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DIPARTIMENTO DI PATOLOGIA ANIMALE, IGIENE E SANIT PUBBLICA VETERINARIA SEZIONE DI BIOCHIMICA E FISIOLOGIA VETERINARIA
Figura 2
propria massa. Alla fine di questa regione un rivelatore produce dei segnali ogni volta che un gruppo di ioni lo colpisce; la registrazione di questi segnali in funzione del tempo uno spettro di massa TOF. In pratica, come descritto in dettaglio in un paragrafo successivo, il TEMPO DI VOLO, ossia il tempo impiegato tra il punto di partenza ed il punto di arrivo (comuni a tutti gli ioni) proporzionale a (m/z) 1/2 di ciascuno degli ioni stessi e pu, quindi, essere usato per calcolare la massa degli ioni. Lanalisi del tempo di volo pu essere condotta mediante due modalit: LINEAR e REFLECTRON (Figure 3 e 4).
SORGENTE
ANALIZZATORE ANALIZZATORE
Figura 3: Analisi in modalit LINEAR. Uacc = potenziale di accellerazione; DRIFT REGION = tubo di volo
SORGENTE
ANALIZZATORE
In pratica, in entrambe le modalit, gli ioni formati nella sorgente, che hanno tutti la stessa carica (z = +1), ma differenti masse, e quindi differenti (m/z), sono accelerati con velocit diverse e, dopo avere attraversato la regione di volo (DRIFT REGION) colpiscono il detector in tempi diversi. Agli ioni di una determinata massa normalmente associato un certo range di energia, si hanno cio ioni della stessa massa con velocit di accelerazione non perfettamente identiche, ma distribuite in un certo intervallo di valori. Tanto pi allargato tale intervallo, tanto pi si hanno picchi segnale allargati e poco risolti.
Utilizzando un reflectron (che in pratica assimilabile ad uno specchio di potenziali elettrici) possibile compensare linfluenza della distribuzione di energia sul tempo di volo. Si ottiene cos un dato migliore e picchi molto pi stretti e risolti (fino ad un limite massimo di m/z di circa 5000). Gli strumenti attualmente sono in grado di operare sia in modalit linear (regione di volo uguale a 1.5 m) per lanalisi di pesi molecolari 5000 Da circa ed in modalit reflectron (regione di volo uguale a 3 m) per analisi ottimale di masse 5000 Da.
dallequazione (1), il tempo di volo di uno ione puo essere determinato come segue: t = s/v = ( s2 /2 e U )1/2 ( m/z ) 1/2 (2)
Risistemando la (2) si puo ottenere la seguente rela zione esistente tra m/z ed il tempo t: ( m/z )1/2 = ( 2 e U/s2 ) 1/2 t (3)
Se il tempo zero determinato dal segnale di sgancio (avviato mediante limpulso laser) e se gli ioni iniziano a volare nello stesso istante, si trova la seguente relazione: ( m/z )1/2 = a1 t (4)
Il procedimento di calibrazione, quindi, permette di definire il coefficiente a1 mediante limpiego dei valori TOF misurati per almeno due componenti (punti dicalibrazione) con valori di m/z noti e differenti tra loro. Ci ottenuto durante il processo di calibrazione che pu essere esterno o, pi raramente, interno. La calibrazione esterna ottenuta analizzando una miscela di sostanze di massa molecolare nota e simile a quella ipotizzabile per i(l) campioni(e) di interesse, utilizzando le medesime condizioni (voltaggio, modalit ecc.) che verranno poi utilizzate per lanalisi del campione. Le miscele standard variano quindi a seconda del tipo di campione da analizzare. Di seguito sono riportate le miscele (ed i relativi spettri di massa) utilizzate nel caso di analisi di peptidi di massa molecolare compresa tra circa 800 e circa 4000 Da e nel caso di proteine di massa molecolare compresa tra circa 20.000 e circa 80.000 Da. La calibrazione interna, usata pi raramente, prevede che nel campione analizzato ci siano, oltre a sostanze ignote, almeno due componenti di cui certamente noto il peso molecolare. Questi componento vengono quindi utilizzati per la calibrare lanalisi secondo quanto descritto in precedenza. La calibrazione interna sarebbe potenzialmente pi precisa ma, per diverse ragioni tecniche, non quasi mai applicabile. Comunque, come dettagliato successivamente, la precisione raggiunta con la calibrazione esterna normalmente pi che sufficiente al fine di ottenere analisi estremamente accurate. Tabella 1: Miscela di peptidi standard utilizzata per la calibrazione esterna dello strumento per lanalisi di peptidi in modalit reflectron: [M+H]+monoisotopico 1046.5420 1296.6853 1347.7361 1619.8230 2093.0868 2465.1990 3147.4714
SOSTANZA Angiotensina II Angiotensina I Sostanza P Bombesina ACTH frammento (1-17) ACTH frammento (18-39) Somatostatina 28
La Figura 5 mostra lo spettro di massa relativo a questa miscela, da cui si pu osservare che presente un picco [M+H]+ per ciascun componente
m/z
Tabella 2: Miscela di proteine standard utilizzata per la calibrazione esterna dello strumento per lanalisi di proteine in modalit linear.
Albumina-Bovina [M+H] +
66,431
La Figura 6 mostra lo spettro di massa relativo a questa miscela di proteine standard. Si noti che per lalbumina oltre al segnale atteso per la forma [M+H]+ a circa 66.000, si ha un segnale a m/z circa 33.000, corrispondente alla forma [M+2H]2+, che, avendo z = +2, mostra una m apparente che la met di quella calcolata per lalbumina
m/z
Risoluzione > 5000 (con frammento ACTH 18-39); Accuratezza : 78 ppm con sostanza P, 95 ppm con citocromo c.
Modalit reflectron :
Risoluzione > 25000 con somatostatina, >1100 con citocromo c; Accuratezza: 45 ppm con sostanza P, 100 ppm con citocromo c.
Di seguito sono presentati a titolo di esempio due spettri di massa ottenuti rispettivamente (1) da una proteina di recente purificazione di cui si voluto determinare il peso molecolare e (2) dalla analisi di una miscela triptica di una proteina isolata da elettroforesi bidimensionale (seguendo le diverse metodiche descritte nei vari capitoli precedenti) ed identificata per confronto con informazioni presenti in Banche Dati secondo quanto descritto nel capitolo successivo) .
m/z m/z
La Figura 7 mostra lo spettro di massa di una proteina ricombinante, la GTS di M. tuberculosis espressa in E. coli, ottenuta in modalit linear. Lesperimento serviva a verificare se il prodotto ottenuto mediante la tecnologia ricombinante corrispondeva a quanto atteso in base al cDNA codificante la proteina. Si notano nettamente due picchi; il maggiore, corrispondente alla forma [M+H]+ con z = +1, con massa di 53739.69, laltro corrispondente alla stessa molecola ma con z = +2 (ossia la forma [M+2H]+2). Nel caso specifico qui riportato, la massa attesa dalla sequenza del gene era di 53732, quindi laccuratezza di 143 ppm.
Figura 8 Spettro di massa del digerito triptico di una proteina isolata mediante elettroforesi bidimensionale (per lanalisi di questo dato, vedi capitolo successivo)
m/z