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Applicazione:
Proteolisi limitata
PRINCIPI GENERALI
Elettroforesi:
Migrazione di particelle cariche sotto lazione
di un campo elettrico
E = V/d
La forza che agisce sulla molecola di carica q uguale a Eq.
La velocit della particella data da:
V = Eq / f
f il coefficiente frizionale = 6prp
La mobilit elettroforetica
La mobilit elettroforetica (m) di uno ione data da v/E ossia dal rapporto
tra la velocit dello ione e lintensit del campo elettrico
Quando si applica una differenza di potenziale molecole con carica totale
diversa si separano in base alla diversa mobilit elettroforetica.
Molecole con carica uguale si separano in base alle diverse dimensioni.
Legge di Ohm
Dissipazione della potenza sviluppata
V/I=R
V = voltaggio
I = intensit di corrente
R = resistenza
W = I2 R
Strumentazione
L'apparecchiatura per l'elettroforesi composta,
fondamentalmente da due parti: un alimentatore e una
cella elettroforetica .
al catodo:
all'anodo:
H2O 2H+ + O2 + 2e
Gli ioni ossidrile, prodotti al catodo, aumentano la dissociazione del componente acido debole (HA)
della miscela tampone e ci provoca un aumento della formazione di A- che conduce corrente
all'anodo. Qui gli ioni A- si combinano con gli ioni H+ per riformare HA e vengano forniti elettroni al
circuito elettrico.
Il campione
La velocit di migrazione aumenta all'aumentare della
carica netta del campione. La grandezza della carica
dipende, generalmente, dal pH, in base a quanto stabilito
dell'equazione di Henderson-Hasselbalch.
La velocit di migrazione diminuisce all'aumentare del
peso molecolare e questo perch aumentano le forze
frizionali ed elettrostatiche rispetto al mezzo circostante.
Molecole di dimensioni simili ma di forma diversa (ad
esempio proteine fibrose e proteine globulari) mostrano
differenti caratteristiche di migrazione a causa del diverso
effetto delle forze frizionali ed elettrostatiche.
Il tampone
Il tampone determina e stabilizza il pH del mezzo di supporto e
influenza anche la velocit di migrazione dei componenti del campione.
I tamponi d uso comune sono il formiato, l'acetato, il citrato, il
fosfato, il Tris, l'EDTA.
Il tampone non deve legarsi ai composti da separare, perch ne
altererebbe la velocit di migrazione.
Il tampone agisce come solvente del campione e quindi una certa
diffusione inevitabile, soprattutto nel caso di molecole piccole, come
aminoacidi e zuccheri. Il grado di diffusione pu essere ridotto evitando
un sovraccarico di campione, applicandolo in bande mollo strette,
usando un'alta tensione per il tempo pi breve possibile e rimuovendo
e fissando rapidamente il supporlo al termine della corsa.
Il materiale di supporto
Ha la funzione di stabilizzare il mezzo in cui avviene la separazione elettroforetica
Il mezzo di supporto elimina le correnti convettive e la diffusione in modo che i
componenti rimangano concentrati in bande strette
Cellulosa
Acetato di cellulosa
Silice (gel)
Amido (gel)
Agarosio (gel): DNA
poliacrilamide (gel)
Sephadex (gel)
Lelettroendosmosi
Durante la corsa elettroforetica si pu assistere all'insorgenza di un
fenomeno chiamato elettro-endosmosi che la conseguenza di una
differenza di carica tra le molecole di acqua del tampone e la
superficie del mezzo di supporto. Ci genera una forza motrice che
provoca il movimento verso il catodo degli ioni ossonio del tampone
che, per un effetto di trascinamento del solvente, portano con s
anche molecole prive di carica. Questo fenomeno accelera il
movimento dei cationi e ritarda quello degli anioni essendo contrario
alla loro migrazione
Polimerizzazione dellacrilammide
La polimerizzazione di tipo testa-coda, dando luogo a catene in cui linserimento
occasionale di bis-acrilammide fa s che venga introdotto un nuovo di attacco per
lestensione della catena: catalisi radicalica.
RM
RMM
CH3-(CH2)10-CH2OSO3-Na+
LSDS si lega alle proteine con lo stesso rapporto: una molecola di SDS
ogni due residui aminoacidici, (1,4:1 g)
Le proteine hanno tutte lo stesso rapporto carica/massa
Elettroforesi bidimensionale
Permette di risolvere tra le 5000 10000 proteine da un patrimonio di circa
10000-20000 proteine che pu esprimere una cellula
PROTEOMA = Proteine espresse da un genoma
Separa le proteine in base al loro pI, che pu variare anche solo 0.01
unit di pH.
Anfoliti = acidi poliammino-policarbossilici sintetici
Isoelettrofocalizzazione in gradienti di
pH immobilizzati
Il sistema utilizza una serie di derivati di acrilammide
O
generale CH2=CH-C-NH-R dove R contiene sia gruppi
carbossilici che amminici. La copolimerizzazione di questi
monomeri con diverso pKa in diversa concentrazione permette
di creare dei gradienti preformati di pH all'interno del gel.
La seconda dimensione
Dopo lIEF, il gel viene recuperato dal tubo, incubato con un tampone
contenente SDS e quindi viene caricato nel gel contenente SDS
La separazione avviene quindi in base alle dimensioni
Western blotting
Questo sistema permette di trasferire macromolecole da un gel in cui sia
avvenuta la separazione elettroforetica ad una membrana immobilizzante
(nitrocellulosa o PVDF (PolyVinylDiFluoride))
Le proteine devono trasferirsi dal
gel alla membrana mantenendo la
forma e il livello di diffusione
acquisiti alla fine della prima
separazione elettroforetica.
elettroblotting
Sandwich di gel e nitrocellulosa
Compresso tra due fogli di plastica rigidi
Immerso in un tampone
Tra due elettrodi paralleli
Prima di trattare la membrana con lanticorpo essa viene incubata con una
soluzione proteica di BSA al 10% per bloccare i siti della membrana che
possono ancora dare interazioni idrofobiche.