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APPLICAZIONI BIOTECNOLOGICHE NEL

LABORATORIO CLINICO
EMATOLOGIA

Testo:

 R. Hoffman, E.J. Benz, Jr., L.E. Silberstein. HEMATOLOGY. BASIC


PRINCIPLES AND PRACTICE. 7th edition.

 G. Castoldi, V. Liso. core curriculum Ematologia. Seconda edizione.


Mc Graw Hill Education, (Italy), S.r.l. 2014

Docente: Gloria Margiotta Casaluci


gloria.margiotta@med.uniupo.it
2

MORFOLOGIA DELLE CELLULE DEL SANGUE


3
SANGUE

Connettivo specializzato: rappresenta il 5-7% del peso corporeo totale

Fluido viscoso, leggermente alcalino, pH 7.4

Colore rosso

Circola all’interno del distretto vascolare

• Componenente Liquida

• Componente Corpuscolata
4
LE COMPONENTI DEL SANGUE

Amino acids Albumins


Water

Proteins Globulins
Ions
Fibrinogen
Plasma Glucose
is
BLOOD composed Organic such as
of molecules Lipids

Trace elements Nitrogenous


and vitamins waste

CO2
Gases such as
O2
5
ELEMENTI DEL PLASMA

Il plasma è il liquido in cui sono sospese le cellule sanguigne.

Il plasma contiene proteine, nutrienti, prodotti del metabolismo,


ormoni e elettroliti inorganici.

1. Acqua >70%

2. Elettroliti (sodio Na+, potassio K+, Magnesio Mg, calcio Ca++)

3. Proteine
- Coagulazione (pro ed anticoagulanti)
- Funzione immunologica (anticorpi)
- Funzione di trasporto (transferrina, transcobalamina, aptoglobina,
lipoproteine)
- Albumina (pressione oncotica)
6
ELEMENTI CORPUSCOLATI

Reticulocyte Neutrophil Basophil Eosinophil Monocyte Lymphocyte


Platelets

Erythrocyte
Granulocytes
7
ELEMENTI CORPUSCOLATI

1. Globuli rossi, trasportano ossigeno e CO2, non hanno nucleo

2. Leucociti, cellule nucleate responsabili del sistema immunitario

- Attività fagocitica, identificate tramite colorazione dei granuli


(granulociti - neutrofili, basofili ed eosinofili - ) o per le caratteristiche
del nucleo (cellule mononucleari – monociti nel sangue, macrofagi
nei tessuti)
- Immunociti (linfociti B e T)

3. Piastrine, anucleate, mediano emostasi


CONTA MANUALE DEGLI ELEMENTI DEL 8

SANGUE
9
CONTA MANUALE DEGLI ELEMENTI DEL
SANGUE
Tipo Fluido Diluizione Profondità Area di
cellulare diluente conta
Leucociti Acido 1:20 10x 4mm2
acetico
Eritrociti Isotonica 1:100 10x 9mm2
Piastrine Ammonio 1.100 40x 1mm2
ossalato

Elementi contati x fattore di diluizione

Area di conta (mm2) x profondità

96 x 20
= 4800/mm2
4(mm2) x 0.1
CONTA AUTOMATIZZATA DEGLI 10

ELEMENTI DEL SANGUE


CONTA AUTOMATIZZATA DEGLI 11

ELEMENTI DEL SANGUE


CONTA AUTOMATIZZATA DEGLI 12

ELEMENTI DEL SANGUE

Contatore Counter ad impedenza Contatore a diffusione luminosa


13
ESAME
EMOCROMOCITOMETRICO
Conta Degli Elementi Corpuscolati Del Sangue: Leucociti
(WBC), Globuli Rossi, Piastrine

Concentrazione dell’emoglobina (Hb)

Ematocrito (Hct)

Indici Eritrocitari (Mcv, Mch, Mchc)

Conta Differenziale Dei Leucociti (Granulociti Neutrofili,


Basofili, Eosinofili, Linfociti, Monociti)
EMOGLOBINA, EMATOCRITO ED 14

INDICI ERITROCITARI
Emoglobina (Hb):
unità di misura= gr/dl
N= ≥ 13.5 gr/dl (M) ≥12 gr/dl (F)

Determinazione dell’Hb:
Diluente per lisi degli eritrociti aggiunto a volume noto di sangue

Determinazione della concentrazione di Hb in base alla


densità ottica della soluzione di Hb o di un suo derivato ad
una determinata lunghezza d’onda

Lettura con comuni tecniche colorimetriche o


con strumenti automatizzati
EMOGLOBINA, EMATOCRITO ED 15

INDICI ERITROCITARI
Ematocrito (Hct)
unità di misura = %
N = 42-50% (M) 37-48% (F)
58%
Determinazione dell’Hct = plasma
volume
volume massa eritrocitaria/volume di plasma
100%

Centrifugazione del campione a velocità tale da <1%


white
ottenere grado standard di impaccamento degli cells

eritrociti
42%
packed
Determinazione della altezza raggiunta dai globuli rossi red cell
volume
in provette graduate
16
PARAMETRI ERITROCITARI
MCV (v. n. 80-100 fL oppure µ3) Hct x 100 / numero g.r. Diretto
mean corpuscular volume
80-100 fL RBC normocitici
> 100 fL RBC macrocitici
< 80 fL RBC microcitici
NB! pseudomacrocitosi : reticolociti ed agglutinine
MCH (v. n. 25-35 pg) Hb x 100 / numero g.r. Calcolato
mean corpuscular hemoglobin
25-35 pg RBC normocromici
< 25 pg RBC ipocromici
> 35 pg in associazione a megaloblastosi
MCHC (v. n. 31-37 g/dL) Hb x 100 / Hct Calcolato
mean corpuscular hemoglobin concentration
31-37 g/dL RBC normocromici
< 31 g/dL RBC ipocromici
> 37 g/dL sferocitosi
NB! I RBC NON possono accomodare > 37 g/dL di Hb
LA CONTA DELLE CELLULE DEL SANGUE: 17
ESAME EMOCROMOCITOMETRICO
WBC 7.29 x mille/ul 4-10
RBC 4.5 x milione/ul 3.8-5.2
Emoglobina 13 gr/dL 12-15.5
Ematocrito 42 % 36-46
MCV 87.9 fl 82-98
MCH 27.1 pg 27-32
MCHC 30.8 g/dL 32-36
Piastrine 270 x mille/ul 150-450

neutrofili 70% %
neutrofili 4.9 x mille/ul 2.0-6.0
linfociti 20% %
linfociti 1.4 x mille/ul 1.5-4.0
monociti 8.8 %
monociti 650 x mille/ul 0.2-1.0
eosinofili 0.7 %
eosinofili 0.4 x mille/ul 0-.5
basofili 0.5 %
basofili 0.2 x mille/ul 0-0.2
18
VITA MEDIA DELLE CELLULE DEL
SANGUE
MIELOPOIESI 1. Granulopoiesi e neutrofili: 10 h
monocItopoiesi
2. Eritropoiesi emazie: 120 giorni
3. Trombocitopoiesi piastrine: 10 giorni

LINFOPOIESI 1. cellule B da pochi giorni fino a


2. cellule T centinaia di giorni
(cellule memoria)
ESAME DEL SANGUE PERIFERICO 19

(VETRINO)

Fornisce informazioni critiche circa la morfologia


degli elementi cellulari e delle piastrine del sangue.
Di routine, viene usato un preparato fissato e colorato
(Giemsa)
ESAME DEL SANGUE PERIFERICO 20

(VETRINO)

1. Morfologia delle emazie (colorazione, corpi inclusi, contenuto


emoglobinico)

2. Morfologia dei globuli bianchi. Presenza di cellule immature


con shift verso sinistra (incremento dei neutrofili a banda),
iper- o iposegmentazione, inclusioni leucocitarie, linfociti
atipici, batteri

3. Morfologia delle piastrine. Presenza di piastrine giganti,


riduzione del numero piastrinico
21
22
ALLESTIMENTO DELLO STRISCIO DI
SANGUE PERIFERICO
23
ALLESTIMENTO DELLO STRISCIO DI
SANGUE PERIFERICO
Ideale 24

Non accettabile
LA MORFOLOGIA DELLE CELLULE DEL 25
SANGUE:
COLORAZIONE
MAY GRUNWALD= soluzioneMAY-GRUNWALD-GIEMSA
di blu di metilene e eosina in alcol metilico

GIEMSA= soluzione di eosina e azur B


Le fasi della colorazione Osservazioni
Versare sullo striscio di sangue preventivamente disseccato 1 In questa fase, essendo il colorante in soluzione di alcool
ml di liquido di May-Grunwald e attendere 3 minuti. metilico, si ha la fissazione del tessuto.
Si diluisce il liquido con 2 ml di acqua distillata e si lascia agire
per 5 - 6 minuti.
Si getta via il colorante senza sciacquare.
Si copre il vetrino con 3 ml di acqua distillata e si aggiungono 3
gocce di soluzione di Giemsa. Si attende 7 minuti.
Lavaggio con abbondante acqua, meglio sotto il getto di un
rubinetto.
Si asciuga con carta da filtro a temperatura ambiente e, se Occorre più di una goccia di balsamo per ricoprire quasi
vogliamo un preparato permanente, si pone nel primo xilolo e si completamente la superficie dello striscio con un vetrino
monta in balsamo sintetico. coprioggetto di 24 x 52 mm.
Si ottengono i seguenti risultati:
Nuclei Rosso violaceo
Citoplasmi basofili Blu
Citoplasmi acidofili Rosso
Granuli azzurrofili delle cellule linfoidi Porpora
Granuli azzurrofili delle cellule mieloidi Violetto
Granuli neutrofili Marrone - bluastro
Granuli eosinofili Rosa intenso
Granuli basofili Blu oltremare
ERITROCITI 26
ERITROCITI 27

Dimensioni circa 8x2 micrometri


Nucleo: Non-nucleati, nucleo perso durante
la maturazione.
Forma: disco biconcava
Citoplasma: Emoglobina, ATP, lipidi
28
ANOMALIE DIMENSIONALI DEI GLOBULI
ROSSI:
ANISOCITOSI
Normale Microcitosi Macrocitosi
ANOMALIE MORFOLOGICHE DEI 29
GLOBULI ROSSI: POICHILOCITOSI

Acantociti Poche spicole larghe Cirrosi, uremia, HUS


Dacriociti Forma a goccia Talassemia, Mielofibrosi, anemia
emolitica
Drepanociti Forma a falce Drepanocitosi o altre emoglobinopatie

Schistociti Forma ad elmetto DIC, TTP, protesi valvolari


Sferociti Forma a sfera Emolisi (ereditaria e non)
Stomatociti Forma a “bocca” del Emolisi acquisita o ereditaria
pallore centrale
Formazione di rouleau “monete impilate” MM, Waldenstrom
Inclusione di corpuscoli
Emazie nucleate Nucleo picnotico Sanguinamento acuto, emolisi severa

Corpi di Howell-Jolly Piccole formazioni Anemia megaloblastica,


rotondeggianti asplenia,emolisi
Corpi ad anello di Anelli o figure a “8” Emolisi severa
Cabot
ANOMALIE MORFOLOGICHE DEI GLOBULI 30

ROSSI
POICHILOCITOSI
Sferociti Target cell Acantociti Echinociti Dacriociti Schistociti

Macroovalociti Ellissociti Ipocromia Policromasia Punteggiatura Corpi di


Basofila Howell-
Jolly

Cellule a falce
Eritroblasti
Rouleaux
ANISO-POICHILOCITOSI ERITROCITARIA 31
RETICOLOC 32

ITI
GRANULOCIT 33

Granulocita Granulocita Granulocita


neutrofilo eosinofilo basofilo

Dimensioni: 12-15 micrometri


Nucleo: multilobato (2-5 lobuli)
Cromatina: addensata
Nucleoli: assenti
Citoplasma: contenente granuli distinti in primari, secondari e terziari in
base al timing di maturazione, al contenuto e alla funzione
GRANULOCITA 34

NEUTROFILO
35
ULTRASTRUTTURA DEI GRANULOCITI
NEUTROFILI

Nuclei
Centriolo
Granuli
GRANULOCITA 36

EOSINOFILO
37
GRANULOCITA BASOFILO
ANOMALIE MORFOLOGICHE DEI 38

GRANULOCITI
Nucleo Nucleo Citoplasma
ipersegmentato iposegmentato ipergranulato
Citoplasma
ipogranulato
Citoplasma
vacuolizzato Corpi di Döhle

Elementi immaturi
MONOCITI 39

Dimensione: 12-18 μm (sono i globuli bianchi più voluminosi)


Nucleo: eccentrico, voluminoso, reniforme
Cromatina: addensata
Nucleoli: assenti
Citoplasma: scarsi granuli
MONOCITI 40
ULTRASTRUTTURA DEI MONOCITI 41
LINFOCITA 42

Dimensione: 7-15 micrometri


Nucleo: rotondeggiante
Cromatina: molto addensata
Nucleoli: assenti
Citoplasma: scarso (si riduce a un sottile anello)
Granuli: scarsi
LINFOCITA 43
ULTRASTRUTTURA DEI LINFOCITI 44
ANOMALIE MORFOLOGICHE DEI 45

LINFOCITI
Linfocito
Normale Linfoplasmacita Viriocita
granulato
LINFOCITOSI: DD MORFOLOGICA 46

CLL MCL LGL Leukeima

LINFOCITOSI
HCL
PLL

Viral infection SMZL


ALL
PIASTRINE 47

Dimensione: 2-4 micrometri


Nucleo: assente
Tondeggianti o ovali
Citoplasma: Ialomero (zona chiara periferica) e Granulomero (zona
centrali di colore rosso-violetto)
ULTRASTRUTTURA DELLE PIASTRINE 48
MORFOLOGIA PIASTRINICA 49

Morfologia normale

Microaggregati piastrinici
Satellitismo
ANOMALIE MORFOLOGICHE DELLE 50

PIASTRINE
Macrotrombociti Piastrine agranulate

Microtrombociti
EMATOPOIESI 51

Pluripotent Hematopoietic Stem Cell


BONE MARROW

Uncommitted Stem Cells

Committed Progenitor Cells


Lymphocyte
stem cells

Erythroblast
Megakaryocyte
EMATOPOI 52

ESI
BONE MARROW

Erythroblast
Megakaryocyte
CIRCULATION

Reticulocyte

Erythrocyte Platelets Neutrophil Monocyte Basophil Eosinophil Lymphocyte


EMATOPOIESI 53

Il termine emopoiesi o ematopoiesi si riferisce alla formazione e alla


maturazione di tutti i tipi di cellule del sangue a partire dai loro
progenitori

(1) Proliferazione delle cellule progenitrici, che sono mantenute


dalle cellule staminali

(2) Differenziazione delle cellule progenitrici, nelle componenti


cellulari del sangue
L’ENTITÀ DEL FENOMENO EMOPOIESI 54

 In condizioni normali, ogni ora sono prodotti:

1010 globuli rossi,


109 globuli bianchi
24/24 ore per tutta la vita
 In condizioni di stress (perdita acuta di sangue, infezione) i fabbisogni
aumentano di 10 volte e oltre
 Le cellule prodotte dal midollo sono in grado di funzionare in tutti i
distretti dell’organismo in modo autonomo
MIDOLLO 55

OSSEO

Bone
marrow
STRUTTURA DEL MIDOLLO 56

EMOPOIETICO
Cavità compartimentalizzate da trabecole ossee, contenenti cellule
adipose, parenchima (progenitori e precursori ematopoietici) e cellule stromali,
con un complesso sistema vascolare (arteriole midollari e corticali, rete
sinusale, seno centrale)

Tale sistema vascolare è permeabile alle cellule ematiche mature per la


presenza di pori di migrazione beanti sulla parete sinusale (passaggio per
processo "attivo")
MIDOLLO 57

OSSEO
Central sinus Bone
cortex

Stroma of
marrow

Venous Radial Nutrient


sinuses artery artery
MIDOLLO 58

OSSEO
MIDOLLO 59

OSSEO
MIDOLLO OSSEO 60
MIDOLLO 61

OSSEO
Mature blood cells squeeze
Stem cell
through the endothelium to
reach the circulation.

Platelets
Reticulocyte
expelling
nucleus
Mature
neutrophil

Fragments of megakaryocyte
break off to become platelets.

Reticular Venous sinus


fiber
Reticular cell

Stem cell Macrophage

Monocyte
The stroma is composed of
fibroblast-like reticular cells,
collagenous fibers, and Lymphocyte
extracellular matrix.
ESAME DEL MIDOLLO OSSEO 62
ASPIRATO 63

MIDOLLARE
ASPIRATO 64

MIDOLLARE
ASPIRATO 65

MIDOLLARE
EMATOPOI 66

ESI
ASPIRATO 67

MIDOLLARE
ASPIRATO 68

MIDOLLARE
ASPIRATO 69

MIDOLLARE
ASPIRATO 70

MIDOLLARE
ASPIRATO 71

MIDOLLARE
ASPIRATO 72

MIDOLLARE
MORFOLOGIA A BASSO INGRANDIMENTO 73
DEI FRUSTOLI DELL’ASPIRATO
MIDOLLARE
MIDOLLO OSSEO: VARI STADI DI 74
MATURAZIONE MIELOIDE
MIDOLLO OSSEO: VARI STADI DI 75
MATURAZIONE MIELOIDE
ASPIRATO MIDOLLARE E 76

BIOPSIA OSTEO-MIDOLLARE
BIOPSIA OSTEO- 77

MIDOLLARE
BIOPSIA OSTEO- 78

MIDOLLARE
Vantaggi rispetto all’aspirato: valutazione dell’osso
midollare con struttura conservata. E’molto utile
perché mantiene il microambiente midollare; permette di
valutare:
- la cellularità midollare
- la morfologia cellulare
- l’architettura midollare
- indagini immunoistochimiche
- lo stroma
BIOPSIA OSTEO- 79

MIDOLLARE
BIOPSIA OSTEO- 80

MIDOLLARE
BIOPSIA OSTEO- 81

MIDOLLARE
BIOPSIA OSTEO- 82

MIDOLLARE
ISTOLOGIA DEL MIDOLLO OSSEO 83
ISTOLOGIA DEL MIDOLLO OSSEO 84

Normocellulare Aplasia
ISTOLOGIA DEL MIDOLLO OSSEO 85
CELLULARITÀ 86
MIDOLLARE
Normocellulare Ipocellulare

Ipercellulare
MIELOGRAMMA 87
LA MORFOLOGIA DELLE CELLULE DEL 88
SANGUE: COLORAZIONE MAY-
GRUNWALD-GIEMSA
CSE
SCF CFU-GEMM 89
SCF,
TPO
SCF ,I L-3
IL-3
SCF, EPO, GM-CSF
CFU-Meg
BFU-E SCF
IL-3
EPO CFU-GM
CFU-E IL-3 CFU-G TPO
F GM-C IL-6
G-CS SF CFU-M
Proeritroblasto
M-CSF
Monoblasto Megacarioblasto
EPO
Mieloblasto
Eritroblasto
basofilo
EPO TPO
Eritroblasto IL-11
Promielocita Promonocita
policromatofilo Megacariocita

Eritroblasto
ortocromatico
Mielocita
Reticolocita
Monocita Piastrine

Eritrocita Granulocita
MATURAZIONE DELLA SERIE 90

ERITROIDE
Eritroblasto Eritroblasto Eritroblasto
basofilo policromatofilo ortocromatico Reticolocita
Proeritroblasto
E1 E2 91
E3

E3
E4 E5
Extrusion Polychromasia 92

Reticulocytes Erythrocytes
CSE CFU-GEMM
SCF 93
SCF,
TPO
, IL-3 ,I L-3
SCF, EPO SCF
GM-CSF
CFU-Meg
BFU-E SCF
IL-3
EPO CFU-GM
CFU-E IL-3 CFU-G GM-C TPO
SF
F IL-6
G-CS CFU-M
Proeritroblasto
M-CSF
Monoblasto Megacarioblasto
EPO
Mieloblasto
Eritroblasto
basofilo
EPO TPO
Eritroblasto IL-11
Promielocita Promonocita
policromatofilo Megacariocita

Eritroblasto
ortocromatico
Mielocita
Reticolocita
Monocita Piastrine

Eritrocita Granulocita
MATURAZIONE DELLA SERIE 94

GRANULOCITARIA

Cellula a Granulocita
Mieloblasto Promielocita Mielocita Metamielocita banda segmentato
PROMIELOCITA 95

PRECOCE
PROMIELOCITA 96

TARDIVO
PROMIELOCIT 97

A
98
MIELOCITA
METAMIELOCITA 99
CSE
CFU-GEMM 100
SCF,
TPO
, IL-3 ,I L-3
SCF, EPO SCF
GM-CSF
CFU-Meg
BFU-E SCF
IL-3
EPO CFU-GM
CFU-E IL-3 CFU-G TPO
F GM-C IL-6
G-CS SF CFU-M
Proeritroblasto
M-CSF
Monoblasto Megacarioblasto
EPO
Mieloblasto
Eritroblasto
basofilo
EPO TPO
Eritroblasto IL-11
Promielocita Promonocita
policromatofilo Megacariocita

Eritroblasto
ortocromatico
Mielocita
Reticolocita
Monocita Piastrine

Eritrocita Granulocita
MATURAZIONE DELLA SERIE 101

MONOCITARIA

Monoblasto Promonocita Monocita MO Monocita SP Macrofago


MONOBLASTI 102
PROMONOCITI 103
ANOMALIE MORFOLOGICHE DEI 104

PROGENITORI MIELOIDI
ANOMALIE MORFOLOGICHE DEI 105
PROGENITORI MIELOIDI
ANOMALIE MORFOLOGICHE DEI 106

PROGENITORI MIELOIDI: AUER


RODS
ANOMALIE MORFOLOGICHE DEI 107
PROGENITORI MIELOIDI
CSE
CFU-GEMM 108
SCF,
TPO
, IL-3 ,I L-3
SCF, EPO SCF
GM-CSF
CFU-Meg
BFU-E SCF
IL-3
EPO CFU-GM
CFU-E IL-3 CFU-G TPO
F GM-C IL-6
G-CS SF CFU-M
Proeritroblasto
M-CSF
Monoblasto Megacarioblasto
EPO
Mieloblasto
Eritroblasto
basofilo
EPO TPO
Eritroblasto IL-11
Promielocita Promonocita
policromatofilo Megacariocita

Eritroblasto
ortocromatico
Mielocita
Reticolocita
Monocita Piastrine

Eritrocita Granulocita
MATURAZIONE 109

MEGACARIOCITARIA
Megacarioblasto

Promegacariocita
Megacariocita Piastrine
8N 16N 32N MO
MATURAZIONE 110

MEGACARIOCITARIA
CELLULA STAMINALE EMOPOIETICA 111

= HEMATOPOIETIC STEM CELL (HSC)


LA GERARCHIA DELLE CELLULE 112

EMOPOIETICHE
 Il compartimento delle cellule staminali è costituito da rare
cellule multipotenti (che sono in grado di differenziare in tutte le
cellule del sangue) e che possono automantenersi (generare
cellule identiche), [Capacità mitotiche limitate]

 Il processo denominato orientamento comporta la transizione


verso cellule denominate progenitori emopoietici che hanno la
capacità di differenziarsi verso una linea emopoietica. [Capacità
mitotica elevata]

 Le cellule riconoscibili nel midollo sono i precursori ; essi hanno


scarsa capacità di automantenersi ma elevatissima capacità
mitotica
HCS
113
HSC: 114

CARATTERISTICHE
HEMATOPOIETIC STEM CELL

• Undifferentiated cells

• Resides at specific sites (hematopoietic


niches)

• Robust proliferative ability

• Multipotent: capable of regenerating all


hematopoietic compartments (myeloid,
erythroid, megakariocytic, lymphoid)
HEMATOPOIETIC STEM CELL vs PROGENITOR CELL
HSC: 117

CARATTERISTICHE
È una cellula rara: nel midollo osseo murino sono stimate
essere presenti 1/10.000-1/100.000 cellule staminali per un
totale di 10.000-20.000 elementi.

In condizioni di omeostasi la maggior parte delle cellule


staminali sono in fase G0 del ciclo cellulare.

La quota di cellule staminali in ciclo aumenta in condizioni di


stress emopoietico.
118
LE CARATTERISTICHE DI STAMINALITÀ
SCEMANO CON IL PROCEDERE DELLA
DIFFERENZIAZIONE
LOOKING FOR HSC 119
SURFACE ANTIGENS
OF HSC and PROGENITORS
IDENTIFICATION OF HSC
By FLOW CYTOMETRY
• Surface markers utilized: CD34,
CD38, Lin, CD90, CD133
HSC ASSAYS 122
IN VITRO ASSAYS: COLTURE SEMISOLIDE DI 123
PROGENITORI EMOPOIETICI CLONOGENICI

 I progenitori emopoietici presenti nel sangue periferico e


nel midollo osseo umano, opportunamente seminati in
terreno semisolido (agar o metilcellulosa) con adeguati
fattori di crescita hanno la possibilità di moltiplicarsi
generando colonie;

 Questi progenitori sono chiamati CFU "colony-forming


units" (unità formanti colonie) oppure BFU-E "burst-forming
units-Erythroid" (nel caso di alcuni progenitori eritroidi).
IN VITRO ASSAYS: COLTURE SEMISOLIDE DI 124
PROGENITORI EMOPOIETICI CLONOGENICI

nutrients

medium CSF’s lineage specific

Interleukins
colonies(CFU’s): test cells
Blast, GEMM, GM
G,M,Meg, E,BFU etc
COLTURE SEMISOLIDE DI 125

PROGENITORI EMOPOIETICI
CLONOGENICI
a) CFU-GEMM (colony-forming unit-granulocyte, erythroid,
macrophage, megakaryocyte) o cellula formante colonie miste.
Sono progenitori clonogenici capaci di dare origine a colonie formate
da cellule mature di diverse linee (granulopoietiche ed eritropoietiche)
dopo circa 18-20 giorni di incubazione;

b) CFU-GM (colony-forming unit-granulocyte, macrofage) o cellula


formante colonie granulomonocitiche. Sono progenitori clonogenici
capaci di dare origine a colonie contenenti almeno 20 granulociti e/o
macrofagi maturi (alcuni laboratori usano un valore soglia minimo di
40-50 cellule) dopo circa due settimane;
CFU-GEMM 126
CFU-GM 127
128

GRANULOCYTE MACROPHAGE
COLONIES CFU-G COLONIES CFU-M
COLTURE SEMISOLIDE DI 129

PROGENITORI EMOPOIETICI
CLONOGENICI
c) BFU-E ( burst-forming unit-erythroid) o cellula che forma grandi
colonie eritroidi.
Sono progenitori eritroidi che posseggono una maggiore capacità
proliferativa rispetto alle CFU-E e quindi danno origine a colonie più
grandi formate da molti clusters;

d) CFU-E (colony-forming unit-erythroid) o cellula che forma piccole


colonie eritroidi.
Sono progenitori eritroidi capaci di dare origine a 1 o al massimo a 2
clusters per un totale di non più di 100 eritroblasti. Ogni cluster, per
convenzione, per essere contato dovrebbe contenere almeno 8
cellule. Le CFU-E raggiungono il massimo numero dopo 10-12
giorni di incubazione.
BFU- 130

E
131

RED CELL ‘BURSTS’ RED CELL


COLONIES CFU-E
BFU-E
ASSAY IN VIVO: MODELLO UMANO 132

DI XENOTRAPIANTO
NICHE 133
NICHE 134
NICHE 135

NICCHIE OSTEOBLASTICHE: mantengono


la quiescenza a lungo termine delle cellule
staminali e il self renewal

NICCHIE VASCOLARI: inducono l’ingresso


della cellula staminale nel ciclo cellulare, la
proliferazione, la differenziazione in elementi
maturi e l’ingresso nella circolazione ematica
IL MICROAMBIENTE EMOPOIETICO 136

Il microambiente è composto da cellule mesenchimali


ed emopoietiche che forniscono un supporto fisico e
biochimico all’emopoiesi:
- Superficie cellulare
- Matrice extracellulare
- Fattori solubili
- in concerto sono responsabili della regolazione
della proliferazione, quiescenza, differenziazione,
reclutamento ed accumulo delle cellule staminali e
dei progenitori emopoietici.
MICROAMBIENTE MIDOLLARE 137

Fibroblasti, mio-fibroblasti, adipociti, osteoblasti, cellule


endoteliali e macrofagi

Citochine solubili

Cellula staminale

Citochine di membrana Macrofago


Fibroblasti

Osteoblasti Cellula endoteliale Trabecola ossea


ANTIGENI DI SUPERFICIE DELLA 138

CELLULA STAMINALE

Sca-1+ Lin- Sca-1+ Lin-

CD34-/lo CD34+ C-kit+


C-kit+

True stem cells Low self renewel


Long term Multilineage Progenitors
repopulation
REGOLAZIONE DELL’EMOPOIESI 139

L’ematopoiesi è regolata a diversi livelli:


Le cellule emopoietiche hanno capacità maturativa
intrinseca;
Il microambiente svolge un ruolo importante.
FATTORI COINVOLTI NELLA 140

INTERAZIONE MICROAMBIENTE-
CELLULA
FATTORI STAMINALE FATTORI
CELLULARI: SOLUBILI:

SC
HSC
SCF c-kit BMP

Jagged1 Notch Wnt

Ang1 Tie-2 Hedgehog

Cadherin βcatenin IL3

VCAM integrin IL6

Osteopentin βintegrin TPO


PTH
Hematopoietic stem cell niches
I FATTORI DI CRESCITA EMOPOIETICI 142

Controllano la differenziazione e moltiplicazione giornaliera


delle cellule staminali

Molti vengono chiamati CSF (Colony-stimulating factors)


perché necessari, in vitro, allo sviluppo delle colonie
progenitrici dalle cellule multipotenti

Agiscono anche sulle cellule mature (leucociti) in risposta a


stimoli infiammatori e infettivi

Sono prodotti da: linfociti, monociti, macrofagi, cellule


endoteliali e fibroblasti.
CSF, HGF E IL 143

Il termine Colony Stimulating Factor (CSF) è un termine


generico utilizzato per indicare sostanze ormonali capaci di
stimolare la crescita di colonie ematopoietiche in vitro;
Il termine fattore di crescita ematopoietico indica uno specifico
ormone capace di agire in vivo (trombopoietina,
eritropoietina);
Il termine Interleukina (IL), originariamente indicava molecole
che erano necessarie per le interazioni fra cellule del sistema
immunitario. Oggi con questo termine si indica una classe di
molecole attive nell’emopoiesi e nella risposta immune.
I fattori di crescita ematopoietici e le ILs appartengono al
gruppo delle citochine
LE CITOCHINE 144

Le citochine sono piccole molecole proteiche prodotte


da vari tipi di cellule e secrete nel mezzo circostante di
solito in risposta ad uno stimolo, ed in grado di
modificare il comportamento di altre cellule inducendo
nuove attività come crescita, differenziamento,
migrazione e morte.
LE CITOCHINE 145

Legano specifici recettori sulla superficie cellulare.


La loro azione di solito è locale: possono quindi avere un effetto autocrino
(modificando il comportamento della stessa cellula che l'ha secreta), o
paracrino (modificano il comportamento di cellule adiacenti); talvolta hanno
un effetto a distanza e agiscono in modo endocrino, modificando cioè il
comportamento di cellule distanti dalle cellule che le producono.

Funzionalmente distinguiamo:

 EMATOPOIETINE, che include diversi fattori di crescita, tra cui


l’eritropoietina (Epo) e varie interleuchine;
 famiglia dei TNF (tumor necrosis factor), tra cui il TNFa;
 famiglia delle CHEMOCHINE, tra cui MIP-1α e RANTES, importanti nel
controllo del virus dell’ HIV;
 INTERFERONI.
JAK/STAT 146
PATHWAY G-CSFR G-CSF
GM-CSF
GM-CSFR
TPOR TPO
EPOR EPO

JAK2 è TK “chiave” per JAK2 JAK2


almeno 20 recettori della P P Y1007
“superfamily” dei recettori
dei fattori di crescita
emopoietici STAT STAT
RAS PI3K
RAF
AKT
MEK STAT
mTOR
MAPK

STAT
147
148
149

rhG-CSF rhGM-CSF

• Filgrastim • Sargramostim

• Lenograstim • Molgramostim

• PEG-Filgrastim
ERITROPOIETINA 151
1906: Fattore umorale associato a 1985: Clonaggio del gene di
produzione di eritrociti hu EPO e sintesi di rhuEPO

1987: prova dell’efficacia


terapeutica di rhu EPO

Carnot P, Deflandre C. Jacobs et al., Nature 1985


CR Acad Sci Paris 1906;143:384–6 Lin et al., PNAS 1985

• glicoproteina, 30.4 kD, altamente glicosilata


• 3 catene N-glicosidiche
• fino a 14 residui di a. sialico
• glicosilazione essenziale per attività biologica
• EPO e rhEPO: differenti pattern di glicosilazione
• emivita in pz. neoplastici: 20 h
RUOLO FISIOLOGICO DI
152
ERITROPOIETINA
Ridotto apporto di ossigeno ai reni

Cellule peritubulari interstiziali rilevano


bassi livelli di ossigeno nel sangue

I proeritroblasti midollari
maturano più rapidamente a
Cellule peritubulari interstiziali reticolociti
secernono eritropoietina (EPO) nel
sangue

EPO
Più reticolociti entrano
in circolo
Aumentato apporto di ossigeno ai tessuti

Aumentato numero di GRC in circolo


Ritorno all’omeostasi quando la risposta normalizza
l’apporto di ossigeno ai reni
EPO-R: TRASDUZIONE DEL SEGNALE 153

1. Legame di EPO attiva fosforilazione di JAK2


2. JAK2 si autofosforila
3. JAK2 fosforila EPO-R
4. EPO-R fosforilato espone docking sites per dominio SHG2 di STAT-5
5. STAT-5 fosforilato trasloca al nucleo ed attiva la trascrizione di geni
target
RECETTORI EPO/CELLULA 154

e-BFU-E < 100

l-BFU-E 100

CFU-E/proeritroblasti 1000
eritroblasti 100-200
reticolociti 0
TPO 155

Ligand for c-Mpl


60 - 70 kDa glycosylated polypeptide
332 amino acids
Synthetised mainly by liver
Negatively regulated by
- Platelet count
- Megacaryocyte mass
TPO 156

Two mechanisms:
 TPO is constitutively expressed in the liver;
 Plasma TPO levels are determined by the total body mass of c-Mpl
receptors present on platelets and megakaryocytes;
 These receptors bind and internalize the cytokine;
 Thus, there is an inverse relationship between TPO levels and the
platelet/megakaryocyte mass;
 TPO expression in the liver is upregulated by IL-6 to cause inflammatory
thrombocytosis.
157

TPO dependance

Megacarioblasto Promegacariocita Megacariocita


PRODUCT HISTORY: TPO RECEPTOR 158

AGONISTS

Two prior therapeutic protein products:


Recombinant human TPO, identical amino acid acid structure to full-
length endogenous TPO
Pegylated human recombinant megakaryocyte growth and development
factor (PEG-MDGDF), truncated TPO, contains the first 163 amino acid
residues coupled to polyethylene glycol ;
Sustained thrombocytopenia, associated with immunogenic responses that
cross-reacted with TPO, in some healthy subjects receiving PEG-MGDF;
Development of both products was discontinued, despite evidence that this
class of products promoted platelet production in humans;
Ongoing effort to develop TPO receptor agonists that do not induce
immunogenic responses that cross-react with endogenous TPO.
ROMIPLOSTIM: A NEW TPO AGONIST 159

• A homodimer of 59kD single-chain subunits


• Each subunit consists of a human IgG1 Fc domain, linked at its
C-terminus to a peptide chain containing two thrombopoietin
receptor binding domains; termed a “Peptibody”
• Receptor binding domain has no homology with TPO
ROMIPLOSTIM: MECHANISM OF 160

ACTION
romiplostim

TPO Receptor
(Mpl)

JAK2 TYK2
S S
T T
A A
T T
5 5
Cell membrane

•Romiplostim:
• Higher binding affinity than human TPO
• Displaces TPO on human platelets
• Increases megakaryocyte colony formation in vitro
• Leads to TPO receptor, JAK2 , Stat5 phosphorylation
ELTROMBOPAG: A TPO AGONIST 161

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