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Tecniche elettroforetiche

Applicazione:
Proteolisi limitata

PRINCIPI GENERALI
Elettroforesi:
Migrazione di particelle cariche sotto lazione
di un campo elettrico

Il campo elettrico generato applicando una differenza di potenziale V


tramite due elettrodi posti ad una distanza d. Il campo elettrico dato da

E = V/d
La forza che agisce sulla molecola di carica q uguale a Eq.
La velocit della particella data da:

V = Eq / f
f il coefficiente frizionale = 6prp

La mobilit elettroforetica
La mobilit elettroforetica (m) di uno ione data da v/E ossia dal rapporto
tra la velocit dello ione e lintensit del campo elettrico
Quando si applica una differenza di potenziale molecole con carica totale
diversa si separano in base alla diversa mobilit elettroforetica.
Molecole con carica uguale si separano in base alle diverse dimensioni.

Legge di Ohm
Dissipazione della potenza sviluppata

V/I=R

V = voltaggio
I = intensit di corrente
R = resistenza

Nella soluzione tra gli elettrodi la corrente viene principalmente trasportata


dagli ioni del tampone. Gli ioni del campione ne conducono solo una piccola
parte
Potenza sviluppata

W = I2 R

La maggior parte di questa potenza vene dissipata sotto forma di calore

Effetti del calore sulla separazione


elettroforetica

Laumento della tempertura nella cella elettroforetica provoca


una diminuzione della resistenza e questo effetto dipende,
almeno in parte, da un aumento della mobilit ionica
dovuto a una diminuzione di viscosit e quindi dell'attrito
esercitato dal liquido rispetto al movimento degli ioni.
Il riscaldamento provocher, inoltre, evaporazione del
solvente dal supporto e quindi diminuzione della resistenza,
ma anche migrazione pi lenta del campione per l'aumento di
concentrazione.

Strumentazione
L'apparecchiatura per l'elettroforesi composta,
fondamentalmente da due parti: un alimentatore e una
cella elettroforetica .

L'alimentatore fornisce un flusso di corrente continua agli elettrodi


applicati alla cella elettroforetica e pertanto i cationi migrano verso il
catodo (-) e gli anioni verso l'anodo (+)

Schema di una camera elettroforetica


Perch l'elettroforesi abbia luogo, il
campione va sciolto in un tampone, col
quale va inoltre saturato l'eventuale
supporto per consentire la conduzione della
corrente. Il tampone serve, inoltre, per
mantenere costante lo stato di ionizzazione
delle molecole da separare, la cui carica
cambia con il pH, soprattutto nel caso di ioni
dipolari.

Durante l'elettrolisi, al catodo si


producono ioni ossidrile e idrogeno,
mentre all'anodo si producano ioni
idrogeno e ossigeno.

al catodo:

2e-+ 2H2O 2OH- + H2

all'anodo:

H2O 2H+ + O2 + 2e

Gli ioni ossidrile, prodotti al catodo, aumentano la dissociazione del componente acido debole (HA)
della miscela tampone e ci provoca un aumento della formazione di A- che conduce corrente
all'anodo. Qui gli ioni A- si combinano con gli ioni H+ per riformare HA e vengano forniti elettroni al
circuito elettrico.

Il campione
La velocit di migrazione aumenta all'aumentare della
carica netta del campione. La grandezza della carica
dipende, generalmente, dal pH, in base a quanto stabilito
dell'equazione di Henderson-Hasselbalch.
La velocit di migrazione diminuisce all'aumentare del
peso molecolare e questo perch aumentano le forze
frizionali ed elettrostatiche rispetto al mezzo circostante.
Molecole di dimensioni simili ma di forma diversa (ad
esempio proteine fibrose e proteine globulari) mostrano
differenti caratteristiche di migrazione a causa del diverso
effetto delle forze frizionali ed elettrostatiche.

Il tampone
Il tampone determina e stabilizza il pH del mezzo di supporto e
influenza anche la velocit di migrazione dei componenti del campione.
I tamponi d uso comune sono il formiato, l'acetato, il citrato, il
fosfato, il Tris, l'EDTA.
Il tampone non deve legarsi ai composti da separare, perch ne
altererebbe la velocit di migrazione.
Il tampone agisce come solvente del campione e quindi una certa
diffusione inevitabile, soprattutto nel caso di molecole piccole, come
aminoacidi e zuccheri. Il grado di diffusione pu essere ridotto evitando
un sovraccarico di campione, applicandolo in bande mollo strette,
usando un'alta tensione per il tempo pi breve possibile e rimuovendo
e fissando rapidamente il supporlo al termine della corsa.

Concentrazione del tampone


All'aumentare della forza ionica del tampone la quota di corrente
trasportata dal tampone aumenta mentre diminuisce la quota di
corrente trasportata dal campione che abbassa, cos, la sua velocit di
migrazione.
Inoltre un'elevata forza ionica del tampone incrementa la corrente
totale e quindi la produzione di calore.
Viceversa a bassa forza ionica la quota di corrente trasportata dal
tampone diminuisce e aumenta la quota di corrente trasportata dal
campione che incrementa, cos, la sua velocit d migrazione.
Una bassa forza ionica del tampone riduce la corrente totale e
determina quindi una minor produzione di calore. Tuttavia la diffusione
e la conseguente perdita di risoluzione sono maggiori.
Perci la scelta della forza ionica dovr, in sostanza, rappresentare un
compromesso tra questi due estremi: essa infatti normalmente
compresa tra 0,05 e 0,10 M.

Il materiale di supporto
Ha la funzione di stabilizzare il mezzo in cui avviene la separazione elettroforetica
Il mezzo di supporto elimina le correnti convettive e la diffusione in modo che i
componenti rimangano concentrati in bande strette

Cellulosa
Acetato di cellulosa
Silice (gel)

Amido (gel)
Agarosio (gel): DNA
poliacrilamide (gel)
Sephadex (gel)

Lelettroendosmosi
Durante la corsa elettroforetica si pu assistere all'insorgenza di un
fenomeno chiamato elettro-endosmosi che la conseguenza di una
differenza di carica tra le molecole di acqua del tampone e la
superficie del mezzo di supporto. Ci genera una forza motrice che
provoca il movimento verso il catodo degli ioni ossonio del tampone
che, per un effetto di trascinamento del solvente, portano con s
anche molecole prive di carica. Questo fenomeno accelera il
movimento dei cationi e ritarda quello degli anioni essendo contrario
alla loro migrazione

Gel di Poliacrilammide (PAGE)


Vengono preparati per polimerizzazione di un monomero di acrilammide in
presenza di N,N-metilenbisacrilammide: si formano legami crociati

Polimerizzazione dellacrilammide
La polimerizzazione di tipo testa-coda, dando luogo a catene in cui linserimento
occasionale di bis-acrilammide fa s che venga introdotto un nuovo di attacco per
lestensione della catena: catalisi radicalica.

Linizatore della polimerizzazione lammonio


persolfato. Il TEMED (N,N,N,Ntetrametilendiammina) catalizza la
decomposizione dello ione persolfato con
formazione di un radicale libero
R + M
RM + M

RM

RMM

Elettroforesi di proteine: SDS-PAGE


E una elettroforesi in condizioni denaturanti

SDS = sodio dodecil solfato

CH3-(CH2)10-CH2OSO3-Na+

I campioni vengono bolliti per 5 minuti in un tampone (sample buffer)


contenente SDS e b-mercaptoetanolo: vengono ridotti i ponti disolfuro e la
proteina viene denaturata. Il tampone contiene blu di bromofenolo, usato
come tracciante, e saccarosio o glicerolo per aumentare la densit

LSDS si lega alle proteine con lo stesso rapporto: una molecola di SDS
ogni due residui aminoacidici, (1,4:1 g)
Le proteine hanno tutte lo stesso rapporto carica/massa

Stacking gel e Running gel


Le proteine vengono separate nel gel di separazione (running gel), di
appropriata concentrazione di acrilammide (15-30 %) dove migrano in
base alla differenza di massa molecolare relativa.

Esse vengono caricate in un gel di impaccamento (stacking gel) posto al di


sopra del running gel, alto poco pi di 1 cm, a bassa percentuale di acrilammide
(5-6 %)
Il gel di impaccamento serve a concentrare il campione in una banda sottile
prima che entri nel gel di separazione.

Funzione dello stacking gel


Quando si applica il campo elettrico gli ioni presenti nei campioni iniziano
a muoversi: nel gel di impaccamento, ad un pH 6.7, gli ioni cloruro
tendono a muoversi molto velocemente, seguiti dai complessi proteinaSDS mentre la glicina, essendo al suo punto isoelettrico, praticamente
ferma. La glicina si oppone quindi alla corsa dei Cl - e del complesso; per
mantenere il circuito, le proteine, che sono in concentrazione molare
molto pi bassa rispetto agli ioni Cl - , tendono a concentrarsi in un volume
molto piccolo e nel gel si osserva proprio la formazione di una strato molto
sottile e molto concentrato al limite tra gel di impaccamento e gel di corsa.
Questo impaccamento iniziale serve a rendere migliore la separazione.
Quando la glicina entra nel gel di separazione a pH 8,9 il complesso inizia
la sua corsa e si separa in base al suo peso molecolare grazie alla
propriet di setaccio molecolare del gel di acrilamide.

Colorazione e decolorazione del gel


Il colorante generalmente usato il trimetilamino solfato Comassie brilliant Blue:
Viene usato allo 0,1% in metanolo, acqua e acido acetico glaciale. Il colorante
fissa le proteine nel gel.
Quindi il gel viene lavato in una soluzione decolorante che porta via il colorante
che non si legato alle proteine, lasciando le proteine visibili come bande blu

Determinazione della massa


molecolare di proteine
Scelta della giusta concentrazione del gel di poliacrilammide: per proteine di Mr tra
10000 e 100000 si utilizzano concentrazioni pari a circa 15 %,
Per proteine di Mr sopra a 100000 si devono utilizzare concentrazioni pi basse di
poliacrilammide (7,5-10%) in modo da far penetrare le proteine nel gel.

Si usano proteine a peso molecolare noto


per costruire una retta di calibrazione.
Log(Mr) vs mobilit relativa

Controllo delle fasi di purificazione

Elettroforesi in condizioni native


Non c SDS, le proteine non vengono denaturate!!
Le proteine vengono separate in base alla carica nativa al pH del gel (di solito
8,7) e in base alle propriet di setaccio molecolare del gel, si usano basse
conentrazioni di poliacrilammide (7,6%) .
Isoelettrofocusing. Questa tecnica dotata di un elevatissimo potere
risolutivo ed impiegata per la separazione di composti anfoteri, ad esempio
amminoacidi e peptidi, e in particolare di isoenzimi: infatti sufficiente una
differenza in punti isoelettrici di sole 0,01 unit di pH per ottenere una
separazione apprezzabile.
Aminoacidi e peptidi anfoteri sono separati in un campo elettrico lungo il quale
vi un gradiente sia di potenziale sia di pH

Elettroforesi bidimensionale su gel di


poliacrilammide
E una tecnica che combina
lisoelettrofocalizzazione (IEF)
con la SDS-PAGE

Si ha la separazione sia in base


al pI delle proteine che in base
alla loro massa molecolare
relativa

Elettroforesi bidimensionale
Permette di risolvere tra le 5000 10000 proteine da un patrimonio di circa
10000-20000 proteine che pu esprimere una cellula
PROTEOMA = Proteine espresse da un genoma

Isoelettrofocalizzazione: viene eseguita in tubi


stretti (1-2 mm diametro) contenenti gel di poliacrilammide, anfoliti,
urea e un detergente non ionico

Separa le proteine in base al loro pI, che pu variare anche solo 0.01
unit di pH.
Anfoliti = acidi poliammino-policarbossilici sintetici

Relazione carica netta/pH di una


proteina

Isoelettrofocalizzazione in gradienti di
pH immobilizzati
Il sistema utilizza una serie di derivati di acrilammide

(Immobiline) aventi la struttura

O
generale CH2=CH-C-NH-R dove R contiene sia gruppi
carbossilici che amminici. La copolimerizzazione di questi
monomeri con diverso pKa in diversa concentrazione permette
di creare dei gradienti preformati di pH all'interno del gel.

IPG Immobilized pH gradient


Si formano partendo da
due soluzioni di
acrilammide, a cui
attaccato il gruppo R
tamponante, a diverso pH.
Quindi si forma il gradiente
di pH che polimerizza
formando una matrice di
poliacrilammide a cui sono
attaccati i gruppi
tamponanti R

La seconda dimensione
Dopo lIEF, il gel viene recuperato dal tubo, incubato con un tampone
contenente SDS e quindi viene caricato nel gel contenente SDS
La separazione avviene quindi in base alle dimensioni

Applicazioni della 2D-PAGE


Mappatura delle proteine realmente espresse in un tessuto (modificazioni
post-traduzionali)
I dati ottenibili dalla 2D-PAGE sono molti e complessi
Software dedicati allanalisi dei dati
Possibilit di confrontare due gel 2D
Costruzione di database di espressione proteica di vari tipi di tessuto e cellule
Risposta dellespressione di proteine da parte della cellula a vari trattamenti
(farmaci, ormoni, tossine)

Caratterizzazione delle proteine


separate

Sequenziamento proteico diretto della macchia tramite degradazione di Edman


analizzatore automatico

Profili di masse peptidiche tramite spettrometria di massa

Determinazione della sequenza tramite spettrometria di massa


Ricerca di sequenze con SWISS-PROT

Western blotting
Questo sistema permette di trasferire macromolecole da un gel in cui sia
avvenuta la separazione elettroforetica ad una membrana immobilizzante
(nitrocellulosa o PVDF (PolyVinylDiFluoride))
Le proteine devono trasferirsi dal
gel alla membrana mantenendo la
forma e il livello di diffusione
acquisiti alla fine della prima
separazione elettroforetica.

elettroblotting
Sandwich di gel e nitrocellulosa
Compresso tra due fogli di plastica rigidi
Immerso in un tampone
Tra due elettrodi paralleli

Analisi del blot: Si sfrutta linterazione specifica di


una proteina con un anticorpo

Prima di trattare la membrana con lanticorpo essa viene incubata con una
soluzione proteica di BSA al 10% per bloccare i siti della membrana che
possono ancora dare interazioni idrofobiche.

Incubazione del blot con un


anticorpo primario
Incubazione con un anticorpo
secondario coniugato con un
enzima

Rivelazione della perossidasi con ECL


(Enhanced ChemiLuminescence)
La perossidasi ossida il substrato luminolo in presenza di H2O2 producendo
luce che va ad impressionare una lastra fotografica