90%,
95%, 100%). Questo processo porta alla disidratazione del campione, che ha la
funzione di fare spazio alla paraffina (passaggio di inclusione) e rendere il tessuto
meno molle per facilitare il taglio.

Nella fase di diafanizzazione il campione viene immerso in xilolo che ha la funzione

sia di rimuovere il fissativo che non è miscibile con la paraffina e sia di rendere
trasparente il campione.
Dato che i tessuti biologici prelevati hanno perso la loro consistenza, devono essere
inclusi all’interno di materiali più resistenti, in modo tale da acquisire una maggiore
rigidità, ideale per il sezionamento. Per effettuare l’inclusione possono essere usate
diverse sostanze, per la microscopia ottica si utilizza generalmente paraffina. Il
campione viene immerso nella paraffina fusa (a 50 °C) e poi si lascia solidificare a
temperatura ambiente ottenendo così un blocchetto rigido contenente il campione e
pronto per essere sezionato.
(L’inclusione non è necessaria se è avvenuta la fissazione fisica.)
Il sezionamento consiste nella riduzione del campione, incluso in un blocchetto
solidificato, in fette da 1-20 micrometri, mediante un microtomo, in modo da avere
sezioni del campione penetrabili alla luce e dunque osservabili al microscopio. Le
sezioni vengono poi messe su un vetrino portaoggetti su cui precedentemente era
stata messa una sostanza adesiva e si lasciano ad asciugare.
Successivamente le sezioni vengono immerse nuovamente nello xilolo per rimuovere
la paraffina e vengono reidratate attraverso soluzioni con concentrazioni via via
decrescenti di alcol etilico. Il campione è poi immerso in acqua distillata. Questa fase è
essenziale per la colorazione.
La colorazione aumenta il contrasto delle diverse componenti cellulari e tissutali e ne
migliora la leggibilità. I coloranti usati in microscopia sono:
naturali se si trovano in natura d’origine animale o vegetale
(l’ematossilina è vegetale, ricavata dal legno di campeggio)
sintetici e si distinguono in basici e acidi. I coloranti acidi si legano a molecole con
caratteristiche basiche, come le proteine citoplasmatiche, mentre i coloranti basici si
legano a molecole con caratteristiche acide, come il DNA.
Un esempio è la colorazione Ematossilina e Eosina in cui si combina l’azione
dell’Emallume acido di Mayer e dell’Eosina.
La colorazione ematossilina eosina è la più comune colorazione utilizzata nel campo
dell’istologia.
Consiste in una doppia colorazione che può andare ad evidenziare determinati
componenti dei tessuti. Si basa sul diverso valore di pH dei vari tessuti e dei vari
organelli costituenti la cellula. Il nucleo e i vari componenti acidi del
citoplasma vengono colorati in viola/blu dall’ematossilina, mentre l’eosina colora in
rosa sostanze prevalentemente basiche come il citoplasma, il collagene e le membrane
cellulari.

Sappiamo che la maggior parte delle cellule sono invisibili ad occhio nudo dunque per
studiarle dobbiamo ricorrere al microscopio.
Il microscopio ottico è costituito da due sistemi di lenti inserite in un tubo portalenti.
La lente a cui appoggiamo l’occhio è detta oculare, mentre all’altra estremità del tubo,
vicino all’oggetto da osservare, troviamo l’obiettivo, in genere i microscopi hanno
almeno tre obiettivi, con diverso potere di ingrandimento. La funzione dell’obiettivo è
quella di ingrandire l’oggetto mentre l’oculare ingrandisce l’immagine prodotta
dall’obiettivo.
Inoltre il microscopio possiede anche un sistema di illuminazione e una struttura di
sostegno (stativo). Lo stativo unisce la parte superiore (che contiene il binoculare e gli
obiettivi) con la parte inferiore, che contiene l’apparato di illuminazione ed il tavolo
porta-vetrino.
Il sistema di illuminazione può essere costituito anche solo da uno specchio, situato
sotto l’oggetto da osservare.
Lo specchio riflette sull’oggetto la luce solare o quella di una lampada. Il sistema di
illuminazione può comprendere anche un condensatore, che concentra la luce
sull’oggetto, e un diaframma, che regola la quantità di luce riflessa.
Il campione da osservare, dopo aver attraversato tutte le fasi descritte
precedentemente, viene posto su un vetrino portaoggetti e coperto da un vetrino
coprioggetti. Il vetrino così preparato viene appoggiato sul tavolino portaoggetti, che
ha un foro che consente il passaggio della luce proveniente dallo specchio. La luce
raggiunge il vetrino e illumina il campione.
Per quanto riguarda il potere di risoluzione, che indica la capacità di distinguere come
separati due punti molto vicini, ricordiamo che L’occhio umano ha un potere di
risoluzione di circa 0,1 mm mentre il microscopio ottico ha un potere di risoluzione di
circa 0,3 millesimi di millimetro ossia 0,3 micron. Il microscopio ottico risulta più che
sufficiente per permetterci di osservare batteri, funghi, cellule umane e protozoi (ma
non i virus, che hanno appunto dimensioni al di sotto di questo limite). L’osservazione
di un qualunque campione inizia sempre con l’ingrandimento minimo (10x) ed in
seguito si sale gradualmente di livello ruotando il revolver. Ogni livello è fatto per
permettere l’osservazione dello stesso campione in modo diverso, pertanto è solo
l’analisi condotta nella sua interezza ad essere realmente affidabile.